CC BY
24желтухи. — Изд-во Красноярского ун-та, 1990. — 108 с.
9. Рахманин Ю.А., Кушнерёва Н.Ф., Булатов А.Е. Состояние липидного обмена у лиц, употреб-
ляющих алкоголь в быту // Гигиена и санитария, 1991. - № 2. - С. 69-70.
Материал поступил в редакцию 17.09.08.
V.K. Makarov, D.S. Ryasenskii
ASSESSMENT OF EFFECTS PRODUCED BY TAKING IN POLYMETHYLENEGUANIDINE HYDROCHLORIDE ON LIPID COMPOSITION OF BLOOD SERUM
All-Russian Scientific Centre for Safety of Biologically Active Substances,Staraya Kupavna, Moscow Region
Tver State Medical Academy
A lipid spectrum of blood serum was studied in 52 healthy persons and in 62 patients suffering from toxic hepatitis caused by taking in alcohol-containing household cleaning products having polymethyleneguanidine hydrochloride in their composition. It was shown that household cleaning products containing polymethyleneguanidine hydrochloride induce toxic hepatitis followed by significant disturbances of lipid metabolism.
УКД 612.014.2.014.46:546.3
А.Р. Гутникова1, К.О. Махмудов1, Б.А. Саидханов1, О.Д. Таджикулова2, Н.А. Эргашев2,
М.И. Асраров2, И.В. Косникова1
О МЕМБРАНОТРОПНОМ ДЕЙСТВИИ СОЛЕЙ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ И ОСНОВНЫХ ПУТЯХ ЕГО КОРРЕКЦИИ
Республиканский специализированный центр хирургии им. акад. В. Вахидова Минздрава РУз 2Институт физиологии и биофизики АН РУз, Ташкент, Республика Узбекистан
В экспериментах на крысах показано, что основными факторами цитотоксического действия комбинации металлов (медь, марганец, молибден, хром) являются активация ПОЛ и развитие мембранопатологического процесса с нарушение целостности мембранных структур. Курс энтеросорбции пектиновым сорбентом в сочетании с ан-тиоксидантным препаратом «Гепамал» обеспечивает коррекцию последствий токсического воздействия тяжелых металлов.
Ключевые слова: мембранотропное действие, гепамал, соли тяжелых металлов, цитрусовый пектин.
Введение. Среди химических веществ, относящихся к числу глобальных загрязнителей внешней среды, тяжелые металлы образуют особую группу антропогенных токсикантов, во многом определяющих неблагоприятную экологическую обстановку и рост заболеваемости в промышленно развитых районах [11, 14]. Трудности оценки степени риска их воздействия на организм человека связаны с тем, что в реальной жизни приходится сталкиваться с воздействием не одного какого-то токсического вещества, а смеси соединений тяжелых металлов самого различного состава, специфичных для каждого региона, с присущими им синергичными и
антагонистичными свойствами и особенностями взаимодействия [5, 7, 8].
Многочисленными исследованиями показано, что в основе токсического действия соединений тяжелых металлов лежит повреждение клеток, сопровождающееся их структурно-функциональными изменениями, и, прежде всего, нарушением структуры и функции мембран, обусловленное блокированием функционально активных групп белковых ферментов и структурных белков [1, 2, 10, 19-21].
В условиях воздействия экотоксикантов первым органом-мишенью является печень, в которой происходит обезвреживание поступивших в
организм ксенобиотиков, а основным индикатором функционального состояния клеток, наиболее чувствительным к агрессии, можно считать митохондрии [17, 18, 23, 24]. В обычных условиях внутренняя мембрана митохондрий непроницаема для заряженных частиц, поэтому увеличение их проницаемости для катионов, при которой усиливается их перенос внутрь, служит объективным критерием повреждения митохондрий [9, 12]. С учетом изложенного, необходимо дальнейшее изучение влияния солей тяжелых металлов на мембранные структуры клетки. Это не только расширит знание патогенетических механизмов их патологического действия на организм, но и позволит разработать адекватные методы лечения [15, 22].
Цель исследования: изучить влияние композиционной смеси, состоящей из солей меди, марганца, хрома и молибдена, характерной для зоны воздействия металлургических предприятий Ташкентской области, на способность индуцировать свободно-радикальные процессы, вызывать мембранотропные эффекты и разработать пути коррекции формирующихся нарушений.
