CC BY
71
Известия ТИНРО
2011 Том 167
ТЕХНОЛОГИЯ ОБРАБОТКИ ГИДРОБИОНТОВ
УДК 664.951:639.211
А.И. Чепкасова1, Н.Б. Аюшин1, М.И. Юрьева1, Т.С. Запорожец2, И.Д. Макаренкова2, Н.Н. Ковалев1*
1 Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр,
690091, г. Владивосток, пер. Шевченко, 4;
2 Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии
СО РАМН, 690087, г. Владивосток, ул. Сельская, 3
О КОМПЛЕКСНОЙ ПЕРЕРАБОТКЕ ПЕЧЕНИ ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫХ ЛОСОСЕЙ
В образцах свежемороженой и сублимированной печени кеты, а также осадка, полученного обработкой их водных гомогенатов раствором хитозана, изучено содержание липидов. Проведено сравнение содержания связанных аминокислот в тех же образцах, а также коммерческом препарате «Гепатосан». Последний наиболее богат белковыми аминокислотами, однако водорастворимый препарат из печени кеты почти не уступает ему по содержанию незаменимых аминокислот. Установлено, что в процессе получения водорастворимого комплекса содержание свободных нингидринположительных соединений повышается в 8 раз и более, при этом в печени—сырье и гепатосане они обнаружены в сравнимых количествах. Их содержание в водорастворимом препарате в 6 раз выше, чем в гепатосане. Показано, что антиоксидантная активность водорастворимого препарата в 5,8 раза выше, чем активность стандартного антиоксиданта карнозина. Биологические испытания препаратов сушеной печени, водорастворимого комплекса и хито-занового осадка показали выраженный положительный эффект при лечении токсического гепатита, индуцированного CCl4. В желчных пузырях кеты были определены свободные желчные кислоты. Препараты из печени лососей (на примере печени кеты) могут быть использованы для приготовления биологически активных добавок к пище гепатопротекторного действия.
Ключевые слова: лососевые рыбы, печень, липиды, аминокислоты, хито-зан-липидный комплекс, желчный пузырь, желчные кислоты, токсический гепатит, биологически активные добавки к пище.
* Чепкасова Анна Ивановна, младший научный сотрудник, e-mail: kovalevnn@ tinro.ru; Аюшин Николай Буданович, кандидат биологических наук, старший научным сотрудник, e-mail: tegin@tinro.ru; Юрьева Марина Иннокентьевна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, e-mail: yureva@tinro.ru; Запорожец Татьяна Станиславовна, доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник, заместитель директора, e-mail: niiem_vl@mail.ru; Макаренкова Илонна Доми-ровна, кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник, e-mail: ilona_m@ mail.ru; Ковалев Николай Николаевич, доктор биологических наук, заведующий лабораторией, е-mail: kovalevnn@tinro.ru.
Chepkasova A.I., Ayushin N.B., Yuryeva M.I., Zaporozhets T.S., Makaren-kova I.D., Kovalev N.N. On the problem of complex processing for liver from pacific salmons // Izv. TINRO. — 2011. — Vol. 167. — P. 240-251.
Lipid content is determined for liver from dried and frozen chum salmon and for sediments from their water extract treated by chitosan. High content of phospholipids is found in the chitosan-lipid complex from the frozen liver, the traces of free cholic and ursodeoxycholic acids are found in the gall bladders. Contents of combined amino acids and free ninhydrin-positive compounds in the liver, in the water extract, in the chitosan-lipid sediments, and in the commercial preparation Hepatosan (liophilized hepatocytes from pork) are compared. The concentrations of the ninhydrin-positive compounds in the liver and in the Hepatosan preparation were comparable, but it increased in 7 and more times after the chitosan treatment of the water extract from the liver. After this processing, the antioxidant activity of the water extract increased in 6 times and became higher than the antioxidant activity of the Hepatosan preparation. The biotesting of preparations from the dried liver, the water extract, and the chitosan-lipid sediments on non-inbred white mice shows a therapeutic effect to CCl4-induced toxic hepatitis.
Key words: salmon, liver, lipid, amino acid, peptide, BASF, chitosan-lipid complex, gall bladder, bile acids, toxic hepatitis.
Введение
Печень высших организмов, к числу которых относятся лососевые рыбы, — орган, отвечающий главным образом за метаболизм питательных веществ, поступающих в организм. В печени происходит азотистый обмен, метаболизм липидов и углеводов, создаются запасы энергоносителя — гликогена, имеющего важное значение для рыбы в нерестовой стадии ее развития, когда она перестает питаться. Клетки печени, в отличие от клеток других тканей и органов, обладают полным набором ферментов, участвующих в обмене аминокислот — для хищных рыб, к числу которых относятся лососи, это исключительно важно.
