CC BY
117
НАСИБУЛЛИН Р.С., УСМАНОВА С.И., СЕТЧЕНКОВ М.С., АФАНАСЬЕВА Ю.Г., ФАХРЕТДИНОВА Е.Р.
УДК 539.1:577.127:547.972
О МОЛЕКУЛЯРНОМ МЕХАНИЗМЕ БИОАКТИВНОСТИ РУТИНА
НАСИБУЛЛИН Р.С., УСМАНОВА СИ., СЕТЧЕНКОВ М.С., АФАНАСЬЕВА Ю.Г., ФАХРЕТДИНОВА Е.Р.
Башкирский государственный медицинский университет, Россия, Уфа, med-fis@yandex.ru
АННОТАЦИЯ. В настоящей работе представлены результаты исследований взаимодействия молекул группы флавоноидов и клеточного фосфатидилхолина. Методами квантовой химии и 13С ЯМР спектроскопии показано образование комплекса рутин-фосфатидилхолин. Определены структурные параметры комплекса, исследованы электронное строение и конформационное состояние взаимодействующих молекул.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: квантово-химические расчеты, п-система электронов, 13С ЯМР спектроскопия, химический сдвиг, клеточный фосфатидилхолин, флавоноиды, рутин.
Флавоноиды широко распространены в природе и охватывают большую группу биологически активных соединений растительного происхождения, включающую флавоны, флавонолы, флаваноны и их производные. Основу флавонов составляет у-пироновое кольцо в виде фенилбензопирона, в котором различные водородные атомы замещены на фенольные гидроксильные группы. Вещества флавоноидной структуры имеют относительно высокий уровень биологической активности. Молекула флавоноида содержит гидроксильные и карбонильные группы, наличие которых предполагает подобную активность [1]. Особый интерес к флавоноидам основывается на их влиянии на проницаемость капилляров, но механизм этого межмолекулярного действия до сих пор еще мало понятен.
H[23] °[17] °[19]
н[32] с;3]'"' |[4] С[б] H[25] \|[5] ^СЫ В 11 A I
°[22] С- н[=»]/ ^С[13] -С[11]' c[2i JC™ .1
с
С[14] ,С[16] °[21] |[15] H[27]
■-н[28]
|[30 |[29]
H[26]
_I [52]
H [58] \[29] h[56]
H[53] oM-C[27] У62'
H /I '¡3v °[321
C[23] H H[61] >[28] ' H н[5У|[57]
| / H[57]
H[59]_C[30]_
/
H[60]
\
\
°[40] |[36]-
/
°[42]
°[24]-
^н^хг
C[34] H[70]i NC;39i ix н[бн:ьС[41]/| -O[33\ H C ' °[43]
°[35]_C[37] \
H[73]
|[65]
°;17] J»
~\[18]
I
°[22] ^CL4] „o[|] .H[44]
H[48] ^C[5]' ^C[7]'
I II MI A I
C;ii] C[2] C[io] С"' ^ ^ ~ C ---- — —•>C
C;i5] \C;ii^ \°;i]
I с ||
c[i4L
C[i2]
C;9] ^°[i9] H;45]
,[50]
C[13] °;20]
_|[46]
,[51]-
кверцетин рутин
Рис.1. Структуры исследуемых молекул
H
н
н
Существуют заметные различия в физических и фармакологических свойствах между разными химическими группами флавоноидов. Более неожиданными оказываются такие различия в пределах отдельной группы. Например, 3,5,7,3',4'-пентаоксифлавон (кверцетин) и 5,7,3',4'-тетраоксифлавон-3-рутинозид (рутин). Их отличие в том, что кверцетин содержит в положении С[3] оксигруппу, тогда как рутин является рамноглюкозидом кверцетина (рис.1).
h
[138]
h
[139]
,[140]
h[134]
H[132] ^C[2] ■
h
[1 33]
c[4]'
,n'1]-I
c[5]h2
c[3]-
4
h
[137]
h
[135]
h
[136]
o
[13] .
o[10].
I,
c[7]h2
■o[14]
В предыдущих работах было исследовано комплексообразование кверцетина [2] и рутина [3] с фосфатидилхолином.
В работах [4, 5] было показано образование комплексов с участием п-систем гетероциклов молекул биологически активных веществ с холиновой группой фосфатидилхолина. В настоящей работе представлены результаты исследований по изучению влияния рутинозида на конформацию и электронное строение фосфатидилхолина (рис.2), структурообразующей молекулой клеточных мембран по сравнению с агликоном рутина - кверцетином. Для исследования различий в механизме проявления биоактивных свойств данных флавоноидов были проведены квантово-химические расчеты методами МКОО и АМ1 с использованием градиента Ро1ак-ШЫеге [6], предварительные расчеты проводились методом молекулярной механики ММ+ [7].
