CC BY
34
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МЕДИЦИНА___________
УДК 616-092:[615.9:579.842.23]:591.81.:591.81.:591.85]-092.9(045)
Г. А. Афанасьева, Н. П. Чеснокова, И. А. Будник
О ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЙ ЗНАЧИМОСТИ АКТИВАЦИИ ПРОЦЕССОВ ЛИПОПЕРОКСИДАЦИИ В МЕХАНИЗМАХ НАРУШЕНИЯ РЕОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ КРОВИ ПРИ БАКТЕРИАЛЬНОМ ЭНДОТОКСИКОЗЕ
В статье представлены результаты исследования нарушений вязкостных свойств крови при различных скоростях сдвига в динамике экспериментальной чумной интоксикации различной степени тяжести, достигаемой использованием эндотоксина в дозах, эквивалентных ЛД25 и ЛД50. Установлена корреляционная взаимосвязь между интенсификацией процессов липопероксидации, степенью выраженности аутоинтоксикации и изменением интегративных показателей состояния реологических свойств крови экспериментальных животных.
В механизмах развития чумной инфекции и интоксикации важнейшая роль должна быть отведена комплексу факторов патогенности У.ре8Й8: эндотоксина, «мышиного» токсина, ферментов чумного микроба (гиалуронидазы, нейраминидазы, фибринолизина, фосфолипазы, коагулазы, альдолазы, гемолизина и др.) [1-3].
Как известно, ведущая роль в патогенезе чумы принадлежит эндотоксину У.ре8Й8, высокореактогенным компонентом которого является липопо-лисахарид (ЛПС).
Анализ литературных данных свидетельствует о множественности возможных клеточных акцепторов чумного ЛПС [4]. Рецепция эндотоксина носит неспецифический характер и обеспечивается, в частности, клетками крови и эндотелием сосудов, инициируя активацию внешнего и внутреннего механизмов формирования протромбиназы [5].
Закономерным проявлением патогенного воздействия ЛПС на макроорганизм являются расстройства системной гемодинамики, регионарного кровотока, микроциркуляции. Последние обусловливают развитие циркуляторной гипоксии с формированием стереотипного комплекса структурной и функциональной дезорганизации клеток и субклеточных структур, в частности набухания митохондрий, повышения проницаемости биомембран и т.д. [6]. Как известно, в условиях набухания митохондрий возникает возможность одно- и трехэлектронного восстановления кислорода в связи с утечкой электронов из дыхательной цепи. Последнее приводит к образованию высокоре-актогенных активных форм кислорода, обладающих способностью индуцировать процессы липопероксидации в биологических мембранах [6, 7] .
Между тем до настоящего момента отсутствуют систематизированные данные о патогенетической значимости избыточного образования свободных
радикалов в динамике чумной интоксикации и их дестабилизирующем системном воздействии на сосудистые стенки и клетки крови.
В данной работе впервые предпринята попытка изучения состояния процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в динамике чумной ЛПС-интоксикации по интегративным показателям содержания в крови гидроперекисей липидов (ГПЛ) и малонового диальдегида (МДА).
Целью настоящей работы явилось исследование характера нарушений процессов липопероксидации в динамике чумной ЛПС-интоксикации различной степени тяжести, а также установление взаимосвязи между интенсификацией ПОЛ, степенью выраженности аутоинтоксикации и изменением интегративных показателей состояния реологических свойств крови при различных скоростях сдвига.
1. Методика исследования
В работе использованы варианты моделирования чумной интоксикации, достигаемые внутрибрюшинным введением беспородным белым мышам обоего пола массой 18-20 г фракции ЛПС эндотоксина чумного микроба вакцинного штамма ЕВ в дозах, эквивалентных ЛД25 и ЛД50. Токсин приготовлен в ФГУЗ «Российский НИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора.
Как известно, ЛПС чумного микроба обладает многочисленными биологическими эффектами, свойственными эндотоксинам других грамотрица-тельных бактерий, хотя и уступает им по выраженности летального эффекта [8-10]. В связи с этим несомненна значимость проводимых нами экспериментальных исследований по проблемам патогенеза чумной ЛПС-интоксикации.