В мировой практике имеется множество примеров обнаружения и выделения из печени водных организмов различных биологически активных веществ. Так, из печени амфибий были выделены и изучены связанные с жирными кислотами белки, определена их аминокислотная последовательность (Schleicher, Santome, 2004). Эти белки имеют большое значение для осуществления метаболизма жиров в печени и могут быть использованы в качестве лекарственных средств. Описаны методы выделения ДНКаз из печени карпа Cyprinus carpio (Krawczenko et al., 2005), аланин-аминотрансферазы, играющей важную роль в процессе адаптации организма к различным условиям обитания (Srivastava et al., 2004), каталазы, супероксид-дисмутазы и глутатион-редуктазы трех видов антарктических рыб и определена зависимость активности этих ферментов от температуры тела рыбы (Speers-Roesch, Ballantyne, 2005).
Печень лососей может также служить источником ферментов, таких как протеиназы, глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа, 6-фосфоглюконат-дегидрогеназа, пируваткиназа, фосфоенолпируват-карбоксикиназа, лактат-дегидрогеназа и малик-фермент, употребляющихся для тонких биохимических работ (Mommsen et al., 2001). Из печени радужной форели Oncorchynchus mykiss удалось выделить триацилглицероллипазу, липолитическая активность которой увеличивается в присутствии связанной с ионом магния цАМФ/АТФ (Harmon et al., 1991). Ранее из этого же источника выделили и очистили ацетил-КоА-карбоксилазу (McKim et al., 1989). Кроме того, в печени O. mykiss были изучены уровни некоторых гормонов роста, причем выяснено, что наибольшего значения они достигают в период нереста, т.е. в период наиболее активной добычи лососей (Gomez et al., 1999). В печени атлантического лосося Salmo salar найдены и локализованы клетки, вырабатывающие эстроген и ксеноэстроген (Arukwe et al., 1999), из этого же объекта был выделен белок, обладающий антимикробным действием, в
дальнейшем идентифицированный как гистон Н1 с молекулярной массой около 22 кДа (Richards, 2001).
Особенно интересно, что в печени и других органах японской камбалы Paralichtys olivaceus были обнаружены две формы богатого цистеином пептида, проявляющего высокую антимикробиальную активность (Hirono et al., 2005). Этот пептид, получивший название гепсидин, был открыт несколькими годами ранее (Park et al., 2001) и в дальнейшем обнаружен в печени многих позвоночных животных. Помимо антимикробной, он проявляет также антигрибковую активность и играет важную роль в регуляции уровня железа в организме.
Таким образом, печень различных видов водных позвоночных животных, в том числе и хищных рыб, может служить источником как большого количества низкомолекулярных веществ, так и целого набора ферментов, которые можно применять для изготовления биологически активных пищевых добавок комплексного действия и высокоочищенных препаратов, применимых в качестве реагентов для научных исследований.
Ранее были изучены технохимические свойства и состав печени нескольких видов лососей, подобраны условия получения из печени горбуши водорастворимого препарата, исследованы его состав и свойства (Пат. № 2409291).
Задачей данной работы было продолжение изучения состава и свойств препаратов, полученных из печени и желчных пузырей рыб лососевых пород Дальнего Востока.
Материалы и методы
Печень и желчные пузыри кеты Oncorchynchus keta были заготовлены из свежевыловленной рыбы, добытой в устье р. Аввакумовка (Приморский край) и доставленной в ТИНРО-центр на следующий день после вылова в охлажденном состоянии. После разделки рыбы отобранную печень хранили в блоках при температуре минус 18 0С.
«Гепатосан» был приобретен в аптечной сети г. Владивосток. Это препарат сублимационно высушенных клеток печени донорской свиньи, представляющий собой порошок от светло-бежевого до светло-коричневого цвета. Гепатосан как гепатопротекторное средство рекомендуется к применению при циррозе печени различной этиологии, хронической гепатопатии (гепатиты, гепатозы), острой и хронической печеночной недостаточности, лекарственном и алкогольном поражении печени, отравлении, нарушениях процесса пищеварения. Препарат содержит аминокислоты, микроэлементы, витамины, эссенциальные фосфолипиды, мезенхимальные ферменты, цитохромы.
Аминокислотный анализ проводили на скоростном аминокислотном анализаторе L-8800 фирмы «Hitachi» (Япония). Антиоксидантную активность определяли по методу Глевинда (Владимиров, Арчаков, 1972) с использованием а-ди-фенил-а-пикрилгидразина (получен от фирмы ICN, США). Спектры поглощения были сняты с помощью спектрофотометра UV-3101PC фирмы «Shimadzu» (Япония). Анализ желчных кислот проводили на газовом хроматографе GC-14B фирмы «Shimadzu» (Япония). Использовалась колонка DB 5HS длиной 25 м, толщиной 0,2 мм, толщина фазы (неполярная, силикон с 5 % фенильных групп) 0,33 мкм. Газ-носитель — гелий, скорость 30 см/с. Детектор пламенно-ионизационный, 300 0С, инжектор 280 0С, делитель потока 1/40. Использовалась температурная программа от 50 до 290 0С. Подготовка проб проводилась следующим образом: навеску сырой ткани печени гомогенизировали в этаноле, затем в суспензию добавляли сульфосалициловую кислоту для высаждения белков и безводный сульфат натрия для связывания воды. Смесь фильтровали, осадок отбрасывали, а фильтрат упаривали досуха на роторном испарителе. Получившийся сухой остаток метилировали раствором соляной кислоты в метаноле и подвергали разделению на газовом хроматографе.
