CC BY
29
УДК 579.222.4
ИК-ФУРЬЕ-СПЕКТРОСКОПИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ НАКОПЛЕНИЯ ПОЛИ-3-ГИДРОКСИБУТИРАТА КЛЕТКАМИ ЛЮБИМШиМ ВЯАБИЕМБЕ ПРИ РАЗЛИЧНОЙ ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ И КОНЦЕНТРАЦИИ АММОНИЯ В ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЕ
В. В. Паршина, Ю. А. Дятлова, А. В. Тугарова
Паршина Виктория Валерьевна, студент кафедры биохимии и биофизики, Саратовский национальный исследовательский государственный университет имени Н. Г. Чернышевского, рагБЫпа-м/@ yandex.ru
Дятлова Юлия Анатольевна, аспирант лаборатории биохимии, Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, jdyatlowa2013@yandex.ru
Тугарова Анна Владимировна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории биохимии, Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, tugarova_anna@mail.ru
Многие бактерии синтезируют в ответ на неблагоприятные условия окружающей среды сложные полиэфиры класса полиги-дроксиалканоатов (ПГА). Эти биополимеры, накапливаясь внутри бактериальных клеток в виде гранул, позволяют бактериям лучше противостоять негативным внешним условиям и служат резервными источниками углерода и энергии. Ризосферные бактерии вида АюэрИНит ЬгавИепве синтезируют лишь один из ПГА - поли-3-гидроксибутират (ПГБ) - в качестве ответной реакции на стрессовые факторы. Знание принципов и условий синтеза ПГБ важно как для понимания существования азоспирилл в естественной среде обитания, так и при использовании их в качестве биоудобрений - для сохранения их жизнеспособности. В настоящей работе с помощью метода инфракрасной (ИК) фурье-спектроскопии исследовано накопление ПГБ клетками штаммов А. ЬгавИепве Эр7 и Бр245 при выращивании бактерий в течение 6 сут. на синтетической малатно-солевой питательной среде с добавлением различных концентраций хлорида аммония (0.05, 0.10 и 0.21 г/л). Сравнительный анализ ИК-фурье-спектров образцов полученных биомасс бактерий показал, что при субоптимальных исходных концентрациях связанного азота в среде накопление ПГБ штаммом А. ЬгавИепве Эр7 в течение 1-6 сут. культивирования происходит более интенсивно, чем штаммом Бр245. При этом наибольшее относительное количество ПГБ в биомассе накапливалось штаммом А. brasilense Эр7 при исходной концентрации ЫН4С1 в среде 0.10 г/л после 3 сут. культивирования. Ключевые слова: АюэрШит, поли-3-гидроксибутират, ИК-фурье-спектроскопия.
DOI: 10.18500/1816-9775-2018-18-3-331-335
Введение
Многие микроорганизмы способны к синтезу сложных полиэфиров класса полигидроксиалка-ноатов (ПГА). Данные биополимеры синтезируются бактериями в ответ на неблагоприятные условия окружающей среды, такие как дефицит
питательных веществ, присутствие соединений тяжелых металлов и др. Как известно, ПГА накапливаются внутри бактериальных клеток в виде гранул и позволяют бактериям лучше противостоять негативным внешним условиям, а также являются резервными источниками углерода и энергии [1]. С другой стороны, биополимеры класса ПГА являются экологически безопасной альтернативой традиционным пластикам: они быстро разрушаются в окружающей среде и по своим физическим свойствам сходны с синтетическими пластиками. Одним из самых простых полиэфиров класса ПГА является поли-3-гидроксибутират (ПГБ), наиболее изученный биопластик из класса ПГА микробного происхождения, состоящий из мономеров Р-оксимасляной кислоты.
Бактерии Azospirillum Ъrasilense, обитающие в ризосфере растений и способные образовывать ассоциации с корнями многих растений [2], синтезируют ПГБ в качестве ответной реакции на стрессовые факторы [3-6]. Эти ризобактерии также используются в составе биоудобрений для улучшения роста и урожайности растений [7, 8].