Материалы и методы исследований. Исследования выполнены на 40 половозрелых крысах породы Вистар массой 140-150 г, содержавшихся в условиях вивария на стандартном пищевом рационе, разделенных на 3 группы. 1-ая группа — соматически здоровые животные, служившие биоконтролем, 2-ая — крысы с субхроническим отравлением металлосодержащей токсической смесью, состоящей из солей меди, марганца, молибдена и хрома в дозе: CuSO4 — 60 мг/кг, KMnO4 - 11,2 мг/кг, (NH4)2MoO4 -10 мг/кг, K2Cr2O7 — 1,19 мг/кг массы тела. Смесь вводили через день внутрибрюшинно на протяжении 4 недель. Соотношение металлов в комбинации соответствовало среднему соотношению в почвах в районе Алмалыкского горно-металлургического комбината. 3-я группа — животные, после моделирования патологического процесса, в течение 3-х недель проходили курс сочетанной энтеросорбционной и ан-тиоксидантной терапии. Энтеросорбцию осуществляли цитрусовым пектином. Сорбент животные получали ежедневно per os в дозе 0,5 г на 100 г массы тела животного. В качестве ан-тиоксидантного средства использовали препарат «Гепамал», представляющий собой масляный экстракт из фитосбора, состоящего из цветков бессмертника, пижмы обыкновенной и плодов шиповника, который вводился per os
через 3 ч после сорбента один раз в день в дозе 1 мл/100 г массы тела. После завершения курса терапии животных взвешивали, затем умерщвляли мгновенной декапитацией с целью забора крови и ткани печени для дальнейших исследований. Об эффективности проведенного лечения судили по изменению основных показателей ПОЛ, активности трансаминаз в крови и ткани печени и состоянию проницаемости мембран митохондрий печени крыс.
Митохондрии печени крыс выделяли методом дифференциального центрифугирования [13]. Среда выделения содержала: 250 мМ сахароза, 10 мМ трис-хлорид, 1 мМ ЭДТА, рН 7,4. Пассивную проницаемость внутренней мембраны митохондрий для различных ионов исследовали методом Брайерли [16] на фотометре ЛМФ-69 путем регистрации изменения оптической плотности суспензии митохондрий при 540 нм. Определяли кинетику набухания деэнерги-зованных митохондрий в изоосмотических растворах нитратов соответствующих катионов, за-буференных 10 мМ трис-нитратом, рН 7,4 и содержащих ингибитор дыхательной цепи — роте-нон. Для оценки протонной проводимости использовали изоосмотический раствор нитрата аммония. Содержание белка в суспензии митохондрий определяли колориметрически биуре-товым методом. Статистическую достоверность различий определяли по критерию 1 Стьюдента. Каждое значение, представленное в таблице или графически, является средним результатом минимум 15-ти идентичных измерений.
Результаты и обсуждение. В результате проведенных исследований установлено, что введение испытуемым животным токсиканта приводит к резкому ухудшению соматического статуса животных. Сопровождается значительным снижением массы тела, в среднем на 30 %, и высокой летальностью, которая достигает 21 %. Как видно из табл., инкорпорация токсической смеси вызывала достоверное изменение всех показателей, характеризующих процессы липопе-роксидации в сыворотке крови. Так, содержание МДА увеличилось на 40 %. Активность ката-лазы и антиокислительная активность сыворотки крови, напротив, снизились на 36 и 50 %, соответственно, что указывает на истощение анти-оксидантных возможностей организма. Активность основных ферментов цитолиза увеличилась АлАТ - на 44 %, АсАТ - на 33 %. Изменение активности соответствующих ферментов в ткани печени также было выраженным: активность АлАТ возросла на 32 %, активность АсАТ
увеличилась в 1,95 раза. Все выявленные нарушения указывали на развитие синдрома пече-ночно-клеточной недостаточности. Известно, что повышение активности изучаемых ферментов в сыворотке крови может быть как следствием повреждения гепатоцитов, так и увеличением продукции ферментов тканью печени. При обратимых воспалительных процессах, характеризующихся увеличением проницаемости мембран, высвобождаются прежде всего ферменты цитозоля, т.е. АлАТ. При некротических же состояниях нарастает активность фермента, связанного с митохондриями, а именно, АсАТ. Выявленная нами динамика активности исследуемых ферментов служит косвенным доказательством нарушения целостности мембранных структур гепатоцитов и свидетельствует об истощении функциональных возможностей печени.