Экстракцию липидов из тканей проводили по методу Блайя-Дайэра, используя смесь растворителей метанол-хлороформ 1 : 2 (об/об) (Fokh et al., 1957).
Общее содержание фосфолипидов и их отдельных классов устанавливали по методу В.Е. Васьковского и Е.Ю. Костецкого (Vaskovsky et al., 1975).
Анализ состава жирных кислот липидов проводили на хроматографе «Shimadsu-14B» (Япония) с пламенно-ионизационным детектором. Условия анализа: капиллярная колонка «Supelcowax-10», 30 м х 0,25 мм, газ-носитель — гелий, температура инжектора — 240 0С, температура детектора — 240 0С, температура термостата — 210 0С. Метиловые эфиры жирных кислот идентифицировали на основании расчета индексов удерживания Ковача ECL (Christie, 1988).
Сублимированный водный экстракт печени, предварительно очищенный хитозаном, получали способом, разработанным авторами ранее (Пат. № 2409291).
Активность ферментов аспартат-аланинаминотрансфераз, гаммаглутамил-трансферазы в сыворотке крови определяли общепринятыми энзиматическими кинетическими фотометрическими методами, применяя стандартные наборы (Колб, Камышников, 1982). Концентрацию глюкозы в плазме венозной крови исследовали глюкозооксидазным методом на глюкометре «Эксан-1» (Колб, Камышников, 1982). Содержание общего билирубина в сыворотке (в микромолях на литр) определяли по методу Иендрашика-Грофа, используя стандартный набор реагентов «БИЛИРУБИН-НОВО» (Колб, Камышников, 1982).
Результаты и их обсуждение
Общее содержание липидов в печени кеты составило 3,6 %, что характеризует данный вид сырья как маложировое (табл. 1). Сублимация гомогената мороженой печени приводит к концентрированию липидов до 11,0 %. Следует отметить, что содержание фосфолипидов в печени различных способов заготовки различалось. Так, для мороженой печени содержание фосфолипидов составляло 21 % суммы липидов, а для сушеной — 32 %.
Таблица 1
Содержание липидов в печени кеты различных способов заготовки и в хитозан-липидных комплексах (ХЛК), %
Table 1
Lipid composition in liver from chum salmon processed by different methods and in chitosan-lipid sediments from the liver water extracts, %
Объект Общие липиды Фосфолипиды
Печень мороженая 3,6 21
Печень сушеная 11,0 32
Хитозановый осадок из мороженой печени 16,5 31
Хитозановый осадок из сушеной печени 11,0 -
Ранее (Чепкасова и др., 2009) были подобраны оптимальные условия водной экстракции растворимых веществ из замороженной и сушеной печени лососей на примере печени горбуши и изучен спектр свободного аминокислотного материала, переходящего в раствор. В процесс получения водорастворимых компонентов печени нами включена стадия осаждения липидов из водного экстракта хитозаном, позволяющая получить качественный сублимированный белковый продукт. Анализ состава компонентов, связанных с хитозаном, ранее не проводили. Для изготовления опытных образцов суспензию отделяли от жидкой фракции центрифугированием (3500 об/мин) и направляли на сублимирование.
В результате проведенных работ получены хитозан-липидные комплексы из мороженой и сушеной печени рыб. Анализ их состава показал, что наибольшим содержанием липидов характеризуется комплекс, полученный из мороженой печени (16,5 %), по сравнению с комплексом, полученным из сублимиро-
ванного сырья (11,0 %) (табл. 1). ХЛК, полученный из мороженой печени, характеризовался также высоким содержанием фосфолипидов (31 %). Фосфолипиды этого хитозан-липидного комплекса представлены фосфатидилхолином (55,6 %), фосфатидилэтаноламином (18,5 %), лизо-фосфатидилхолином (8,9 %) и незначительным количеством лизо-фосфатидилэтаноламина (4,2 %), сфингомиэлина (5,0 %) и фосфатидилинозитола (5,4 %).
Анализ приведенных в табл. 2 данных свидетельствует, что на хитозане происходит сорбция липидов, содержащих преимущественно насыщенные жирные кислоты. В то же время содержание мононенасыщенных и полиненасы-щенных жирных кислот в ХЛК меньше соответственно на 7,3 и 13,5 %. Анализ специфичности сорбции ненасыщенных жирных кислот позволяет высказать предположение о худшей сорбции на хитозане более длинноцепочечных поли-ненасыщенных жирных кислот и кислот изомерного строения по сравнению с насыщенными.