Исследования проведены в динамике интоксикации: легкой и среднетяжелой форм патологии, которые развивались соответственно спустя 1,5-2 и 4 ч после внутрибрюшинного введения эндотоксина экспериментальным животным.
Для оценки состояния активности процессов ПОЛ и степени аутоинтоксикации исследовали концентрации ГПЛ и МДА в плазме крови и эритроцитах крови, а также молекул средней массы (МСМ) в сыворотке крови общепринятыми спектрофотометрическими методами [11-13].
В работе использован анализатор крови реологический (АКР-2, АОЗТ «Мелт», Россия) - ротационный реометр с дискретной установкой скоростей сдвига, в котором реализуется вискозиметрическое Куэттовское течение для определения внутреннего трения жидкости, позволяющий определить вязкость крови при возрастающих скоростях сдвига. Вязкость крови (д) - коэффициент, характеризующий сопротивление жидкости сдвигу - измерялась в миллипаскаль-секундах (мПа-с) (1 мПа-с = 1 сантипуаз), где Па или Н/м2 -напряжение сдвига.
Индекс агрегации эритроцитов (ИАЭ) рассчитывался как
ИАЭ = д (10 с"1) / д (100 с"1),
что основано на положении о том, что вязкость крови в диапазоне 5-100 с-1 зависит, главным образом, от агрегации/дезагрегации эритроцитов.
Индекс деформируемости эритроцитов (ИДЭ):
ИДЭ = д (100 с-1) / д (300 с-1),
что основано на положении о том, что вязкость крови в диапазоне 100-300 с-1 зависит, главным образом, от деформируемости («жесткости») эритроцитов, т.е. их способности адаптироваться к силам, действующим в потоке текущей крови [14].
Оценка состояния реологических свойств крови проведена при различных скоростях сдвига (от 5 до 300 с-1), что позволило в определенной степени экстраполировать результаты проведенных нами исследований на состояние вязкостных свойств крови в различных отделах сосудистого русла с различной скоростью кровотока в них [14].
2. Результаты исследования
При изучении показателей активности процессов ПОЛ на модели интоксикации, достигаемой введением ЛПС в дозе, эквивалентной ЛД25, уже спустя 1,5-2 ч после введения токсина выявлено накопление ГПЛ (р < 0,001) и МДА (р < 0,001) в эритроцитарной массе. Указанный период наблюдения характеризовался незначительной адинамией экспериментальных животных.
Накопление продуктов липопероксидации в эритроцитах сопровождалось снижением вязкостных свойств крови на средних и высоких скоростях сдвига (р < 0,001) (рис. 1).
Н------1-----1-----1-----1-----1-----1-----1-----1
0 5 10 20 50 100 150 200 300
Скорость сдвига, с1
Рис. 1 Влияние различных доз чумного липополисахарида на показатели вязкости крови в динамике интоксикации
В целях уточнения молекулярно-клеточных механизмов структурной дезорганизации эритроцитарных мембран и их роли в снижении вязкостных свойств крови на стадии среднетяжелых клинических проявлений изучаемой патологии, т.е. спустя 4 ч с момента внутрибрюшинного введения ЛПС чумного микроба, были проведены эксперименты по изучению процессов ПОЛ в эритроцитарной массе. Указанный период наблюдения характеризовался адинамией, развитием единичных летальных исходов, прогрессирующим накоплением МСМ в сыворотке крови (р < 0,001) экспериментальных животных. Как оказалось, утяжеление клинических проявлений патологии коррелировало как с активацией процессов ЛПО, что подтверждалось прогрессирующим накоплением ГПЛ и МДА в плазме крови и в эритроцитах экспери-
ментальных животных (р < 0,001), а также со снижением вязкостных свойств крови при низких, средних и высоких скоростях сдвига (р < 0,001) (см. рис. 1). Одновременно отмечено прогрессирующее снижение индексов деформируемости и агрегации эритроцитов (р < 0,001).
