CC BY
28
БИОЛОГИЯ
УДК 579.262
О ВКЛАДЕ АГРЕГАЦИИ КЛЕТОК И ЭКСТРАКЛЕТОЧНОЙ ДНК В ФОРМИРОВАНИЕ И СТАБИЛИЗАЦИЮ БИОПЛЕНОК БАКТЕРИЙ АЮБРттиМ ВИАЭИЕЫвЕ
Ю. А. Филипьечева, Е. М. Телешева, С. С. Евстигнеева, А. В. Шелудько, Е. Г. Пономарева, Л. П. Петрова, Е. И. Кацы
Филипьечева Юлия Анатольевна, кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории генетики микроорганизмов, Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, ljuche@yandex.ru
Телешева Елизавета Михайловна, аспирант, младший научный сотрудник лаборатории генетики микроорганизмов, Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, sentebrinka@mail.ru
Евстигнеева Стелла Сергеевна, младший научный сотрудник лаборатории генетики микроорганизмов, Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, stels20295@yandex.ru
Шелудько Андрей Вячеславович, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории генетики микроорганизмов, Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, shel71@yandex.ru
Пономарева Елена Геннадьевна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории микробиологии, Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, ponomareva_e@ibppm.ru
Петрова Лилия Петровна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории генетики микроорганизмов, Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, petrova_lp@mail.ru
Кацы Елена Ильинична, доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией генетики микроорганизмов, Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, ei_katsy@mail.ru
Имеется мало данных о функциях основных компонентов матрикса и роли разнообразных структур клеточной поверхности в образовании и стабилизации биопленок азоспирилл. Известно, что по сравнению со штаммом А. ЬгаэИепэе Sp245 его дефектные по сборке жгутиков мутанты по генам АЬВ, 1аЬв1 или ттэВ1 хуже формируют биопленки. В данной работе сравнивали агрегацию бактерий и формирование ими биопленок, действие ДНКазы на биопленки. Результаты исследований показали, что агрегация клеток в планктонной культуре обусловливает начальные этапы формирования биопленок, но не способствует приросту биомассы зрелых пленок, что наиболее очевидно в случае мутантов. Экстраклеточная ДНК является частью многокомпонентной системы, обеспечивающей сродство биопленок к поверхностям с разными физико-химическими свойствами и их структурную целостность.
Ключевые слова: АгоэртПит ЬгаэИепэе, агрегация бактерий, матрикс биопленок, экстраклеточная ДНК.
DOI: https://doi.oгq/10.18500/1816-9775-2018-18-4-399-406
© Фплппьечева Ю. А., Телешева Е. М., Евстигнеева С. С., Шелудько А. В., Пономарева Е. Г., Петрова Л. П., Кацы Е. И., 2018
Введение
Альфапротеобактерии Azospirillum brasilense обитают в разнообразных природных средах, в частности в фитосфере, и могут вступать в ассоциативное взаимодействие с широким кругом растений [1]. Определенное значение для успешного функционирования растительно-микробной ассоциации может иметь способность азоспи-рилл формировать биопленки - сообщества бактерий, внедренных в толстый слизистый слой матрикса [2]. Информация о микроструктуре биопленок азоспирилл, в частности о морфологии клеток, интегрированных в биопленку, и основных компонентах матрикса (внеклеточные полисахариды, белки и ДНК) фрагментарна, но необходима для понимания механизмов формирования и дисперсии биопленок, подбора способов управления данными процессами. Так, дефекты в образовании полярного жгутика (Fla), липополисахаридов (ЛПС) и полисахаридов, связывающих калькофлуор, оказывают заметное влияние на эффективность формирования биопленок соответствующих мутантов штамма A. brasilense Sp245 [3-5]. Сохранение Fla на клетках A. brasilense Sp245, интегрированных в зрелую биопленку, способствует поддержанию ее целостности и повышает ее устойчивость в условиях гидродинамического сдвига [4]. Отличные от жгутиков белковые компоненты поверхности азоспирилл, чувствительные к действию проназы и трипсина, необходимы для прочного соединения бактерий в биопленках и вносят вклад в прикрепление биопленок к субстрату [6].
