CC BY
11Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского Серия «Биология, химия». Том 20 (59). 2007. № 3. С. 51-58.
УДК 578.28
НОВЫЙ ПУТЬ АКТИВИЗАЦИИ ЛАТЕНТНОГО ВИРУСА ЯДЕРНОГО ПОЛИЭДРОЗА НЕПАРНОГО ШЕЛКОПРЯДА
Оберемок В.В.
Предложен новый путь активизации латентного вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда с использованием фрагментов генома вируса. Найдены ДНК-маркеры борьбы защитных сил организма непарного шелкопряда с вирусом ядерного полиэдроза.
Ключевые слова: вирус ядерного полиэдроза непарного шелкопряда, метод 11АРВ-РС11, генетические маркеры, вирусный полиэдр.
ВВЕДЕНИЕ
Повреждение лесных насаждений гусеницами непарного шелкопряда на Украине известны со второй половины XIX ст. [11. Периодические вспышки массового размножения наблюдаются ежегодно в тех или иных частях его ареала [2].
Широкому распространению непарного шелкопряда способствует легкость, с которой он адаптируется к различным экологическим условиям, большая биологическая пластичность, высокая плодовитость, возможность быстрого расселения гусениц 1-го возраста и др. эколого-физиологические особенности [1]. Общепризнанно, что непарный шелкопряд - одно из важнейших звеньев в общей цепи причин массового усыхания дубрав [2].
Вспышки численности непарного шелкопряда сопровождаются эпизоотиями вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда, которые снижают численность личинок в популяциях до низких уровней [3] Вирус ядерного полиэдроза непарного шелкопряда относится к семейству бакуловирусов К этом} семейству относится группа вирусов, паразитирующих на артроподах. Они распространены широко во всем мире. Паразитируют вирусы на 600 видах преимущественно из отряда чешуекрылых [4].
Согласно большинству накопленных в настоящее время данных, развитие эпизоотий среди насекомых стимулируется ростом плотности популяции, при котором инфект быстро распространяется. При переходе популяции филлофага в фазу депрессии его чу вствительность к патогенам снижается, достигая миниму ма в период нового роста численности [5]. Скрытая инфекция неопределенно долго сохраняется в латентной форме в популяциях хозяина [6]. трансовариально передается из поколения в поколение, не проявляя симптомов болезни. Однако под воздействием стрессоров различной природы латентный вирус может перейти в активную форму и вызвать острый инфекционный процесс. В роли стрессоров могут
51
выступать пессимальные условия температуры и влажности, голод, неблагоприятный корм, скученность, хронические болезни вирусного происхождения [7].
При экспериментальном заражении личинок насекомых вирусами -возбудителями ядерных полиэдрозов инку бационный период болезни длится от 5 до 10-12 дней и более. Скорость развития инфекционного процесса в значительной степени зависит от дозы вируса, возраста и физиологического состояния насекомого, температуры окружающей среды и некоторых других факторов Обычное заражение осуществляется перорально при питании насекомых. Вирусные включения - полиэдры, попадая в пищеварительный тракт, разрушаются под действием протеолитических ферментов и освобождают вирионы [8].
Полиэдренные включения локализуются прежде всего в ядрах клеток жирового тела, гиподермы, эпителия трахей, гемолимфы, придаточных железах к мальпигиевым сосудам [8].
В наибольшей степени чувствительны к вирусам ядерного полиэдроза насекомые в фазе личинки [8. 9, 10]. Причем личинки первого возраста легко заражаются даже небольшими дозами возбудителя. Повышение устойчивости личинок насекомых к возбудителям полиэдроза с возрастом - явление универсальное и относится ко всем исследованным видам. [8].
Таким образом, вирус ядерного полиэдроза обладает большим потенциалом в борьбе с непарным шелкопрядом при правильном применении препаратов на его основе. В частности, нужно учитывать личиночную стадию насекомого, дозу вируса, способ заражения, физиологическое состояние насекомого, наличие или отсутствие латентного вируса внутри насекомого.
Основная проблема применения препаратов на основе бакуловирусов состоит в том. чтобы повысить скорость приведения насекомого к гибели [11. 12]. Дополнительными проблемами в применении бакуловирусов как инсектицидов являются технические и экономические трудности для производства вирусных препаратов in vitro, узкий круг хозяев, зависимость эффективности вируса от климатических условий, предпочтение фермерами быстродействующих химических инсектицидов [12].
Исходя из сказанного выше, целью нашего исследования стал поиск нового эффективного пути активизации латентного вируса ядерного полиэдроза для борьбы с непарным шелкопрядом.
МАТЕРИА ЛЫ И МЕТОДЫ
Для активизации латентного вируса использовали яйца непарного шелкопряда, собранные в Челябинской области в 2006 год}'. Для установления наличия вируса в гусеницах первого возраста применяли метод RAPD-PCR с использованием праймера ОРА-08 [13] и фазово-контрастное микроскопирование (рис. 1).
52
Рис. 1. Полиэдры вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда (рисунок получен при помощи техники фазового контраста).