Для поиска геометрического строения комплекса оптимизация проводилась из разных начальных точек, сравнивая значения энергии в точках различных локальных экстремумов для отыскания глобального минимума энергии комплексообразования, т. е. наиболее устойчивого состояния молекулярных систем.
При образовании комплекса происходит перераспределение зарядов во взаимодействующих молекулах (табл.1). Наибольшие изменения электронной плотности наблюдаются в холиновой группе фосфатидилхолина в комплексе с кверцетином и в фосфатной группе фосфатидилхолина при комплексообразовании с рутином. Результаты расчетов методом МЖОО практически совпадают с данными метода АМ1. Рассчитанные данные показывают, что комплексы формируются за счет кулоновского взаимодействия, вызванного переносом некоторой части заряда между составляющими комплекса.
o
[15]
h2c I
0
1
o =c
[32]
I
ch
I
ch
I
0
1
c
[23]
I I
(ch2)16(ch2)7
ch3
I
ch
II
ch
I
(ch2)7
I
ch3
Рис. 2. Фосфатидилхолин
Таблица 1
Изменение электронной плотности по результатам метода АМ1 в комплексе, а.е.
фосфатидилхолин в комплексе с кверцетин рутин
N[1] кверцетином рутином C[2] C[2]
0,002 0,002 -0,076 -0,029
C[3] -0,002 -0,004 C[3] 0,053 C[3] 0,032
н[133] -0,013 -0,007 C[11] 0,016 C[11] 0,010
н[134] 0,023 0,007 C[12] -0,028 C[12] -0,033
Н[135] -0,020 -0,011 C[13] -0,017 C[13] -0,021
C[4] 0,001 -0,004 C[14] -0,017 C[14] 0,004
O[10] 0,003 0,004 C[16] -0,010 C[16] 0,010
р[12] 0,025 -0,003 H[23] 0,050 C[23] -0,035
O[13] -0,028 0,025 O[17] 0,007 O[17] -0,056
O[14] -0,013 -0,040 O[19] -0,030 O[18] -0,056
H[24] 0,070 O[19] -0,021
H[26] -0,007 H[50] 0,059
Полученные результаты свидетельствуют о том, что для изучаемого комплекса характерно изменение распределения электронов в ^-электронной системе пирокатехинового кольца и связанных с ним атомах водорода (табл.2), ^ орбитали практически не участвуют в формировании комплекса.
НАСИБУЛЛИН Р.С., УСМАНОВА С.И., СЕТЧЕНКОВ М.С., АФАНАСЬЕВА Ю.Г., ФАХРЕТДИНОВА Е.Р.
Таблица 2
Изменение заселенности внешних электронных орбиталей биоактивных молекул
атом кверцетин рутин
s 0,003 0,002
c[11] Px 0,107 -0,019
Py 0,010 -0,057
Pz -0,135 0,058
s 0,003 -0,002
C[12] Px 0,050 -0,004
Py 0,064 0,009
Pz -0,088 0,019
s 0,002 0,000
C[13] Px 0,097 0,012
Py 0,012 -0,111
Pz -0,094 0,130
s 0,001 0,001
C[14] Px 0,160 -0,020
Py 0,016 -0,022
Pz -0,160 0,036
s 0,001 0,002
C[15] Px 0,063 -0,010
Py 0,046 -0,076
Pz -0,115 0,017
s 0,003 0,001
C[16] Px 0,064 -0,014
Py -0,020 0,029
Pz -0,037 -0,034
Энергия комплексообразования фосфатидилхолина с кверцетином 13,6 ккал/моль с молекулой рутина 17,1 ккал/моль. Расстояние от центра кольца С кверцетина до атома азота фосфатидилхолина составляет 4,6 А, от центра кольца рутина - 4,9 А. Площадь поперечного
[23] [321
сечения фосфатидилхолина уровне атомов С[ 1 и С[ 1 в 1,2 раза больше, чем в комплексе с кверцетином. Значительные изменения наблюдаются и в геометрии биоактивных молекул (табл.3). В обоих комплексах происходит вращение кольца С относительно криволинейной плоскости колец А и В, огибающих фосфатную группу фосфатидилхолина. Длины связи в комплексе с кверцетином Н[23]-0[14] 2,04А, Н[24]-0[13] 2,16 А. В комплексе с рутином Н[50]-О[13] 2,05 А, Н[58]-0[14] 2,96 А.