Анализируя механизмы выявленного нами феномена снижения вязкостных свойств крови при низких скоростях сдвига в период выраженных клинических проявлений патологии, следует отметить, что в этом варианте моделирования характера кровотока важнейшая роль в формировании вязкости крови отводится высокомолекулярным острофазным белкам и полисахаридам, снижающим суммарный дзета-потенциал эритроцитов, способствующим образованию адгезивных мостиков между эритроцитами. Из всех плазменных белков наибольшее влияние на вязкость крови оказывает фибриноген [14].
В связи с этим очевидно, что одним из ведущих факторов обнаруженного нами снижения вязкостных свойств крови при низких скоростях сдвига может быть уменьшение концентрации фибриногена в плазме крови. Основанием для подобного заключения являются представленные ранее данные относительно резкого истощения содержания фибриногена и нарастания уровня продуктов паракоагуляции в крови при чумной интоксикации, достигаемой введением аутолизата У.ре8Й8 вакцинного штамма ЕУ [15].
В то же время общеизвестно, что вязкостные свойства крови при высоких скоростях сдвига в значительной степени определяются не только количеством эритроцитов, но и состоянием структуры их мембран, способностью эритроцитов к адгезии, агрегации и деформируемости. В связи с этим не исключено, что выявленное нами снижение вязкости крови при средних и высоких скоростях сдвига на легкой и среднетяжелой стадиях интоксикации связано с дезорганизацией структуры эритроцитарных мембран в условиях активации процессов ПОЛ и накопления продуктов липопероксидации.
Целью последующих исследований явилось установление дозозависимых эффектов чумного ЛПС на состояние процессов липопероксидации и реологических свойств крови. Для решения поставленной задачи моделирование чумной интоксикации достигалось внутрибрюшинным введением ЛПС в дозе, эквивалентной ЛД50. Исследования проведены в сроки, аналогичные таковым в экспериментах, с использованием токсина в дозе ЛД25, т.е. спустя 1,5-2 и 4 ч после введения ЛПС экспериментальным животным.
В указанной модификации опытов спустя 1,5-2 ч с момента введения токсина, т.е. на стадии легких клинических проявлений патологии, отмечено прогрессирующее возрастание уровней ГПЛ и МДА в плазме крови (р < 0,001) и в эритроцитах (р < 0,001), а также МСМ в сыворотке крови экспериментальных белых мышей (р < 0,001), по сравнению с таковыми показателями группы контроля и соответствующего периода интоксикации, достигаемой введением ЛПС в дозе, эквивалентной ЛД25. Активация процессов ПОЛ сочеталась со снижением вязкости крови при всех скоростях сдвига (р < 0,001) (см. рис. 1) и индексов деформируемости и агрегации эритроцитов (р < 0,001).
Аналогичная закономерность накопления продуктов липопероксидации в плазме крови и эритроцитах, сочетающаяся со снижением вязкостных свойств крови на всех скоростях сдвига (р < 0,001) (см. рис. 1) была выявлена и на стадии среднетяжелых клинических проявлений интоксикации спустя 4 ч после введения токсина экспериментальным животным. Одновременно
отмечалось прогрессирующее накопление МСМ (р < 0,001) по мере утяжеления клинических проявлений интоксикации.
Таким образом, в различных вариантах моделирования чумной интоксикации с использованием ЛПС в дозах, эквивалентных ЛД25 и ЛД50, выявлена общая закономерность накопления продуктов ПОЛ и снижения реологических свойств крови, индексов деформируемости и агрегации эритроцитов при различных скоростях сдвига, коррелирующая с тяжестью течения изучаемой патологии.
Полученные нами результаты позволяют заключить, что к числу ведущих патогенетических факторов расстройств регионарного кровотока и микроциркуляции при чумной интоксикации, индуцируемой ЛПС Y.pestis, относятся снижение реологических свойств крови при различных скоростях сдвига, индексов деформируемости и агрегации эритроцитов, коррелирующее с тяжестью клинических проявлений патологии. Эфферентным звеном цитопа-тогенных эффектов ЛПС чумного микроба является дозозависимая активация свободно-радикального окисления, о чем свидетельствует чрезмерное накопление продуктов ПОЛ в плазме крови и эритроцитах экспериментальных животных в динамике чумной интоксикации различной степени тяжести. Активация процессов ПОЛ, выявленная в динамике различных моделей чумной интоксикации, коррелирует со степенью выраженности аутоинтоксикации и снижением вязкостных свойств крови у экспериментальных животных при различных скоростях сдвига в динамике чумной ЛПС-интоксикации.