Знание принципов и условий синтеза ПГБ важно как для понимания существования азоспи-рилл в естественной среде обитания, так и при использовании их в качестве биоудобрений - для сохранения их жизнеспособности.
Целью данной работы был подбор условий культивирования для бактерий А. Ъrasilense для получения максимального количества ПГБ при минимальном времени роста культуры. Для работы были выбраны одни из наиболее изученных штаммов А. Ъrasilense: Бр7 и Бр245, отличающиеся занимаемыми ими экологическими нишами в ризосфере и поведением в сходных условиях [3, 4, 6]. Штамм А. Ъrasilense Бр245 является эндофитом, способным к внутриклеточной/вну-трикорневой колонизации, в то время как Бр7 может колонизировать корни растений только поверхностно.
В качестве аналитического метода использована инфракрасная (ИК) фурье-спектроскопия, позволяющая получить ценную структурную информацию и одновременно проводить монито-
© Паршина В. В., Дятлова Ю. А., Тугарова А. В., 2018
Изв. Сарат. ун-та. Нов. сер. Сер. Химия. Биология. Экология. 2018. Т. 18, вып. 3
ринг относительного содержания отдельных макрокомпонентов сложных биологических систем, включая бактериальную биомассу [3-6, 9-13].
Материалы и методы
В работе были использованы штаммы A. brasilense Sp7 (АТСС 29145) [14] и Sp245 [15], полученные из Коллекции ризосферных микроорганизмов ИБФРМ РАН (WDCM 1021). Бактерии выращивали на синтетической малатной среде (СМС, рН 6.8), предложенной Дей и Доберейнер [16]. Железо в среду вносили в хелатной форме (FeSO4'7H2O - 2.0 г/л; нитрилотриуксусная кислота - 5.6 г/л) из расчета 10 мл раствора на литр среды перед автоклавированием. Соли MgSO^^O и CaCl2 были приготовлены в виде стоковых 100-кратных стерильных растворов, которые добавляли в среду культивирования после автоклавирования последней. Среду стерилизовали в течение 30 мин при 121°С.
Посевной материал выращивали при 28-31°С аэробно в колбах Эрленмейера объемом 250 мл, содержащих по 100 мл СМС, в течение 1822 ч до оптической плотности 0.9-1.1. Инокулят вносили из расчета 1 мл на 100 мл среды. Контроль чистоты культуры осуществлялся методом «раздавленной капли» на микроскопе «Olympus» (модель С011, Япония) при увеличении в 400 раз. Плотность культуры определяли с помощью спектрофотометра (Specol 221; X = 600 нм).
Для мониторинга синтеза ПГБ бактерии штаммов A. brasilense Sp245 и Sp7 выращивали на среде СМС с добавлением 0.05, 0.10 и 0.21 г/л NH4CI. Культуры растили в аэробных условиях при температуре 31°С в течение 6 сут. Мониторинг синтеза ПГБ осуществлялся методом ИК-фурье-спектроскопии in situ (без выделения ПГБ из биомассы). После 1, 2, 3 и 6 сут. в стерильных условиях отбиралось по 10 мл культуры. Отобранные образцы центрифугировали (10000g, 7 мин), трижды отмывали физиологическим раствором (8.5 г NaCl на 1 л дистиллированной воды), осадок клеток высушивали в сушильном шкафу при 40-50°С, тщательно растирали в агатовой ступке и ресуспендирова-ли в 150-200 мкл воды (MilliQ). Полученную суспензию наносили на подложку из специального стекла (ZnSe, прозрачного в ИК-области) и высушивали при 45°С. ИК-спектры образцов культур измеряли на ИК-фурье-спектрометре Nicolet 6700 (Thermo Electron Corporation, США) в режиме пропускания (transmission) в диапазоне 4000-400 см-1 с накоплением 64 разверток спектров (разрешение 4 см-1) при температуре 23 ± 2°C. Обработку спектров проводи-
ли с помощью стандартной программы OMNIC, поставляемой вместе со спектрометром.