Биопленки многих микроорганизмов также содержат в составе матрикса экстраклеточную ДНК (эДНК) [7]. Считается, что эДНК - это компонент матрикса, освобождающийся в связи с лизисом клеток, однако для некоторых бактерий показано участие эДНК в процессе агрегации клеток [8]. Например, это справедливо для бактерий рода Rhodovulum, способных к самоосаждению [9]. Внеклеточные ДНК являются компонентами матрикса биопленок A. brasilense [10]. Участие этих компонентов в организации архитектуры пленок азоспирилл остается неясным. В планктонной культуре флокуляция бактерий, опосредованная компонентами клеточной поверхности, характерна для азоспирилл [5, 11, 12], однако взаимосвязь процессов агрегации клеток и формирования биопленок у этих микробов не исследована.
Поскольку формирование и устойчивость микроструктуры биомассы биопленок азоспи-рилл обусловлены в том числе и компонентами их клеточной поверхности, мутанты, лишенные
жгутиков, являются удобной моделью для изучения функциональной роли компонентов матрикса бактериальных биопленок. В данном аспекте интересны мутант Sp245 по гену flhB1 (кодирует компонент экспортной жгутиковой поры) и мутанты Sp245 по предполагаемым генам 3-гидроксиизобутиратдегидрогеназы (mmsB1) и 3-оксоацил-[ацил-переносящий белок]-редуктазы fabG1). Эти мутанты имеют дефекты в образовании латеральных жгутиков (Laf) и/ или Fla и соответственно в роении и активном плавании [13, 14]. Инактивация предполагаемых генов fabG1 или mmsB1 также повлияла на такие характеристики бактерий, как относительное содержание ряда жирных кислот в препаратах ЛПС и гидрофобность планктонных клеток [5].
Целью данной работы явилось исследование значения агрегации клеток и эДНК для стабилизации биопленок азоспирилл.
Материалы и методы
Бактериальные штаммы. В работе использовали штамм A. brasilense Sp245, выделенный из корней пшеницы [15], и его инсерционные KmR Fla- Laf- Sp245.1063 (flhB1 ::Omegon-Km) [13], leaky Fla- Laf- Sp245.1610 (fabG1 ::Omegon-Km) и leaky Fla- SK039 (mmsB1 ::Omegon-Km) мутанты [14].
Среды для культивирования бактерий. Культивирование бактерий проводили на минимальной малатно-солевой среде (MSM) [16] или богатой среде LB [17] при 28°С. При выращивании устойчивых к канамицину мутантов в среды вносили канамицин (Km) до 50 мкг/мл.
Оценка биомассы биопленок. Жидкие 18-часовые бактериальные культуры разбавляли средой LB или MSM до ^590, равной 0.05-0.10, вносили в стеклянные пробирки (по 2 мл) и инкубировали при 28°С стационарно. Перед окрашиванием биопленок удаляли планктонные бактерии. Биопленки окрашивали 1%-ным водным раствором красителя кристаллического фиолетового при комнатной температуре 10 мин и дважды промывали водой. Связавшийся с биомассой биопленок краситель растворяли в этаноле и измеряли Л 590 [4]. Пленки, сформированные на покровных стеклах, использовали для микроскопии.
Исследование агрегации бактериальных клеток. По 5 мл бактериальных культур, выращенных в условиях интенсивной аэрации, или жидких культур планктонных бактерий, окружавших биопленки, отстаивали в течение 30 мин [11, 12]. Осторожно декантировали жидкость, а из осевших агрегатов готовили взвесь в 5 мл 50 мМ фосфатного буфера (ФБ; pH 7.0) и оставляли для
отстаивания на 2 ч. Измеряли А590 надосадочной жидкости, затем осевшие агрегаты клеток 2 мин диспергировали в жидкости с помощью магнитной мешалки. Процент агрегационной дисперсии определяли по формуле
А = ((А590)2 - (А590)1)) / (А590)1 Х 100 % где (А590)1 - показатель А590 культуральной жидкости (взвеси) после отстаивания агрегатов до их диспергирования, а (А590)2 - показатель А590 взвеси после диспергирования агрегатов.