Таблица 2
Состав жирных кислот липидов печени и хитозан-липидного комплекса из мороженой печени кеты, % от общей суммы жирных кислот
Table 2
Fatty acids composition in lipids of the chum salmon liver and chitosan-lipid sediments from the liver water extracts, %
Жирная кислота Печень* ХЛК
14:0 1,6 1,8
16:0 20,4 24,7
18:0 10,7 13,2
Сумма насыщенных ЖК 32,3 39,7
16:1п-7 2,4 2,5
X 18:1 изомеров 20,2 12,6
22:1п-11 0,9 1,1
Сумма мононенасыщенных ЖК 23,5 16,2
20:4п-6 1,0 1,5
20:5п-3 12,7 7,9
22:5п-3 3,3 1,5
22:6п-3 14,6 7,2
Сумма ПНЖК 31,6 18,1
Примечание. Не указаны жирные кислоты, содержание которых в образцах составляло менее 1 %. * Данные А.И. Чепкасовой с соавторами (2009).
В образцах замороженной (предварительно обезвоженной ацетоном) и высушенной печени, водорастворимых фракций из них и хитозановых осадках, а также в гепатосане определяли состав белковых аминокислот (табл. 3). Для получения осадков использовались два вида хитозана, полученные из панцирей камчатского краба и углохвостой креветки.
Из данных табл. 3 видно, что водорастворимый препарат содержит значительно большую долю белкового материала, чем исходное сырье. Чуть меньшее количество белка содержится в хитозановых осадках, при этом можно отметить, что хитозан из панцирей камчатского краба обладает лучшей связывающей способностью, чем хитозан из панцирей углохвостой креветки.
Количественное содержание белковых аминокислот в гепатосане превышает таковое в необработанной печени кеты более чем в 2 раза. Содержание незаменимых аминокислот в гепатосане и препарате из печени кеты примерно одинаково.
Проведено сравнение состава свободных аминокислот и других нингидрин-положительных соединений в гепатосане, печени кеты и сублимированном водорастворимом препарате из нее (табл. 4).
Из данных табл. 4 видно, что содержание нингидринположительных соединений в печени кеты и гепатосане примерно одинаково. Можно отметить, что
Белковые аминокислоты печени кеты и препаратов из нее, мг аминокислоты/г материала
Table 3
Content of protein amino acids from the liver of chum salmon and its preparations,
mg of amino acid per g of tissue
Аминокислота Печень Водораст- мороженая, воримый обезвоженная препарат ацетоном Хитозановые осадки после получения водорастворимого препарата (хитозан (хитозан из панциря из панциря краба) креветки) Гепатосан
Незаменимые аминокислоты
Thr 10,2 20,б 24,4 18,4 19,4
Val 22,0 51,9 34,1 27,8 4б,9
Met б,8 12,6 8,7 9,3 12,4
Ile 12,5 35,1 25,8 20,б 37,G
Leu 20,7 б8,4 50,3 41,2 80,0
Phe 10,9 39,4 28,0 23,1 41,7
Lys 31,3 59,3 35,1 2б,9 57,3
Сумма
незаменимых 114,4 287,3 20б,4 1б7,3 294,7
Заменимые аминокислоты
Tyr 5,8 14,2 18,4 13,8 17,9
Ser 4,9 7,1 15,7 10,5 7,4
Asp 35,3 7б,0 53,1 43,9 75,3
Glu 78,0 91,7 б5,8 52,7 108,2
Gly 2б,8 32,7 2б,7 23,7 42,9
Ala 22,8 48,б 27,1 23,1 44,б
His 5,3 23,5 1б,5 14,1 23,3
Arg 7,8 34,3 34,3 2б,7 51,0
Pro 21,1 50,2 53,4 43,9 б4,7
Cys 9,4 б,9 8,б б,5 7,1
Сумма
заменимых 217,2 385,2 319,б 258,9 442,4
Всего 331,6 6?2,5 526,0 426,2 ?3?,1
процесс экстрагирования и сублимирования водорастворимых компонентов печени приводит к увеличению концентрации нингидринположительных соединений в 8 раз по сравнению с сырьем. Сублимированный водный экстракт характеризуется высоким содержанием таких аминокислот, как p-Ser, Tau, Asp, Glu, Gly, Cit, Leu. В процессе концентрирования практически все соединения увеличили содержание. Сравнение скора нингидринположительных соединений сублимированного экстракта печени кеты и гепатосана показало, что препараты по данному показателю различаются почти в 6 раз. В препарате из печени кеты присутствует большое количество цитруллина, отсутствующего в гепатосане. Особо следует отметить 5-кратное увеличение содержания в препарате из печени кеты такой физиологически важной аминокислоты, как таурин.
При определении антиоксидантной активности препаратов в качестве стандарта использовался дипептид карнозин как антиоксидант средней силы. Использование аминокислоты в качестве стандарта сравнения представляется нам более корректным.
Были измерены антиоксидантные активности сублимированного водорастворимого препарата из печени кеты и гепатосана. Антиоксидантная активность препарата из печени кеты соответствовала для 1 мг сухого препарата активности 5,8 мг стандартного антиоксиданта карнозина. Гепатосан антиоксидантной активности не проявил.