Расчет относительного количества синтезированного ПГБ (а) проводили, используя формулу [9]
: А^о/^амид-П
(1)
где !у(с=о) - интенсивность полосы валентных колебаний карбонильной группы (С=0) в ПГБ (~1730) см-1 как маркера содержания ПГБ; - интенсивность полосы амид-11 (соответ-
амид-11
ствующей клеточным белкам; —1550 см-1).
Результаты и их обсуждение
В работе для оценки относительного содержания ПГБ в бактериальной биомассе был использован метод ИК-фурье-спектроскопии. В отличие от других методов, применяемых для определения ПГБ (например, ВЭЖХ), он требует минимальных затрат (без сложных процедур пробоподготовки) и минимальных количеств образца. В основе метода ИК-фурье-спектроскопии лежит регистрация колебательных переходов функциональных групп (групп атомов в молекулах, связанных химическими связями) под действием ИК-излучения, вызывающих изменение дипольного момента функциональных групп в молекулах вещества. ИК-спектры микробных клеток являются специфичными и отражают наличие всех типов биологических молекул в образце.
На рисунке представлен спектр бактериальной культуры А. brasilense Бр7, выращенной в течение 3 сут. в присутствии 0.10 г/л КЫ4С1.
ИК- фурье-спектр высушенной биомассы штамма А. Ьгаз^ 1ете Бр7, выращенного в течение 3 сут. в присутствии 0.10 г/л ЫЫ4С1. ПГБ - поли-3-гидроксибутират
а
Накопление ПГА в биомассе определяют по характерным для этих полиэфиров полосам, в первую очередь по наиболее интенсивной полосе валентных колебаний карбонильной группы сложноэфирного фрагмента (в области 17201750 см-1). Данная полоса использовалась нами в работе как маркер ПГБ. Известно, что в бактериальной клетке содержание белка составляет порядка 40-60% и для определенных бактерий в сходных условиях изменяется несущественно
[17], что в ИК-спектроскопии позволяет использовать интенсивности характеристических полос клеточных белков амид-1 (в области 16201680 см-1) или амид-11 (около 1550 см-1) как внутренний стандарт [9, 17]. На основании анализа спектров рассчитывалось отношение интенсивности полосы - маркера ПГБ к интенсивности полосы амид-11 по описанной выше методике [9]. В таблице представлены рассчитанные соотношения (а) для измеренных спектров исследуемых образцов.
Соотношение интенсивностей (а; см. формулу (1) полос ПГБ (около 1730 см-1) и амид-П (около 1550 см-1) в ИК-фурье-спектрах биомассы бактерий при накоплении поли-3-гидроксибутирата (ПГБ)
штаммами А. ЬгаэНете 8р7 и 8р245
Время, сут. Концентрация NH4Cl в среде выращивания, г/л
0.05 0.10 0.21
Sp7 Sp245 Sp7 Sp245 Sp7 Sp245
1 4.94 0.59 3.09 0.46 2.07 0.33
2 4.59 0.94 7.05 0.61 4.99 0.57
3 4.7 0.96 8.46 1.06 4.39 0.97
6 2.62 1.02 5.08 0.4 2.94 0.66
Как видно из представленных данных, величины а для штамма A. brasilense Бр245 во всех случаях значительно (в —2.5-8 раз) ниже, чем для штамма Бр7. Это отражает существенно меньшее накопление ПГБ штаммом Бр245 в аналогичных условиях и, вероятно, связано с более выраженным клеточным ответом штамма Бр7 на неблагоприятные условия (в присутствии малых концентраций связанного азота в среде) [3]. Значение а максимально для штамма A. brasilense Бр7 при выращивании в течение 3 сут. при исходном содержании КЫ^О 0.10 г/л. Снижение величины а, отражающее снижение относительного содержания ПГБ, отчетливо проявляющееся на 6-е сут. культивирования, соответствует переходу бактерий на использование внутренних резервов (ПГБ) при исчерпании питательных веществ среды. Однако необходимо отметить, что форма полосы валентных колебаний карбонильной группы сложноэфирного фрагмента в области 1720-1750 см-1 для измеренных нами спектров заметно отличалась для разных образцов, что отражает различное соотношение упорядоченной (с большей степенью кристалличности) и неупорядоченной (более аморфной) структур ПГБ, имеющих различающиеся частоты колебаний [18]. Данное обстоятельство может снижать точность определения относительного содержания ПГБ по используемому в данной работе методу расчета соотношения а (по отношению интенсивностей полос). Тем не менее сравнение значений а для
биомасс, выращенных и изученных в сходных условиях, позволяет оценить различия в уровне накопления ПГБ клетками бактерий.