Обработка биопленок ДНКазой. ДНКазу (Fluka, Швейцария) растворяли в 10 мМ Tris-HCl буфере (рН 8.0), содержащем 2 мМ CaCl2, до концентрации 1 мг/мл. В контрольных вариантах использовали ФБ (pH 7.0). По 2 мл раствора фермента, разведенного в 50 мМ ФБ (pH 7.0) в соотношении 1:9, добавляли к биопленкам, предварительно удалив планктонную культуру, и инкубировали 2 ч при 37°C. После инкубации биопленки однократно отмывали дистиллированной водой и окрашивали, как описано выше. Результаты выражали в процентах относительно соответствующих контрольных проб.
Оценка содержания нуклеиновых кислот в матриксе биопленок. Выделение компонентов матрикса и определение содержания в них нуклеиновых кислот проводили согласно рекомендациям, приведенным в работе [18]. Биомассу 6-суточных биопленок, сформированных на поверхности стекла, после удаления планктонных бактерий промывали 50 мМ ФБ (pH 7.0) и смывали пипетированием этим буфером. Анализировали легко смываемые компоненты, перешедшие в надо садочную жидкость при центрифугировании биомассы после ее промывания ФБ (pH 7.0) (ФБ-«экстракты»). Процедуру повторяли трижды, собирая надосадочную жидкость. Содержание в экстрактах белка, углеводсодержащих компонентов и нуклеиновых кислот определяли соответственно рекомендациям, описанным в работе [18].
Световая микроскопия биопленок. Фазово-контрастную микроскопию проводили в Центре коллективного пользования научным оборудованием в области физико-химической биологии и нанобиотехнологии «Симбиоз» при ИБФРМ РАН (Саратов) на аппарате Leica LMD 7000 (Leica, Германия).
Статистическая обработка результатов. Оценку биомассы биопленок выполняли 30-50 раз в каждом варианте опыта. В остальных случаях проводили не менее трех независимых экспериментов с количественными измерениями как минимум в трех повторностях. Результаты статистически обрабатывали с использованием пакета Micro-
soft Office Excel 2007. Доверительные интервалы определяли для 95%-ного уровня значимости.
Результаты и их обсуждение
Исследование динамики формирования биопленок. Было осуществлено сравнение динамики накопления биомассы в пленках, формируемых штаммом A. brasilense Sp245 и его дефектными по жгутикованию мутантами Sp245.1063, Sp245.1610 и SK039 на границе раздела фаз «жидкость -твердая гидрофильная поверхность (стекло)». В первые сутки инкубации бактерий в жидкой среде LB на поверхности стеклянных пробирок формировались тонкие пленки, при микроскопии которых просматривались разрозненные клеточные агрегаты (микроколонии). На 2-3-и сутки инкубации в жидкой среде LB биомасса штаммов Sp245, Sp245.1063 и Sp245.1610, закрепившихся на поверхности пробирок, стабилизируется - без существенных межштаммовых различий (рис. 1).