Таблица 4
Содержание свободных нингидринположительных соединений в печени кеты, водорастворимом препарате из нее и гепатосане, мг/г
Table 4
Content of free ninhydrin-positive compounds in the liver of chum salmon, in its water extract, and in Hepatosan preparation, mg/g
Соединение Печень мороженая Сублимированный водорастворимый препарат мороженой печени Гепатосан
p-Ser 0,61 5,26 0,68
Tau 0,52 5,79 1,10
Asp 0,36 3,02 0,37
Thr 0,38 2,71 0,34
Ser 0,38 2,60 0,37
Glu 0,88 8,15 2,85
Sar - 0,04 0,03
a-AAA 0,01 0,26 0,12
Gly 0,57 4,68 1,46
Ala 0,71 5,28 0,97
Cit 0,69 0,08 -
a-ABA 0,02 - 0,01
Val 0,43 5,21 0,28
Cys 0,08 6,86 0,25
Met 0,22 0,56 -
Cystin 0,05 0,24 0,05
Ile 0,32 1,56 0,18
Leu 0,62 3,43 0,38
Tyr 0,21 0,26 0,31
Phe 0,28 1,27 0,17
b-Ala 0,11 0,56 0,09
b-Aiba 0,08 0,77 0,09
g-ABA 0,01 0,77 0,02
Trp 0,03 0,25 0,01
HyLys 0,08 0,22 0,08
Orn 0,09 0,81 0,27
Lys 0,34 2,62 0,38
His 0,04 0,27 0,06
Ans 0,08 0,61 0,26
Car 0,01 0,06 0,07
Arg 0,04 0,23 0,02
Pro 0,04 2,87 0,35
Всего 8,18 63,89 11,62
Результаты клинико-биохимических исследований в процессе лечения гепа-тосаном больных с острой и хронической патологией печени показывают терапевтическую эффективность данного препарата. На 6-е сут лечения отмечается снижение билирубинемии на 60 %, а на 14-е сут — на 75-80 %, активность цитоплазматических ферментов снижается на 6-14-е сут: аланин-аминотрансфе-зазы (АLT) — на 60 %, аспартатаминотрансферазы (АБТ) — на 34 %. Нормализация вышеупомянутых показателей происходит к концу третьей недели лечения Улучшение общего самочувствия, снижение трансаминазной активности, уровней билирубина, гамма-транспептидазы, возрастание альбуминов и холинэстера-зы, особенно в группе больных хроническим гепатитом с исходом в цирроз, свидетельствуют о четкой тенденции к восстановлению функциональной активности печеночных клеток и усилению белковосинтетической способности печени. Биохимические исследования позволяют связать более выраженный терапевтический эффект у больных циррозом печени с тем, что на уровне толстой кишки гепатосан, состоящий из гепатоцитов, оказывает адсорбирующий эффект, задер-
живая всасывание метаболитов толстокишечной микрофлоры (первая фаза действия препарата), затем гепатоциты разрушаются, продукты их деградации всасываются и действуют уже как протектор на уровне клеток печени (вторая фаза) (Минушкин и др., 2011).
С целью выявления гепатопротекторных свойств сушеной (обезжиренной ацетоном) печени кеты (ГП-1), хитозан-липидного осадка, полученного из мороженой печени (ГП-2), и сублимированного водорастворимого комплекса, полученного из мороженой печени кеты (ГП-3), были проведены биологические испытания (табл. 5-7).
Таблица 5
Изменение уровня активности глюкозы крови и массы печени мышей, получавших гепатопротекторы одновременно и после индукции гепатита
Table 5
Changes of the blood glucose activity and weight of liver for mice that received the hepatoprotectors in the time of hepatitis inoculation and after the inoculation
Группа Доза, мг/мышь Одновременно Масса печени, Глюкоза, г ммоль/л После Масса печени, г Глюкоза, ммолль/л
Интактные 1,8 ± 0,2 6,6 ± 1,1 1,8 ± 0,2 6,6 ± 1,1
Гепатитные 2,1 ± 0,3 9,1 ± 2,0 2,1 ± 0,3 9,1 ± 2,0
ГП-1 1,0 1,9 ± 0,4 8,1 ± 0,4 1,8 ± 0,2 8,1 ± 0,6
ГП-1 5,0 1,9 ± 0,3 8,1 ± 0,6 1,8 ± 0,2 8,1 ± 0,6
ГП-2 1,0 2,2 ± 0,3 8,1 ± 0,6 1,8 ± 0,3 9,6 ± 0,9
ГП-2 2,5 2,1 ± 0,3 9,6 ± 0,9 1,8 ± 0,1 9,2 ± 1,1
ГП-3 1,0 2,0 ± 0,3 9,2 ± 1,1 1,7 ± 0,3 9,0 ± 0,8
ГП-3 5,0 1,9 ± 0,3 9,0 ± 0,8 1,9 ± 0,2 7,3 ± 1,6
Таблица 6
Изменение уровня активности ферментов крови мышей, получавших гепатопротекторы одновременно и после индукции гепатита
Table 6
Changes of the blood enzymatic activity for mice that received the hepatoprotectors in the time of hepatitis inoculation and after the inoculation
Группа Доза, мг/мышь ALT Одновременно AST GGT1 ALT После AST GGT
Интактные 2,0±1,3 1,2 ± 0,6 50,2 ± 25,5 2,0 ± 1,3 1,2 ± 0,6 50,2 ± 25,5
Гепатитные 3,4 ± 0,62 2,2 ± 0,42 72,8 ± 6,52 3,4 ± 0,62 2,2 ± 0,52 72,8 ± 6,52
ГП-1 1,0 3,2 ± 0,7 2,0 ± 0,3 73,1 ±13,3 1,6 ± 1,23 2,4 ± 0,7 15,6 ± 8,53
ГП-1 5,0 3,4 ± 0,2 1,9 ± 0,2 79,5 ± 16,3 1,3 ± 0,33 2,7 ± 0,5 62,3 ± 32,7
ГП-2 1,0 3,3 ± 0,6 1,9 ± 0,2 85,7 ± 17,7 2,1 ±0,63 2,0 ± 0,4 24,0 ± 10,13
ГП-2 2,5 3,4 ± 0,3 2,1 ± 0,2 98,2 ± 18,43 2,0 ± 0,83 2,2 ± 0,5 86,3 ± 22,2
ГП-3 1,0 1,5 ± 0,53 1,6 ± 0,63 39,0 ± 13,43 1,9 ± 0,83 2,3 ± 0,4 18,2 ± 8,83
ГП-3 5,0 3,0±1,0 1,8 ± 0,5 94,2 ± 38,83 2,0 ± 0,83 2,3 ± 0,3 24,2 ± 12,63
1 Гамма-глутамилтрансфераза.