Таким образом, на основании проведенных экспериментальных исследований и расчетов показано, что при субоптимальных исходных концентрациях связанного азота в среде (0.05—
0.21 г/л NH4Cl) накопление ПГБ штаммом A. brasilense Sp7 в течение 1-6 сут. культивирования происходит более интенсивно, чем штаммом Sp245. Максимальное количество ПГБ накапливается штаммом A. brasilense Sp7 при исходной концентрации хлорида аммония в среде 0.10 г/л после 3 сут культивирования.
Благодарности
Авторы выражают благодарность профессору, доктору химических наук А. А. Камневу, ведущему научному сотруднику лаборатории биохимии ИБФРМРАН (Саратов), за помощь в интерпретации и описании полученных результатов. Представленные ИК-фурье-спектроскопические исследования проводили в Центре коллективного пользования научным оборудованием в области физико-химической биологии и нанобиотехноло-гии «Симбиоз» ИБФРМ РАН. Работа выполнена при частичной финансовой поддержке РФФИ (проект № 17-08-01696-а).
Список литературы
1. Kadouri D., Jurkevitch E., Okon Y., Castro-Sowin-ski S. Ecological and agricultural significance of
Изв. Сарат. ун-та. Нов. сер. Сер. Химия. Биология. Экология. 2018. Т. 18, вып. 3
bacterial polyhydroxyalkanoates // Crit. Rev. Microbiol. 2005. Vol. 31. P. 55-67.
2. Bashan Y., de-Bashan L. E. How the plant growth-promoting bacterium Azospirillum promotes plant growth - a critical assessment // Adv. Agron. 2010. Vol. 108. P. 77-136.
3. Kamnev A. A., Tugarova A. V., Antonyuk L. P., Taranti-lis P. A., Kulikov L. A., Perfiliev Yu. D., Polissiou M. G., Gardiner P. H. E. Instrumental analysis of bacterial cells using vibrational and emission Mossbauer spectroscopic techniques // Anal. Chim. Acta. 2006. Vol. 573-574. P. 445-452.
4. Kamnev A. A. FTIR spectroscopic studies of bacterial cellular responses to environmental factors, plant-bacterial interactions and signalling // Spectrosc. Intern. J. 2008. Vol. 22, № 2-3. P. 83-95.
5. Kamnev A. A., Sadovnikova J. N., Tarantilis P. A., Polissiou M. G., Antonyuk L. P. Responses of Azospirillum brasilense to nitrogen deficiency and to wheat lectin : a diffuse reflectance infrared Fourier transform (DRIFT) spectroscopic study // Microb. Ecol. 2008. Vol. 56, № 4. P. 615-624.
6. Kamnev A. A., Tugarova A. V., Tarantilis P. A., Gardiner P. H. E., Polissiou M. G. Comparing poly-3-hydroxybutyrate accumulation in Azospirillum brasilense strains Sp7 and Sp245 : the effects of copper(II) // Appl. Soil Ecol. 2012. Vol. 61. P. 213-216.