.¿4590
Рис. 1. Динамика накопления биомассы в биопленках, сформированных бактериями A. brasilense 8р245 (1), 8р245.1063 (2), 8р245.1610 (3) и 8К039 (4) на поверхности стекла под жидкой средой LB в стационарных условиях. А590 - оптическая плотность кристаллического фиолетового, де сорбированного после окрашивания биопленок
Вероятно, в данном временном промежутке завершается процесс адгезии бактерий на поверхности стекла. Лишь в случае бактерий штамма 8К039 увеличивается продолжительность их адгезии на гидрофильной поверхности до 4 суток, что можно объяснить более высокой гидрофобностью клеток этого мутанта по сравнению с родительским штаммом 8р245 [5]. После завершения этого этапа бактериальные микроколонии сливаются в пленку с более ровной поверхностью, и начинается прирост биомассы. В случае штаммов 8р245.1063 и 8К039
количество биомассы в биопленке стабилизируется к 4-5-м суткам инкубации и остается неизменным на всем протяжении культивирования (см. рис. 1). Толщина биопленок, сформированных родительским штаммом 8р245 или мутантом 8р245.1610, становится постоянной позже - после 6 дней инкубации (см. рис. 1). Таким образом, к 6-м суткам культивирования все исследованные штаммы формируют зрелую биопленку (см. рис. 1). На стекле под ЬБ биомасса зрелых биопленок 8р245.1610
не отличается от показателей штамма 8р245, остальные мутанты образуют более тонкие пленки (см. рис. 1). Под М8М по сравнению с 8р245 все мутанты формируют биопленки с меньшим количеством биомассы (рис. 2, а). Результаты определения относительного количества биомассы в зрелых биопленках азоспирилл с помощью окрашивания и результаты прямых микроскопических измерений толщины биопленок согласуются между собой [4].
АВ9 О
2 В
1М 1£
14 1.2-1Я~ ОБ Ш 04 0.2 0
1 э Х-, 2
-ъ
%245 %245.1063%245.1610 8К039 Штамм
%
от контроля без обработки
100т
80
60™
40
20
%245 %245.1063 %245Д610 8К039 Штамм
Степень агрегации
планктонных клеток, %
100
80
60-
40
20
Степень агрегации
планктонных клеток, %
100-
80
%245 %245.1063 %245.1610 8К039 Штамм
60-
40
20
%245 %245.1063 %245Л610 8К039 Штамм
Рис. 2. Влияние ДНКазы (б) на биомассу биопленок А. Ъгазйете (а), сформированных на стекле под жидкой средой ЬБ (1) или М8М (2), и степень агрегации планктонных клеток (в, г) после 2 (в) и 6 (г) суток культивирования; а - А590 -оптическая плотность кристаллического фиолетового, десорбированного после окрашивания биопленок А. Ъгазйете; б - процентное отношение А^ красителя, десорбированного с окрашенных пленок после их инкубации в растворе ДНКазы (100 мкг/мл) к аналогичному показателю без обработки
б
а
г
в
Таким образом, начальные этапы формирования биопленки - прикрепление и адгезия бактерий на поверхности стекла, вероятно, протекают независимо от способности клеток синтезировать жгутики. Лишь в случае мутанта SK039 увеличивается продолжительность адгезии клеток на стекле до 4 суток. Тем не менее полноценный Fla необходим азоспириллам для активной адгезии [19]. Как уже отмечалась, на ранних этапах биопленки мутантов и родительского штамма образованы разрозненными клеточными агрегатами (микроколониями). Возможно, активная агрегация бактерий уже в планктонной культуре способствует их прикреплению к твердой поверхности, особенно в случае мутантов без полноценного Fla.
Влияние продолжительности и условий культивирования на способность бактерий к агрегации
Все штаммы имеют примерно одинаковую скорость роста на жидких средах LB или MSM. В статичных условиях в начале стационарной фазы роста на 2-е сутки культивирования (этап прикрепления бактерий к твердой поверхности (см. рис. 1)) в LB степень агрегации клеток в планктонных культурах Sp245.1063, Sp245.1610 и SK039 выше, чем у Sp245, при этом относительное количество биомассы в биопленках всех штаммов примерно одинаково (см. рис. 1, 2, в). Вероятно, активная агрегация бактерий уже в планктонной культуре способствует их прикреплению к твердой поверхности, особенно в случае мутантов без полноценного Fla, необходимого азоспириллам для активной адгезии [19].
При культивировании в LB на 6-е сутки в случае мутантов агрегация планктонных клеток не изменяется, а у Sp245 возрастает в 2 раза до уровня Sp245.1610 (см. рис. 2, г). На стекле относительное количество биомассы в биопленках этих штаммов в данный период культивирования также примерно одинаково (см. рис. 1, 2, а).