2 Достоверные различия (р < 0,05) с группой интактных.
3 Достоверные различия (р < 0,05) с группой гепатитных.
Экспериментальные исследования выполнены на 84 неинбредных белых мышах массой тела 18-20 г, полученных из питомника РАМН «Столбовая», находившихся на стандартной диете в боксированных помещениях. Работа выполнена с соблюдением всех правил и международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных работах. Разброс животных в группе по массе тела не превышал ± 10 %. Животные контрольных и опытных групп одного пола, возраста, получены из питомника одновременно, содержались на стандартном рационе вивария. Животных выводили из опыта с использованием эфирного наркоза.
Таблица 7
Изменение уровня билирубина крови мышей, получавших гепатопротекторы одновременно и после индукции гепатита, мкмоль/л
Table 7
Changes of the blood bilirubin activity for mice that received the hepatoprotectors in the time of hepatitis inoculation and after the inoculation
Группа Доза, мг/мышь Общий Одновременно Прямой Непрямой Общий После Прямой Непрямой
Интактные 13,3 ± 5,8 8,3 ± 7,8 5,0±2,6 13,3±5,8 8,3±2,8 5,0 ± 2,7
Гепатитные 12,7 ± 3,9 4,7 ± 3,3** 8,0±1,1 12,7± 3,9 4,7 ± 3,3** 8,0 ± 1,1
ГП-1 1,0 13,0 ± 3,3 5,7 ± 2,9 7,29 ± 4,50 8,8± 4,6 5,2 ± 3,1 5,4 ± 2,1
ГП-1 5,0 10,0 ± 0,0 4,0±2,3 6,0±2,3 11,6±1,5 6,8±2,2 5,0 ± 1,4
ГП-2 1,0 14,8 ± 4,6 5,4±3,4 8,5±2,9 11,2± 4,1 4,0±3,4 7,2 ± 2,6
ГП-2 2,5 14,6 ± 3,9 8,2 ± 3,2* 6,4±3,1 13,2± 2,5 6,2±3,8 6,8 ± 2,6
ГП-3 1,0 8,0 ± 2,2 2,5 ± 0,6 5,5 ± 2,7 12,3± 2,6 5,0±2,9 5,8 ± 1,9
ГП-3 5,0 14,8 ± 4,6 6,6± 4,9 7,8±1,9 8,8± 2,7 4,0±3,0 4,8 ± 2,5
* Достоверные различия (р < 0,05) с группой интактных. ** Достоверные различия (р < 0,05) с группой гепатитных.
Было сформировано 5 групп экспериментальных животных:
— интактные животные, не подвергавшиеся воздействиям (n = 8);
— мыши с токсическим гепатитом, индуцированным CCl4 (n = 8);
— мыши, получавшие per os 1,0 или 5,0 мг/мышь ГП-1 одновременно с индукцией гепатита CCl4 (n = 8) и после индукции гепатита (n = 8);
— мыши, получавшие per os 1,0 или 2,5 мг/мышь ГП-2 одновременно с индукцией гепатита CCl4 (n = 8) и после индукции гепатита (n = 8);
— мыши, получавшие per os 1,0 или 5,0 мг/мышь ГП-3 одновременно с индукцией гепатита CCl4 (n = 8) и после индукции гепатита (n = 8).
Экспериментальный токсический гепатит индуцировали внутрижелудочным введением CCl4 по схеме 1,25 мл/кг в виде 40 %-ного масляного раствора 3 раза в неделю в течение 2 мес.