В дальнейшем это нашло подтверждение в экспериментах in vivo при сравнении пассивной проницаемости внутренней мембраны митохондрий печени крыс разных групп. Как видно на рис. 1-3, введение металлосодержа-щей смеси индуцирует пассивную проницаемость мембран митохондрий для ионов К+, вызывает усиление протонной проницаемости. Индукция потока одновалентных катионов, как правило, должна привести к снижению способности митохондрий к аккумуляции ионов кальция. Действительно, скорость набухания митохондрий в среде, содержащей Са2+,
снизилась. Известно, что транспорт протона и иона К+ через внутреннюю мембрану митохондрий играет важную роль при функционировании системы окислительного фосфори-лирования. Нарушение Н+, К+-проницаемо-сти мембран вызывает снижение мембранного потенциала, что, в свою очередь, закономерно приводит к нарушению энергозависимых процессов переноса веществ через мембрану и разобщению дыхания и окислительного фос-форилирования митохондрий, т.е способствует нарушению их основной функции — функции энергообразования. Изменение проницаемости мембран для ионов К+ указывает на изменение функции ЦсА-чувствительной поры митохондрий. Для уточнения этого факта, было проведено сравнение состояния ЦсА-чувствитель-ной поры митохондрий, выделенных из печени здоровых и больных животных. Действительно, амплитуда и скорость набухания митохондрий, выделенных из печени животных с субхроническим отравлением, оказалась ниже по сравнению со скоростью набухания митохондрий, выделенных из печени здоровых особей (рис. 4). Следовательно, при отравлении солями тяжелых металлов ЦсА-чувствительная пора переходит в более закрытое конформацион-ное состояние. Выявленные изменения внутренних мембран митохондрий, наблюдающиеся при интоксикации солями тяжелых металлов, вероятно, являются следствием их моди-
Таблица
Изменение основных показателей ПОЛ и ферментов цитолиза при отравлении солями металлов и
после проведения курса терапии
Показатель Контроль Комбинация металлов Р1-2 Лечение гепамал + пектиновый сорбент Р2-3, Р1-3
Масса тела, г 155±3 110+4 < 0,01 151+3 < 0,01 > 0,05
МДА, мкмоль/л 2,5±0,02 3,5+0,1 < 0,001 2,22+0,1 < 0,01 > 0,05
АОА, % 31,4±0,8 15,7+0,9 < 0,001 30,8+0,5 < 0,001 > 0,05
Каталаза, усл. ед. 16,2±0,8 10,4+0,7 < 0,01 15,7+2,4 < 0,05 > 0,05
Активность АсАТ, Е/л 194±10,7 258+25 < 0,05 180,2+4,5 < 0,001 > 0,05
Активность АлАТ, Е/л 63,3±2,8 91,0+6,7 < 0,02 50,3+3,4 < 0,02 < 0,05
Активность в ткани печени: АсАТ, Е/г АлАТ, Е/г 200+27 389+35 < 0,02 267+14 < 0,05 < 0,05
300+27 611+30 < 0,05 333+41 < 0,01 > 0,05
0,71 0,66 0,61 0,56
А540
0 1 2 3 4 5
Рис. 1. Кинетика набухания деэнергизованных митохондрий печени крыс в NH4NO3
Здесь и на рис. 2-4: по оси Х - время эксперимента, в минутах, по оси У - величина экстинции при 540 нм ф - здоровые (интактная гр. на рис. 2, 4), ■ - затравка, ▲ - после лечения * - степень достоверности р <0,05
0,7 0,68 0,66 0,64 0,62 0,6
А540
0
1
Рис. 2. Кинетика набухания деэнергизованных митохондрий печени крыс в КNO3
фикации из-за активации ПОЛ. Именно про-оксидантная активность солей тяжелых металлов является инициатором выявленных мем-бранотоксических эффектов.
Результаты проведенного исследования свидетельствуют, что в основе механизма токсического действия исследуемой металлосодержа-щей смеси на организм животных лежит активация процессов липоперексидации, обусловливающих дальнейшее нарушение барьерных свойств внутренних мембран митохондрий.
С учетом полученных результатов необходимо было подобрать адекватную схему лечения. Очевидно, что в этих условиях патогенетическая терапия должна быть направлена на уменьшение цитотоксических эффектов тяжелых металлов [4]. И добиться этого возможно с помощью комплекса мероприятий, обладающих разными механизмами протекторного действия, способных снизить токсическую нагрузку путем извлечения инкорпорированного токсического агента и в то же время оказать мембраностабилизи-рующий эффект, прежде всего, с помощью естественных антиоксидантов. С этой целью нами был проведен курс сочетанной терапии, заключавшийся в применении энтеросорбента из цитрусового пектина и «Гепамала», экстракта растительного происхождения обладающего выраженными антиоксидантными свойствами. Пектиновые энтеросорбенты нашли широкое применение в терапии токсических состояний, включая отравления тяжелыми металлами. Они образуют с металлами устойчивые соединения, не абсорбирующиеся в кишечнике, обеспечивают прекращение энтерогепатической циркуляции токсичных веществ и продуктов деструкции гепатоцитов [6].