При культивировании в MSM стационарно клетки всех исследованных штаммов агрегировали примерно одинаково независимо от времени инкубации, а процент агрегации превышал данный показатель в LB (см. рис. 2, в, г). Тем не менее в MSM, как и в LB, сохраняются различия в толщине зрелых пленок Sp245 и Sp245.1063 или SK039 (см. рис. 2, а). Очевидно, что агрегация клеток в 6-суточной планктонной культуре этих трех штаммов существенным образом не влияет на количество биомассы зрелых биопленок. В случае Sp245.1610 под MSM толщина зрелых биопленок уступает показателю этого мутанта под LB (см. рис. 2, а). Одной из причин зависи-
мости толщины биопленок 8р245.1610 от состава среды культивирования могут являться различия в степени гидрофобности клеток этого мутанта, выросших в ЬБ или М8М [5].
В условиях перемешивания (условия, позволяющие повысить содержание кислорода в среде культивирования) агрегация клеток неподвижных мутантов по сравнению с 8р245 выражена в меньшей степени. Так, к 18 ч культивирования на среде М8М для штаммов 8р245, 8р245.1063, 8р245.1610 и 8К039 показатель агрегации клеток составляет соответственно (36.8 ± 7.9), (21.8 ± 5.7), (5.8 ± 0.6) и (8.2 ± 1.4)%. Агрегация 2-суточных культур в условиях перемешивания не изменяется. Например, к 48 ч культивирования на среде М8М у штаммов 8р245 и 8р245.1063 показатель агрегации клеток составляет соответственно (35.9 ± 6.2) и (26.2 ± 4.9)%. Стоит отметить, что к 48 ч на ЬБ в условиях перемешивания агрегация клеток штамма 8р245 достигает максимальной величины ((69.2 ± 1.9)%), а у мутанта 8р245.1063 - минимальной ((4.7 ± 1.6)%) ниже.
Вполне вероятно, что подвижность и жгутики способствуют агрегации азоспирилл в зависимости от состава среды и содержания кислорода в среде культивирования (от степени насыщения среды кислородом). Так, даже в статичных условиях при фазово-контрастной микроскопии 18-часовых жидких культур 8р245 видно, что подвижные клетки этого штамма, сосредоточившиеся в результате аэротаксиса недалеко от границы раздела жидкость/воздух, образуют небольшие агрегаты (рис. 3). Клетки мутантов, лишенные полярной флагеллы, не обладают способностью к подобной быстрой агрегации.
Таким образом, способность бактерий к агрегации в планктонной культуре обусловливает начальные этапы формирования биопленок, но не способствует приросту биомассы зрелых пленок, что наиболее очевидно в случае мутантов с инак-тивированными генами flhB, faЪG1 или mmsB1. Результаты исследования позволили выявить у азоспирилл, различающихся по способности синтезировать жгутики, зависимость степени агрегации клеток в планктонной культуре и формирования ими биопленок от состава среды, продолжительности и условий культивирования, которые, в свою очередь, могут влиять на свойства компонентов клеточной поверхности микроорганизмов белковой и полисахаридной природы [5, 11, 12, 20]. Важным интегральным компонентом для процесса агрегации клеток некоторых микроорганизмов является эДНК. Например, обработка клеток бактерий рода ЕМо^упЫт ну-клеазами приводит к прекращению процесса их
где
Рис. 3. Фазово-контрастная микроскопия 18-часовых жидких культур А. ЬгазИете Бр245 (а-д) и 8р245.1063 (е), выращенных в ЬБ, спустя 1 (б), 5 (в), 10 (г, д) и 15 мин (а, е) после приготовления препарата для микроскопии. Черными стрелками обозначена область максимального сосредоточения подвижных клеток недалеко от отмеченной белыми стрелками границы раздела жидкость/воздух. Масштабная линейка соответствует 10 мкм
самоосаждения [9]. Внеклеточные ДНК являются компонентами матрикса пленок А. Ьrasilense [10], однако функция этих компонентов в биопленках азоспирилл остается неясной.