7. Fibach-Paldi S., Burdman S., Okon Y. Key physiological properties contributing to rhizosphere adaptation and plant growth promotion abilities of Azospirillum brasilense // FEMS Microbiol. Lett. 2011. Vol. 326, № 2. P. 99-108.
8. Cassân F., Diaz-Zorita M. Azospirillum sp. in current agriculture : From the laboratory to the field // Soil Biol. Biochem. 2016. Vol. 103. P. 117-130.
9. Naumann D. Infrared Spectroscopy in Microbiology // Encyclopedia of Analytical Chemistry / ed. R. A. Meyers. Chichester : Wiley, 2000. P. 102-131.
10. Kamnev A. A., Mamchenkova P. V., Dyatlova Yu. A., Tugarova A. V. FTIR spectroscopic studies of selenite reduction by cells of the rhizobacterium Azospirillum brasilense Sp7 and the formation of selenium nanopar-ticles // J. Mol. Struct. 2017. Vol. 1140. P. 106-112.
11. Tugarova A. V., Shelud'ko A. V., Dyatlova Yu. A., Filip'echeva Yu. A., Kamnev A. A. FTIR spectroscopic study of biofilms formed by the rhizobacterium Azo-spirillum brasilense Sp245 and its mutant Azospirillum brasilense Sp245.1610 // J. Mol. Struct. 2017. Vol. 1140. P. 142-147.
12. Tugarova A. V., Mamchenkova P. V., Dyatlova Yu. A., Kamnev A. A. FTIR and Raman spectroscopic studies of selenium nanoparticles synthesised by the bacterium Azospirillum thiophilum // Spectrochim. Acta Part A : Mol. Biomol. Spectrosc. 2018. Vol. 192. P. 458-463.
13. Kamnev A. A., Tugarova A. V., Dyatlova Yu. A., Taran-tilis P. A., Grigoryeva O. P., Fainleib A. M., De Luca S. Methodological effects in Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy : Implications for structural analyses
of biomacromolecular samples // Spectrochim. Acta Part A : Mol. Biomol. Spectrosc. 2018. Vol. 193. P. 558-564.
14. Tarrand J. J., Krieg N. R., Dobereiner J. A taxonomic study of the Spirillum lipoferum group, with descriptions of a new genus, Azospirillum gen. nov. and two species, Azospirillum lipoferum (Beijerinck) comb. nov. and Azospirillum brasilense sp. nov // Can. J. Microbiol. 1978. Vol. 24, №. 8. P. 967-980.
15. Baldani V. L. D., Baldani J. I., Dobereiner J. Effects of Azospirillum inoculation on root infection and nitrogen incorporation in wheat // Can. J. Microbiol. 1983. Vol. 29, №. 8. P. 924-929.
16. Day J. M., Dobereiner J. Physiological aspects of N2-fixation by a Spirillum from Digitaria roots // Soil Biol. Biochem. 1976. Vol. 8, № 1. P. 45-50.
17. KansizM., Billman-Jacobe H., McNaughton D. Quantitative determination of the biodegradable polymer poly(P-hydroxybutyrate) in a recombinant Escherichia coli strain by use of mid-infrared spectroscopy and multivariative statistics // Appl. Envir. Microbiol. 2000. Vol. 66, № 8. P. 3415-3420.
18. Kansiz M., Domínguez-Vidal A., McNaughton D., LendlB. Fourier-transform infrared (FTIR) spectroscopy for monitoring and determining the degree of crystallisation of polyhydroxyalkanoates (PHAs) // Anal. Bioanal. Chem. 2007. Vol. 388, № 5-6. P. 1207-1213.