А540
А540
0,68 0,63 0,58 0,53 0,48
0 1
0
Рис. 3. Кинетика набухания деэнергизованных митохондрий печени крыс в Са(NO3)2
Рис. 4. Кинетика набухания деэнергизованных митохондрий в среде сахарозы
Сорбционные свойства пектинов в значительной степени зависят от состава и свойств пектиновых веществ (молекулярной массы и степени этерификации) [3, 25]. Нами использован сорбент с молекулярной массой 70 тысяч, степенью этерификации 50 % и содержанием карбоксильных групп 0,6 %. В результате проведенного лечения значительно улучшился соматический статус животных. Животные не только восстановили активность, но и значительно прибавили в весе, который вернулся в пределы физиологической нормы. Летальность в группе снизилась до 7 %.
Активность исследуемых ферментов цитолиза в крови и ткани печени снизилась до уровня интактных величин. Показатели, характеризующие перекисные процессы в сыворотке экспериментальных животных также восстановились в пределах физиологической нормы, т.е. нормализовался антиоксидантный статус животных, что является важным положительным прогностическим признаком, поскольку именно пере-кисное окисление является одним из основных процессов повреждения внутриклеточных мембранных структур.
Проведенный курс терапии вызвал значительные позитивные изменения и морфофунк-ционального состояния мембран митохондрий. Пассивная проницаемость внутренних мембран митохондрий для одновалентных катионов уменьшилась до уровня интактных величин, в пределах физиологической нормы восстановилась скорость переноса ионов Са2+. Скорость набухания митохондрий в среде сахарозы достоверно возросла, хотя и оставалась несколько ниже, чем у здоровых животных. Полученные результаты позволяют предположить восстановление функции ЦсА-чувствительной поры и мембранного потенциала.
В результате проведенного лечения отмечается восстановление структуры и функции мембран митохондрий печени, связанное с нормализацией барьерных свойств мембран этих ор-ганелл. Эффективность предложенного комплекса терапии обусловлена мембраностабили-зирующим эффектом, который достигается как за счет удаления токсического агента, так и путем ингибирования процесса липопероксида-ции и повышения антиоксидантного статуса организма. Пектиновый энтеросорбент и препарат «Гепамал», используемые для лечения, получены на основе натуральных растительных компонентов, безопасных для организма. Поэтому данный комплекс может быть рекомендован для
коррекции нарушений, обусловленных воздействием солей тяжелых металлов.
Выводы. 1. Основными патогенетическими факторами цитотоксического действия соединений тяжелых металлов являются активация процесса липопероксидации с дисфункцией ан-тиоксидантной системы, обусловливающее последующее развитие мембранопатологического процесса с нарушение целостности мембранных структур.
2. Предложенный комплекс лечения, сочетающий в себе энтеросорбционную детоксика-цию с антиоксидантной терапией, основанный на использовании препаратов природного происхождения, оказывает мембраностабилизи-рующий эффект и обеспечивает коррекцию последствий токсического воздействия тяжелых металлов.
Список литературы
1. Аксенова М.Е. Тяжелые металлы: механизмы нефротоксичности // Нефрология и диализ, 2000. - Т. 2. - № 1-2.
2. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов биологических мембран. - М. Наука, 1972.
3. Иванов С.Д., Марченко М.В., Матвеев Б.Б. и др. Гематологические эффекты смеси пектина и альгината натрия при хронической интоксикации кадмием в эксперименте // Токсикологический вестник, 2000. - № 6. - С. 24-27
4. Кацнельсон Б.А., Дегтярева Т.Д., Привалова Л.И. и др. Торможение комплексом биопротекторных средств общетоксического и тиреотокси-ческого действия комбинации металлов-загрязнителей среды обитания // Токсикологический вестник, 2004. - № 2. - С. 23-29.
5. Кацнельсон Б.А., Макеев О.Г., Дегтярева Т.Д. и др. Экспериментальное испытание комплекса средств биологической защиты организма от канцерогенного действия комбинации эко-токсинов // Токсикологический вестник, 2007. -№ 3. - С. 15-20.
6. Кацнельсон Б.А., Привалова Л.И., Дегтярева Т.Д. и др. Коррекция некоторых показателей почечной функции у детей, подвергающихся экологически обусловленной экспозиции к свинцу и кадмию, в результате применения комплеса прооти-вотоксических биопрепаратов // Токсикологический вестник, 2007. - № 6. - С. 11-15.