Исследование устойчивости биомассы биопленок к действию ДНКазы
Оценка содержания белковых, углеводсодер-жащих составляющих и нуклеиновых кислот в матриксе, полученном из смытой с поверхности стекла биомассы биопленок штамма Бр245, показала, что в ФБ-«экстрактах» перечисленные компоненты распределяются в следующем соотношении: 1.0/3.6/0.5 (матрикс из биопленок, сформированных под ЬБ) или 1.0/4.1/0.1 (матрикс из биопленок, сформированных под МБМ).
После инкубации с ДНКазой (100 мкг/мл) биомасса биопленок Бр245, сформированных под ЬБ на стекле, убывала на 36% (см. рис. 2, б). Мутанты Бр245.1063, Бр245.1610 и БК039 теряли примерно такое же количество биомассы (32-40%). Аналогичная устойчивость к действию фермента выявлена и у биопленок, образованных под МБМ (см. рис. 2, б). После обработки ДНКазой биомасса биопленок штамма Бр245 снижалась на 40%, а мутанты теряли примерно 29-33% биомассы (см. рис. 2, б).
По нашим неопубликованным данным, после инкубации с 40 мМ раствором периодата
натрия, окисляющего полисахариды, биомасса зрелых биопленок Бр245, сформированных на стекле под ЬБ, убывает на 40%, а в случае лишенных жгутиков мутантов Бр245.1063, Бр245.1610 и БК039 эта величина составляет 60-75%. На стекле под МБМ устойчивость биопленок всех штаммов к периодатному окислению возрастает, а биомасса биопленок снижается примерно на 20% (наши неопубликованные данные). После инкубации с проназой (100 мкг/мл) биомасса биопленок Бр245 или БК039, сформированных под ЬБ на стекле, уменьшается на 20-30%, а в случае штамма Бр245.1610 на 46% [6]. Устой -чивость образованных под МБМ биопленок исследованных штаммов к действию протеазы была одинаковой. После обработки проназой биомасса биопленок уменьшалась примерно на 21-31% [6].
Таким образом, в исследованном нами матриксе биопленок бактерий вида А. Ьrasilense содержание белковых и углеводсодержащих компонентов преобладает над содержанием нуклеиновых кислот, однако влияние инкубации с ДНКазой, снижающей биомассу биопленок всех исследованных штаммов, сопоставимо с воздействием на пленки азоспирилл протеазы и периодатного окислителя полисахаридов. Результаты этих сравнений позволяют полагать, что
эДНК является частью многокомпонентной системы, обеспечивающей как сродство биопленок к поверхностям с разными физико-химическими свойствами, так и их структурную целостность.
Список литературы
1. Fibach-Paldi S., Burdman S., Okon Y. Key physiological properties contributing to rhizosphere adaptation and plant growth promoting abilities of Azospirillum brasilense // FEMS Microbiol. Lett. 2012. Vol. 326, № 2. P. 99-108.
2. Bogino P. C., Oliva M. M., Sorroche F. G., Giordano W. The role of bacterial biofilms and surface components in plant-bacterial associations // Intern. J. Mol. Sci. 2013. Vol. 14. P. 15838-15859.
3. Шелудько А. В., Кулибякина О. В., Широков А. А., Петрова Л. П., Матора Л. Ю., Кацы Е. И. Влияние мутаций в синтезе липополисахаридов и полисахаридов, связывающих калькофлуор, на формирование биопленок Azospirillum brasilense // Микробиология. 2008. Т. 77, № 3. C. 358-363.
4. Шелудько А. В., Филипьечева Ю. А., Шумилова Е. М., Хлебцов Б. Н., Буров А. М., Петрова Л. П., Кацы Е. И. Изменения в формировании биопленок у flhB1 мутанта бактерии Azospirillum brasilense Sp245, лишенного жгутиков // Микробиология. 2015. Т. 84, № 2. C. 175-183.
5. Шумилова Е. М., Шелудько А. В., Филипьечева Ю. А., Евстигнеева С. С., Пономарева Е. Г., Петрова Л. П., Кацы Е. И. Изменение свойств клеточной поверхности и эффективности формирования биопленок у мутантов бактерии Azospirillum brasilense Sp245 по предполагаемым генам липидного метаболизма mmsBl иfabGl // Микробиология. 2016. Т. 85, № 2. С. 162-170.