Список литературы
1. Анисимов, А. Н. Факторы Y.pestis, обеспечивающие циркуляцию и сохранение возбудителя чумы в экосистемах природных очагов. Сообщение 1 / А. Н. Анисимов // Молекулярная генетика, микробиол. и вирусол. - 2002. - № 3. - С. 3-23.
2. Евлахова, С. П. Протеазы, протеаза чумного микроба, очистка, характеристика. Y.pestis, штамм ЕВ 76 / С. П. Евлахова, Б. Н. Мишанькин // Биотехнология. -1994. - № 8. - С. 21-24.
3. Whitby, M. Biologicfl agents as weapons 2: anthrax and plague / M. Whitby, T. Ruff, A. C. Street [et al.] // Med. J. Austral. - 2002. - Vol. 176 (12). - P. 605-608.
4. Гусева, Н. П. ЛПС чумного микроба как индуктор апоптоза лимфоцитов крови и перитонеальных макрофагов / Н. П. Гусева, А. Л. Кравцов, М. Н. Киреев // Проблемы особо опасных инфекций : сб. науч. тр. - Вып. 86. - Саратов, 2003. - С. 117-123.
5. Tapper, H. Modulation of hemostasis mechanisms in bacterial infections diseases / Н. Tapper, Н. Herwald // Blood. - 2000. - Vol. 96. - № 7. - Р. 2329-2337.
6. Скулачев, В. П. Явления запрограммированной смерти. Митохондрии, клетки и органы: роль активных форм кислорода / В. П. Скулачев // Соровский Образовательный Журнал. - 2001. - Т. 7. - № 6. - С. 4-10.
7. Ленинджер, А. Молекулярные основы структуры и функции клетки. Биохимия / А. Ленинджер. - М. : Мир, 1999. - С. 390-422.
8. Домарадский, И. В. Чума / И. В. Домарадский. - М. : Медицина, 1998. -С. 33-34.
9. Наумов, А. В. Иммунология чумы / А. В. Наумов, М. Ю. Ледванов, И. Г. Дроздов. - Саратов, 1992. - С. 19-22.
10. Сварваль, А. В. Липополисахарид иерсиний и его биологическая активность /
А. В. Сварваль, Г. Я. Ценева, О. А. Шендерович // Журн. микробиол. - 2006. -№ 3. - С. 100-104.
11. Гаврилов, В. Б. Спектрофотометрическое определение содержания гидроперекисей липидов в плазме крови / В. Б. Гаврилов, М. И. Мишкорудная // Лаб. дело. - 1983. - № 3. - С. 33-35.
12. Суплотов, С. Н. Суточные и сезонные ритмы перекисей липидов и активности супероксиддисмутазы в эритроцитах жителей средних широт и крайнего Севера / С. Н. Суплотов, Э. Н. Баркова // Лаб. дело. - 1986. - № 8. - С. 459-463.
13. Гудим, В. И. Средние молекулы как уремические токсины (состояние вопроса) /
В. И. Гудим, Н. И. Габриэлян // Лаб. дело. - 1985. - № 13. - С. 145-153.
14. Ройтман, Е. В. Термины, понятия и подходы к исследованиям реологии крови в клинике / Е. В. Ройтман, Н. Н. Фирсов, М. Г. Дементьева [и др.] // Тромбоз, гемостаз и реология. - 2000. - № 3 (3). - С. 5-12.
15. Понукалина, Е. В. Патогенез геморрагического синдрома при чумной интоксикации / Е. В. Понукалина, Г. Н. Маслякова, В. И. Ковалев [и др.]. - Саратов,
1990. - С. 9-20.