Таблица 3
Конформационные изменения исследуемых молекул при комплексообразовании
двугранный угол кверцетин рутин
C[3]-C[2]-C[u]-C[16] c[2]-o[1]-c[10]-c[9] C[3]-C[4]-C[5]-C[6] C[2]-C[3]-C[4]-O[17] 19° 14° 18° 16° 10° (C[2]-C[3]-O[18]-H[23]) 157° (C[5]-C[6]-O[19]-H[24]) 24° 9° 2° 1° 7° (C[2]-C[3]-O[22]-H[23]) 171° (C[5]-C[6]-O[18]-H[49])
фосфатидилхолин
n[1]-c[5]-c[7]-o[10] -5° -5°
Спектры ЯМР фосфатидилхолина и комплекса рутин-фосфатидилхолин записывались при температуре 30оС на спектрометре АМ-300 (Bruker ФРГ) с рабочей частотой на ядрах 13С 75 МГц. Температура исследуемых препаратов поддерживалась с точностью 0,2оС. Спектры
13
С регистрировались с помощью стандартных методик, имеющихся в спектрометре АМ-300. Длительность импульса составляла 45°, задержка между ними - 1,5 сек. Число накоплений достигало 20000. Такое количество накоплений обеспечивало соотношение сигнал/шум не меньше 50. Накопление проводилось на 64-128 к точек с шириной развертки 100 -150 м.д. При ширине развертки 100 м.д. на 128 к точек, времени выборки 8,65 с. получается цифровое разрешение 0,06 Гц. В этих условиях значение химического сдвига (ХС) определяется с точностью до 0,001 м.д. На основании усреднения полученных по нескольким измерениям ХС, можно сделать вывод о том, что точность определения ХС не хуже 0,05 м.д.
Образцы фосфатидилхолина были выделены из куриных яиц методом, предложенным в работе [8], которые подвергались очистке методом колоночной хроматографии. Чистота контролировалась по спектрам ядерного магнитного резонанса и методами тонкослойной хроматографии. Спектры 13С ЯМР снимались при концентрациях 0,001 М фосфатидилхолина, концентрация биопрепаратов менялась. В качестве растворителя использовался дейтерохлороформ. Значение pD среды поддерживалось постоянным и равным 7,1, что контролировалось с помощью прибора ОР-156/3 (МОМ, Венгрия), обеспечивая точность измерений 0,01.Малые концентрации приводят к возрастанию времени накопления сигналов, увеличение концентрации вызывает расширение линии поглощения из-за образующихся мицелл, что снижает точность измерения химических сдвигов. Одновременно при увеличении концентрации уменьшается число центров связывания биопрепаратов, так как они оказываются внутри мицелл, что приводит к уменьшению интенсивности спектральных линий. Концентрация биопрепарата также должна быть достаточно низкой. При увеличении концентрации некоторые из них образуют цепочечные структуры через водородные связи, усложняющие анализ спектров. При принятых концентрациях плато кривой титрования не достигалось. При образовании комплекса возникают изменения ХС от углеродов холиновой группы фосфатидилхолина от C[4] равный 53,23 м.д. у свободного лецитина смещается в слабое поле. При образовании комплекса с рутином на 1,416 м.д., одновременно наблюдается изменение химического сдвига от С[7] примыкающего к фосфатной группе фосфатидилхолина в сторону сильного поля на 1,318 м.д., что показывает образование комплекса, сопровождающееся взаимодействием гидроксильной группы
o[19]-h'50] с фосфатной группой фосфатидилхолина. Использованные методы передают качественную картину и в нашем случае показали, что данный комплекс формируется за счет кулоновского взаимодействия, которое характеризуется перераспределением части заряда между компонентами комплекса.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Запрометов М.Н. Биофлавоноиды и проницаемость капилляров // М., 1957. С.23-24.
2. Насибуллин Р.С., Никитина Т.И., Афанасьева Ю.Г., Насибуллин Т.Р., Спирихин Л.В. // Хим.-фарм. журнал. 2002. Т.36. № 9. С.33-36.
3. Структура и динамика молекулярных систем / сб. статей. Вып. XIII, Ч II. Уфа: ИФМиК УНЦ РАН, 2006. С. 208-211.
4. Nasibulin R.S., Ponomareva V.A., Spirikhin L.V. // Biol. Mem., 1992. V.6, № 3. Р.407-412.
5. Nasibulin R.S., Sultanov A.S., Zagitov G.N., Zeleyev M. Kh. // Biophysics, 1993. V.38, № 4. Р.707-709.
6. Fletcher R. Methods of optimization. N.Y. John Wiley & Sons, 1980. Р.45.
7. Allen M.P., Tidesley D.J. Computer simulation of liquids // Oxford: Clarendon Press, 1987. Р.89-94.
8. Fletcher R. // N.Y. John Wiley & Sons, 1980. Р. 45.
SUMMARY. The study results of the interaction of flavonoid group molecules and cellular phosphatidilcholine are presented in the paper. Formation of a rutine - phosphatidilcholine complex is shown using the methods of quantum chemistry and 13C NMR spectroscopy. Structural parameters of a complex have been determined. The electronic structure and conformational condition of interacting molecules have been investigated.