6. Телешева Е. М., Синякин Д. Н., Шелудько А. В., Филипьечева Ю. А., Пономарева Е. Г., Петрова Л. П., Кацы Е. И. Анализ влияния протеаз на структуру биопленок штамма Azospirillum brasilense Sp245 и его дефектных по жгутикованию mmsBl и fabGl мутантов // Изв. Сарат. ун-та. Нов. сер. Сер. Химия. Биология. Экология. 2017. Т. 17, вып. 3. С. 322-327.
7. Frnlund B., Palmgren R., Keiding K., Nielsen P. H. Extraction of extracellular polymers from activated sludge using a cation exchange resin // Water Res. 1996. Vol. 30. P. 1749-1758.
8. Molin S., Tolker-Nielsen T. Gene transfer occurs with enhanced efficiency in biofilms and induces enhanced stabilisation of the biofilm structure // Curr. Opin. Biotechnol. 2003. Vol. 14. P. 255-261.
9. Watanabe M. Growth and flocculation of a marine photo-synthetic bacterium Rhodovulum sp. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1998. Vol. 50. P. 682-691.
10. Ramírez-Mata A., López-Lara L. I., Xiqui-Vázquez L., Jijón-Moreno S., Romero-Osorio A., Baca B. E. The cyclic-di-GMP diguanylate cyclase CdgA has a role in biofilm formation and exopolysaccharide production in Azospirillum brasilense // Res. in Microbiol. 2016. Vol. 167. P. 190-201.
11. Madi L., Henis Y. Aggregation in Azospirillum brasilense Cd : conditions and factors involved in cell-to cell adhesion // Plant Soil. 1989. Vol. 115, № 1. P. 89-98.
12. Никитина В. Е., Пономарева Е. Г., Аленькина С. А., Коннова С. А. Участие бактериальных лектинов клеточной поверхности в агрегации азоспирилл // Микробиология. 2001. Т. 70, № 4. С. 471-476.
13. Ковтунов Е. А., Петрова Л. П., Шелудько А. В., Кацы Е. И. Инсерция транспозона в хромосомную копию гена flhB сопровождается дефектами в образовании полярного и латеральных жгутиков у бактерий Azospirillum brasilense Sp245 // Генетика. 2013. Т. 49, № 8. С. 1013-1016.
14. Ковтунов Е. А., Шелудько А. В., Чернышова М. П., Петрова Л. П., Кацы Е. И. Мутанты бактерии Azo-spirillum brasilense Sp245 со вставкой омегона в генах липидного метаболизма mmsB или fabG дефектны по подвижности и жгутикованию // Генетика. 2013. Т. 49, № 11. С. 1270-1275.
15. Baldani V. L. D., Baldani J. I., Dobereiner J. Effects of Azospirillum inoculation on root infection and nitrogen incorporation in wheat // Can. J. Microbiol. 1983. Vol. 29, № 8. P. 924-929.
16. Dobereiner J., Day J. M. Associative symbiosis in tropical grass: Characterization of microorganisms and dinitrogen fixing sites // Symposium on Nitrogen Fixation / eds. W. E. Newton, C. J. Nijmans. Pullman : Washington State University Press, 1976. P. 518-538.
17. SambrookJ., Fritsch E. F., Maniatis T. Molecular Cloning : a Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor : Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
18. Wang D., Xu A., Elmerich C., Ma L. Z. Biofilm formation enables free-living nitrogen-fixing rhizobacteria to fix nitrogen under aerobic conditions // ISME J. 2017. Vol. 11. P. 1602-1613.
19. Croes C. L., Moens S., Bastelaere E. van, Vanderleyden J., Michiels K. W. The polar flagellum mediates Azospirillum brasilense adsorption to wheat roots // J. Gen. Microbiol. 1993. Vol. 139, № 9. P. 2261-2269.