В качестве маркеров вирусной ДНК использовали продукты амплификации ДНК вирусных полиэдров из Киргизии, Китая и Украины (рис. 2).
Рис. 2. Электрофореграмма продуктов амплификации ДНК вирусных полиэдров из Киргизии, Китая и Украины..
1 - вирусный препарат из Киргизии;
2 - вирусный препарат из Китая;
3 - вирусный препарат из Украины;
4 - маркер молекулярных весов ДНК от 100 до 1000 п. н. с шагом в 100 п. н. (снизу вверх); 01, 02, 03 - условные зоны продуктов амплификации ДНК вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда.
53
RAPD-PCR проводили по следующей методике. Образцы ДНК вируса выделяли из гусениц непарного шелкопряда 1-го возраста и вирусных полиэдров. Экстракцию тотальной ДНК проводили согласно стандартной методике [14]. Для метода RAPD-PCR использовали праймер ОРА-08 - GTGACGTAGG (Operon Technologies. USA).
RAPD-PCR проводили в реакционной смеси объемом 29 мкл на термоциклере «Терцик» (ДНК-Технология, Россия) с использованием реактивов для полимеразной цепной реакции «АмплиСенс-200-1» (АмплиСенс. Москва). Амплификацию проводили в течение 45 циклов. Первые 5 циклов шли по схеме: 93 "С - 1 мин, 35 С -1 мин. 72 С - 1 мин. Последующие 40 циклов шли по схеме: 93 С - 0.5 мин, 35 "С -0.5 мин, 72 С - 0.5 мин. Терминальную стадию синтеза проводили при 72 С - 3 мин.
Продукты амплификации разделяли методом электрофореза в 1.8 %-ном агарозном геле [14] и после окрашивания бромистым этидием анализировали под ультрафиолетом. В качестве маркера использовали DNA-markers М 100 (ИзоГен. Москва) с длиной фрагментов 100, 200, 300. 400. 500. 600. 700. 800. 900 и 1000 пар нуклеотидов
Для активизации латентного вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда использовали продукты амплификации ДНК вирусных полиэдров из Китая, полученных методом RAPD-PCR с использованием праймера ОРА-08 (рис. 2).
Через 12 часов после выхода из яйца личинок первого возраста на поверхность тела 14 гусениц нанесли по 0.05 мкл раствора продуктов амплификации ДНК вирусных полиэдров из Китая (I группа). Раствор содержал 8 фрагментов разной длины в сумме составляющих приблизительно 2000 п.н. Концентрация каждого из 8 фрагментов ДНК составляла порядка 10 фрагментов на 0.05 мкл раствора. Кроме этого, в растворе содержались следовые количества праймера. Тас1-долимеразы, ионы магния (Mg_+). ПЦР-буфер и очищенная ДНК нескольких десятков полиэдров После заражения каждую гусеницу поместили в отдельную пробирку . В качестве контроля использовали 6 гусениц, зараженных описанным выше способом с применением того же раствора, но не содержащего 8 фрагментов ДНК (II группа).
Чтобы сравнить скорость накопления полиэдров в зараженных гусеницах и незараженных, исследовали 11 особей непарного шелкопряда. Они прожили столько, сколько в опытной группе, и были заморожены для микроскопирования (III группа). В качестве дополнительного контроля жизнеспособности гусениц непарного шелкопряда использовали 14 гусениц, которые содержались вместе в чашке Петри до второго возраста. Гусениц выкармливали свежими листьями дуба, которые промывались в проточной воде перед кормлением (IV группа).
Погибших гусениц непарного шелкопряда замораживали. Для обнаружения вирусных полиэдров гусениц растирали в ступке с добавлением 50 мкл дистиллята. Количество полиэдров в 1 мл жидкости подсчитывали в камере Горяева под микроскопом Биолам (Д12/У11) с использованием техники фазового контраста. Статистическую обработку данных проводили по Рокицкому [15].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Методом RAPD-PCR было обнаружено, что вирус встречается в гусеницах первого возраста с частотой 0.43 (три из семи) (рис. 3).
54
12 3 4 5 6 7 8
_ ig* «1
В::; -
О ООО
Рис. 3. Электрофореграмма продуктов амплификации ДНК вируса с использованием праймера ОРА-08.
3, 5,7 - продукты амплификации ДНК преимущественно целых геномов вируса; 1, 2, 3, 4, 6 - продукты амплификации ДНК фрагментов геномов вируса; 8-маркер молекулярных весов ДНК от 100 до 1000 п. н. с шагом в 100 п. н. (снизу вверх); 0 - условная зона продуктов амплификации ДРЕК фрагментов геномов вируса (около 50 п. н.); 01, 02, 03 - условные зоны продуктов амплификации ДНК вируса ядерного полпэдроза непарного шелкопряда.
Однако микроскопирование 11 личинок первого возраста из III группы показало, что вирусные полиэдры присутствуют во всех исследованных образцах (табл. 1). Скорее всего, что в некоторых случаях концентрации вирусных частиц недостаточно для того, чтобы получить продукты амплификации вирусной ДНК. Это связано с потерей молекул ДНК вируса на стадии выделения.