7. Кокаева Ф. Ф. Поведение как критерий поражающего действия техногенного загрязнения среды на организм животных и эффективности мер коррекции//Автореф. дисс. ... д.б.н. - М., 2006. - 48 с.
8. Куценко С. А. Основы токсикологии //Российский биомедицинский журнал. Medline.ru, 2003. - Т. 4. - С. 119.
9. Луговской С.П., Легкоступ Л.А. Механизмы биологического действия свинца на пищеварительную систему // Совр. проблемы токсикологии, 2002. - № 2. - С. 45-50.
10. Петров В.В., Подосиновикова П.П., Кубар-ская Л.Г. и др. Вклад прооксидантного компонента в механизмы токсичности тяжелых металлов и марганца // Токсикологический вестник, 2004. -№ 1. - С. 12-15.
11. Пономарева Л.А. Здоровье окружающей среды - основа здоровья всех//М-лы науч.-прак-тич. конф. «Охрана окружающей среды и здоровье человека». - Ташкент, 2003. - С. 18-20.
12. Проданчук Н.Г., Левицкий Е.Л. Приоритетные проблемы токсикологии // Совр. проблемы токсикологии, 2001. - № 4. - С. 85-88.
13. Северин С.Е., Соловьева Г.А. Практикум по биохимии. - М.: Изд-во МГУ, 1989. - С. 403-487.
14. Скачков М.В., Скачкова М.А., Верещагин Н.Н. Механизмы формирования предрасположенности к острым респираторным заболеваниям в регионах с высокой антропогенной нагрузкой // Гиг. и санитария, 2002. - № 5. - С. 39-42.
15. Щелкунов Л.Ф. Механизм сорбции экологически вредных веществ растительными клеточными стенками // Екологiя довкыля та безпека життeдiяльностi, 2001. - № 4. - С. 83-86.
16. Brierley G.P. Passive permeability and energy-linked ion movements in isolated hearth mitochondria //Ann. N.Y. Acad. Sci, 1974. - V. 227. - P. 398-411.
17. Coban T., Beduke Y, Iscan M. In vitro effect of cadmium and nickel on glutation, lipid peroxidation andglutation-S-transferase in human kidneys// Toxicol. in vitro, 1996. — V. 10. — P. 241-245.
18. Fowler B.A. Mechanisms of kidney cell injury from metals // Envir. Health Persp., 1992. — V. 100. — P. 56-63.
19. Gaetke L.M., Chow C.K. Copper toxicity, oxidative stress and antioxidant nutrients // Toxicology, 2003. — V. 189. — P. 147-163.
20. Giri S.N., Hollinger M.A. Effect of cadmium on lung lysosomal enzymes in vitro // Arch. Toxicol., 1995. — V. 69. — № 5. — P. 341-345.
21. Irshad M., Chaudhuri P.S. Oxidant-antiox-idant system: role and significance in human body // Indian. J. Exp. Biol., 2002. — № 40 (11). — P. 12331239.
22. Jones A.M. Pectin agent and method of making // Food process ind., 2001. — V. 56. — № 10. — P. 1215.
23. Lund B.O., Miller D.M. Studies in Hg-induced H2O2 production and lipid peroxidation in vitro in rat kidney mitochondria//Biochem. Pharmacol., 1993. — V. 45. — P. 2017-2024.
24. Martel J., Marion M., Denizenu F. Effect of cadmium on membrane potential in isolated rat hepa-tocytes//Toxicol., 1990. — V. 60. — P. 161-172.
25. Nesterenko V.B., Nesterenko A.V., Babenko V.I. et al. Reducing the 137Cs-load in the organism of «Chernobyl» children with apple-pectin // Swiss. Med. Wk-ly, 2004. — № 1-2. — P. 24-27.
Переработанный вариант статьи поступил в редакцию 30.03.09.
A.R. Gutnikova1, K.O. Makhmudov1, B.A. Saidkhanov1, O.D. Tadzhikulova2, N.A. Ergashev2, M.I. Asrarov2, I.V. Kosnikova1
ABOUT MEMBRANOTROPIC ACTION OF HEAVY METAL SALTS AND BASIC WAYS OF ITS CORRECTION
1 Acad. V. Vakhidov Republican Specialized Center for Surgery, Ministry of Health of the Uzbekistan Republic 2 Institute of Physiology and Biophysics, Republic of Uzbekistan, Tashkent
In experiments on rats it was shown that major cytotoxic action factors of a combination of metals (copper, manganese, molybdenum, chromium) are activation of lipid peroxidation and development of membranepathologic process with disruption of the structures integrity. The enterosorption by a pectinic sorbent in combination with an anti-oxidative preparation Hepamal provides correction of consequences of heavy metals toxic impact.