20. Dufrene Y. E., RouxhetP. C. Surface composition, surface properties and adhesiveness of Azospirillum brasilense -variation during growth // Can. J. Microbiol. 1996. Vol. 42. P. 548-556.
On the Contribution of Cell Aggregation
and Extracellular DNA to Biofilm Formation
and Stabilization in Azospirillum brasilense Bacteria
Yu. A. Filip'echeva, E. M. Telesheva, S. S. Yevstigneyeva, A. V. Shelud'ko, E. G. Ponomareva, L. P. Petrova, E. I. Katsy
Yulia A. Filip'echeva, https://orcid.org/0000-0003-3182-1007, Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms, Russian Academy of Sciences, 13, Ave. Entuziastov, Saratov, 410049, Russia, ljuche@yandex.ru
Elizaveta M. Telesheva, https://orcid.org/0000-0001-9405-1877, Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms, Russian Academy of Sciences, 13, Ave. Entuziastov, Saratov, 410049, Russia, sentebrinka@mail.ru
Stella S. Yevstigneyeva, https://orcid.org/0000-0001-6789-7324, Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms, Russian Academy of Sciences, 13, Ave. Entuziastov, Saratov, 410049, Russia, stels20295@yandex.ru
Andrei V. Shelud'ko, https://orcid.org/0000-0002-2535-5225, Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms, Russian Academy of Sciences, 13, Ave. Entuziastov, Saratov, 410049, Russia, shel71@yandex.ru
Elena G. Ponomareva, https://orcid.org/0000-0003-3701-9090, Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms, Russian Academy of Sciences, 13, Ave. Entuziastov, Saratov, 410049, Russia, ponomareva_e@ibppm.ru
Lilia P. Petrova, https://orcid.org/0000-0002-1593-6157, Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms, Russian Academy of Sciences, 13, Ave. Entuziastov, Saratov, 410049, Russia, petrova_lp@mail.ru
Elena I. Katsy, https://orcid.org/0000-0002-3299-3372, Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms, Russian Academy of Sciences, 13, Ave. Entuziastov, Saratov, 410049, Russia, ei_katsy@mail.ru
Little is known about the functions of the principal matrix components and about the role of cell surface structures in the formation and stabilization of Azospirillum biofilms. It is known that as compared with A. brasilense strain Sp245, its flhBI, fabGI, and mmsBI mutants, defective in flagellar assembly, form biofilms less well. We made comparative study of bacterial aggregation, biofilm formation, and the effect of DNAase on biofilms. The results show that in planktonic culture, cel aggregation determines the initial stages in biofilm formation but does not contribute to biomass growth in mature films (observed most clearly with the mutants). Extracellular DNA is part of a multicomponent system that ensures the affinity of biofilms to physicochemically different surfaces and the structural integrity of biofilms. Key words: Azospirillum brasilense, bacterial aggregation, biofilm matrix, extracellular DNA.
Образец для цитирования:
Филипьечева Ю. А., Телешева Е. М., Евстигнеева С. С., Шелудько А. В., Пономарева Е. Г., Петрова Л. П., Кацы Е. И. О вкладе агрегации клеток и экстраклеточной ДНК в формирование и стабилизацию биопленок бактерий Azospirillum brasilense // Изв. Сарат. ун-та. Нов. сер. Сер. Химия. Биология. Экология. 2018. Т. 18, вып. 4. С. 399-406. DOI: https: //doi.org/10.18500/1816-9775-2018-18-4-399-406
dte this article as:
Filip'echeva Yu. A., Telesheva E. M., Yevstigneyeva S. S., Shelud'ko A. V., Ponomareva E. G., Petrova L. P., Katsy E. I. On the Contribution of Cell Aggregation and Extracellular DNA to Biofilm Formation and Stabilization in Azospirillum brasilense Bacteria. Izv. Saratov Univ. (N. S.), Ser. Chemistry. Biology. Ecology, 2018, vol. 18, iss. 4, pp. 399-406 (in Russian). DOI: https: //doi.org/10.18500/1816-9775-2018-18-4-399-406