По окончании эксперимента мышей подвергали эфирному наркозу, забирали кровь натощак из сердца и исследовали массу печени, уровень AST ALT GGT, билирубина и глюкозы в сыворотках крови.
О гепатопротекторной активности исследуемых веществ судили по восстановлению уровня маркерных ферментов крови, билирубина, глюкозы и снижению массы печени.
У мышей с индуцированным гепатитом под действием тетрахлорметана масса печени увеличивалась по сравнению с показателями интактной группы, что указывало на развитие воспалительного процесса (см. табл. 5). Уровень глюкозы также повышался по сравнению с таковым у интактных животных. Исследованные препараты не оказывали влияния на уровень глюкозы в крови экспериментальных животных. Только при использовании водорастворимого препарата ГП-
3 в дозе 5,0 мг/мышь можно говорить о тенденции к снижению этого показателя при употреблении препарата по лечебной схеме (после индукции гепатита).
При исследовании биохимической активности крови у мышей с индуцированным гепатитом под действием тетрахлорметана выявлено повышение содержания ALT, AST, GGT, свидетельствующее о развитии цитолитического синдрома (табл. 6).
Уровень общего и прямого (конъюгированного) билирубина не отличался от показателей у контрольных животных, уровень непрямого (неконъюгированно-го) билирубина был повышенным (в зависимости от того, какой тип билирубина присутствует в сыворотке крови, неконъюгированный или конъюгированный, ги-пербилирубинемия классифицируется как постгепатитная — неконъюгирован-ная, паренхиматозная — и регургитационная — конъюгированная) (табл. 7).
Как следует из вышеприведенных данных (см. табл. 5-7), в группах животных, получавших гепатопротекторы по лечебной схеме (после индукции гепатита), масса печени и биохимические показатели крови значимо снижались по сравнению с таковыми у мышей с индуцированным гепатитом и приближались к показателям у интактных животных. В группах животных, получавших препараты по профилактической схеме, гепатопротекторное действие наблюдалось при приеме водорастворимого комплекса из печени. При кормлении мышей ХЛК одновременно с индукцией гепатита отмечено увеличение уровня гаммаглута-милтрансферазы в сыворотке крови, а также отсутствовал корригирующий эффект в отношении непрямого билирубина.
У рыб лососевых пород с печенью тесно сопряжен желчный пузырь, который может рассматриваться как потенциальный источник ценных в физиологическом отношении веществ — желчных кислот.
В настоящее время две желчные кислоты — урсодезоксихолевая и хеноде-зоксихолевая — являются международно признанными лекарственными средствами и отнесены по анатомо-терапевтическо-химической классификации к разделу А05А «Препараты для лечения заболеваний желчного пузыря». Их фармакологическое действие основано на том, что они изменяют состав пула желчных кислот в организме (например, хенодезоксихолевая кислота увеличивает концентрацию гликохолевой кислоты по сравнению с таурохолевой), тем самым уменьшая содержание потенциально токсичных соединений. Кроме того, обе кислоты способствуют растворению холестериновых желчных камней, уменьшают количество холестерина, количественно и качественно изменяют состав желчи.
В связи с этим нами был предпринят поиск желчных кислот как в печени, так и в специально отделенных от нее желчных пузырях свежевыловленной кеты.
В образце печени свободные желчные кислоты были обнаружены в минорных количествах, идентифицировать их не удалось (рис. 1).
Рис. 1. Газовая хроматография желчных кислот из печени кеты: 100—120 — область выхода желчных кислот; а — препарата печени с добавлением стандарта холевой кислоты; б — хроматограмма препарата печени
Fig. 1. Gas chromatography of bile acids from the liver of chum salmon: 100120 — area of bile acids outlet; а — chromatogram of the liver preparation with addition of the cholic acid standard; б — chromatogram of the liver preparation
Г00 f£0
В желчных пузырях удалось идентифицировать холевую и урсодезокси-холевую кислоты, а также несколько неопознанных желчных кислот. Их суммарное количество невелико (рис. 2), но необходимо иметь в виду, что методом простой экстракции с последующим метилированием можно определить только те вещества, которые содержатся в материале в свободном состоянии.
Очевидно, что основная масса желчных кислот в желчных пузырях находится в связанном состоянии — в виде конъюгатов, солей и эфиров. Для их высвобождения и определения требуется разработка специальной методики применительно к конкретным условиям.
218 221
Рис. 2. Газовая хроматография желчных кислот из желчных пузырей кеты, область выхода желчных кислот (пики 210-223). Пик 218 — урсодезоксихолевая кислота, пик 221 — холевая кислота
Fig. 2. Gas chromatography of bile acids from the gall bladder of chum salmon: 210223 — area of bile acids outlet; peak 218 — ursodeoxycholic acid; peak 221 — cholic acid
Заключение
Таким образом, установлено, что полученный по оригинальной методике водорастворимый препарат из печени кеты отличается высоким содержанием незаменимых для человека аминокислот и значительной антиоксидантной активностью, что позволяет использовать его для приготовления биологически активных добавок к пище общеукрепляющего действия.