Fourier Transform Infrared Spectroscopic Analysis of Poly-3-Hydroxybutyrate Accumulation by Azospirillum brasilense Cells at Various Cultivation Periods and Ammonium Concentrations in the Culture Medium
V. V. Parshina, Yu. A. Dyatlova, A. V. Tugarova
Victoria V. Parshina, ORCID 0000-0003-1885-9422, Saratov State University, 83, Astrakhanskaya Str., Saratov, 410012, Russia, parshina-v-v@yandex.ru
Yulia A. Dyatlova, ORCID 0000-0002-8451-7271, Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms, Russian Academy of Sciences, 13, Entuziastov Ave., Saratov, 410049, Russia, jdyatlowa2013@yandex. ru
Anna V. Tugarova, ORCID 0000-0001-6017-4289, Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms, Russian Academy of Sciences, 13, Entuziastov Ave., Saratov, 410049, Russia, tugarova_anna@mail.ru
Many bacteria, in response to unfavourable environmental conditions, can synthesise polyesters of the polyhydroxyalkanoate (PHA) class. These biopolymers, accumulating intracellularly in the form of granules, help the bacteria to cope with negative environments and are utilised as reserve sources of carbon and energy. Rhizobacteria of the species Azospirillum brasilense synthesise a single type of PHA, poly-3-hydroxybutyrate (PHB), in response to stress factors. Knowledge of the principles and conditions of PHB synthesis is of importance both for understanding the subsistence of azospirilla in their natural habitats and for their use
as biofertilisers, to preserve their viability. In this work, Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy was used to study PHB accumulation by cells of Azospirillum brasilense strains Sp7 hi Sp245 during growth of the bacteria for 6 days in standard malate salt medium containing various concentrations of ammonium chloride (0.05, 0.10 and 0.21 g/l). Comparative analysis of FTIR spectra of the bacterial biomass samples showed that, at suboptimal initial concentrations of bound nitrogen in the medium, PHB accumulation after 1 to 6 days of cultivation was more intensive in A. brasilense strain Sp7 than in strain Sp245. Maximum relative amounts of PHB were accumulated by biomass of A. brasilense Sp7 grown for 3 days at the initial NH4Cl concentration in the culture medium 0.10 g/l.
Key words: Azospirillum, poly-3-hydroxybutyrate, Fourier transform infrared spectroscopy.
Acknowledgments: The authors are grateful to Professor A. A. Kamnev, D.Sc., Leading Researcher at the Laboratory of Biochemistry, Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms, Russian Academy of Sciences (IBPPMRAS, Saratov, Russia), for his help in interpreting the experimental spectroscopic data. The experiments using Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy were performed on the equipment of the "Simbioz" Centre for the Collective Use of Research Equipment in the field of physical-chemical biology andnanobiotechnology at IBPPM RAS, Saratov, Russia (FTIR spectrometer Nicolet 6700). This work was supported in part by the Russian Foundation for Basic Research (project no. 17-08-01696-a).
Образец для цитирования:
Паршина В. В., Дятлова Ю. А., Тугарова А. В. ИК-Фурье-спектроскопический анализ накопления поли-3-гидро-ксибутирата клетками Azospirillum brasilense при различной продолжительности культивирования и концентрации аммония в питательной среде // Изв. Сарат. ун-та. Нов. сер. Сер. Химия. Биология. Экология. 2018. Т. 18, вып. 3. С. 331-335. DOI: 10.18500/1816-9775-2018-18-3-331-335
Cite this article as:
Parshina V. V., Dyatlova Yu. A., Tugarova A. V. Fourier Transform Infrared Spectroscopic Analysis of Poly-3-Hydroxybutyrate Accumulation by Azospirillum brasilense Cells at Various Cultivation Periods and Ammonium Concentrations in the Culture Medium. Izv. Saratov Univ. (N. S.), Ser. Chemistry. Biology. Ecology, 2018, vol. 18, iss. 3, pp. 331-335 (in Russian). DOI: 10.18500/1816-9775-2018-18-3-331-335