Кроме того, проведенное биологическое исследование позволяет заключить, что этот препарат может использоваться как гепатопротектор, проявляющий свое действие на модели токсического гепатита при профилактическом введении в дозе 1,0 мг/мышь.
Список литературы
Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах : монография. — М., 1972. — 252 c.
Колб В.Г., Камышников В.С. ^равочник по клинической химии. — Изд. 2-е, перераб. и доп. — Минск, 1982. — 366 с.
Минушкин О.Н., Елизаветина Г.А., Масловский Л.В. и др. Клиническая эффективность гепатосана и энтеросана — медикаментозных препаратов на натуральной основе // http://www.medminiprom.ru/index.php?id=1&sub_id=142. 24 мая 2011 г.
Пат. № 2409291 ^особ получения водорастворимого полипептидного комплекса из печени рыб лососевых пород / А.И. Чепкасова, Н.Б. Аюшин, Н.Н. Ковалев. Заявл. 17.08.09; Опубл. 20.01.11.
Чепкасова А.И., Аюшин Н.Б., Юрьева М.И. и др. Технохимическая характеристика печени лососевых рыб и перспективы ее использования // Изв. ТИНРО. — 2009. — Т. 159. — C. 325-336.
Arukwe A., Nilsen B.M., Berg K., Goksoyr A. Immunohistochemical analysis of the vitellogenin response in the liver of Atlantic salmon exposed to environmental oestro-gens // Biomarkers. — 1999. — Vol. 4, № 5. — P. 373-380.
250
Christie W.W. Equivalent chain-lengths of methyl ester derivatives of fatty acids on gas-chromatography — a reappraisal // J. Chromatogr. A. — 1988. — Vol. 447, № 2. — P. 305-314.
Folch J., Lees M., Sloane Stanley G.H. Method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues // J. Biol. Chem. — 1957. — Vol. 226, № 1. — P. 497-509.
Gomez J.M., Mourot B., Fostier A., LeGac F. Growth hormone receptors in ovary and liver during gametogenesis in female rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) // J. of Reproduction and Fertility. — 1999. — Vol. 115, № 2. — P. 275-285.
Harmon J.S., Michelsen K.G., Sheridan M.A. Purification and characterization of hepatic triacylglycerol lipase isolated from rainbow trout, Oncorhynchus mykiss // So Fish Physiology and Biochemistry. — 1991. — Vol. 9, iss. 4. — P. 361-368.
Hirono I., Jee-Youn Hwang, Ono Y. et al. Two different types of hepcidins from the Japanese flounder Paralichtys olivaceus // FEBS Journ. — 2005. — Vol. 272, iss. 20. — P. 5257-5264.
Krawczenko A., Ciszak L., Malicka-Blaszkiewicz M. Carp liver DNase — isolation, further characterization and interaction with endogenous actin // Comp. Biochem. Physiol. B-Biochem. and Mol. Biol. — 2005. — Vol. 140, № 1. — P. 141-151.
McKim J.M., Schaup H.W., Marien K., Selivonchick D.P. Isolation and identification of acetyl-coa carboxylase from rainbow-trout (Salmo-gairdneri) liver // Lipids. — 1989. — Vol. 24, iss 3. — P. 187-192.
Mommsen T.P., Moon T.W., Plisetskaya E.M. Effects of arginine on pancreatic hormones and hepatic metabolism in rainbow trout // Physiological and Biochemical Zoology. — 2001. — Vol. 74, № 5. — P. 668-678.
Park C.H., Valore E.V., Waring A.J., Ganz T. Hepcidin, a urinary antimicrobial peptide synthesized in the liver // J. of Biol. Chem. — 2001. — Vol. 276, iss. 16. — P. 7806-7810.
Richards R.C., O’Neil D.B., Thibault H., Ewart K. Vanya. Histone H1: An Antimicrobial Protein of Atlantic Salmon (Salmo salar) // Biochemical and Biophysical Research Communications. — 2001. — Vol. 284, iss. 3. — P. 549-555.
Schleicher C.H., Santome J.A. Purification, characterization, and partial amino
acid sequencing of an amphibian liver fatty acid binding protein // Mokuzai Gakkaishi. — 2004. — Vol. 50, iss. 6. — P. 413-421.
Speers-Roesch B., Ballantyne J.S. Activities of antioxidant enzymes and cytochrome c oxidase in liver of Arctic and temperate teleosts // Comp. Biochem. Physiol. AMol. Integr. Physiol. — 2005. — Vol. 140, iss. 4. — P. 487-494.
Srivastava A.S., Oohara I., Suzuki T. et al. Purification and properties of cytoso-
lic alanine aminotransferase from the liver of two freshwater fish, Clarias batrachus and Labeo rohita // Comp. Biochem. Physiol. B-Biochem. Mol. Biol. — 2004. — Vol. 137, iss. 2. — P. 197-207.
Vaskovsky V.E., Kostetsky E.Y., Vasendin I.M. A universal reagent for phospholipid analysis // J. Chromatogr. — 1975. — Vol. 114, № 1. — P. 129-141.
Поступила в редакцию 24.08.11 г.