Широкие полосы вирусной ДНК. присутствующие в нижней части электрофореграммы продуктов амплификации у 5 особей (рис. 3). являются маркерами борьбы защитных сил организма с вирусом. Вирусная ДНК. по-видимому. режется ферментной системой гусеницы в точках, находящихся приблизительно на одинаковом расстоянии. Из рис. 3 видно, что фрагменты ДНК обладают одинаковой длиной (около 50 п и.) и они нечеткие. Это связано с тем. что сайты отжига для праймера су ществуют, но накопление продуктов амплификации идет уже не в геометрической прогрессии, а в арифметической. Накапливаются не двухце почечные, а одно цепочечные фрагменты ДНК (рис. 4).
55
Рис. 4. Продукты амплификации ДНК целого (А) и фрагментированного (Б) участков генома вируса.
А. О - участок целого генома вируса; 1 - праймёр; 2 - двухцепочечный фрагмент ДНК (ампликон);
Б. О - участок фрагментированного генома вируса; 1 - праймер; 2 -одноцепочечный фрагмент ДНК.
Несомненно, что фрагментированные участки генома вируса сами по себе также вносят большой вклад в видимость фрагментов ДНК с низкой молекулярной массой.
Из 14 гусениц I группы погибло 12. не достигнув второго возраста. 11 из них погибли в течение первых суток (72%). Остальные 2 погибли сразу после первой линьки (второй возраст). В IV группе, где не было заражения, все 14 особей достигли второго возраста. Это свидетельствует о том, что незараженные гусеницы непарного шелкопряда не погибают в первом возрасте при отсутствии какого-либо стресс-фактора (F>F0.05).
Количество полиэдров в I группе сравнивалось с количеством в III группе (табл. I). Было обнаружено достоверное отличие между I и III группами в накоплении полиэдров (Р>1;,, .). В I группе накопление вирусных полиэдров шло в среднем в 7.5 раза быстрее. В I гру ппе размеры полиэдров были на 23% больше, чем в III гру ппе. Это связано с тем. что в течение суток в I группе преиму щественно успели образоваться полиэдры мелкого размера.
Таблица 1.
Количество вирусных полиэдров в I Ii III (контроль) группах и их диаметр
(x± Sx )
Группы Количество полиэдров, 0.00025 мкл Размер полиэдре®, мкм
I группа 19.85 ± 10.6* 0.168 ±0.049
III группа (контроль) 2.65 ± 2.04 0.218 ±0.042
* достоверность различий выборочных средних по критерию Фишера по
сравнению с контролем (Б>!Ро.о5)- указан 95 % доверительный интервал.
Толчком (стресс-фактором) к накоплению вирусных полиэдров могли стать как
56
весь геном вируса, так и отдельные его фрагменты, находящиеся в использованном для заражения растворе. В табл. 2 приведены данные статиспгаеской обработки показателей накопления вирусных полиэдров в особях непарного шелкопряда I и II групп
Таблица 2.
Количество вирусных полиэдров в I Ii III (контроль) группах и их ,iia\ieip
_(x±Sx)_
Группы Количество полиэдров. 0.00025 мкл Размер полиэдров, мкм
I группа 19.85 ± 10.6" 0.168 ±0.049
II группа (контроль) 2.04 ± 1.6 0.242 ± 0.048
* достоверность различий выборочных средних по критерию Фишера по сравнению с контролем |р>Р0.05); указан 95 % доверительный интервал.
Обнаружено достоверное отличие между I и II группами в накоплении полиэдров (Г Г л). В I группе накопление вирусных полиэдров шло в среднем в 9.7 раза быстрее, чем во II группе. Следовательно, амм.инициированные фрагменты ДНК вируса вызывают стремительное накопление вирусных полиэдров
Между второй и третьей группами достоверного отличия в накоплении полиэдров не было обнаружено доФаю)» Нужно отметить, что во второй группе в течение суток погибло 67% особей, а в первой группе - 72%. Данный факт указывает на то. что смерть гусениц амплифицированные фрагменты ДНК вируса не вызывают, а влияют только на накопление полиэдров вируса. По-видимому, на смерть гусениц влияет какой-то другой фактор, начинающий действовать при нанесении продуктов амплификации ДНК на поверхность тела гусеницы.
ВЫВОД
1. Именно фрагменты генома вируса, а не целые геномы, являются стресс-фактором. приводящим к стремительному накоплению вирусных полиэдров Данный факт может служить основой для нового типа активизации вируса ядерного полиэдроза в популяциях непарного шелкопряда. Этот новый путь интересен тем. что извне привносится только небольшое количество целых геномов вируса, а ставка делается на фрагменты геномов. По-видимому, входя в контакт с клетками непарного шелкопряда, фрагменты ДНК вируса вызывают стресс-реакцию, в результате которой латентный вирус активизируется.
2. Обнаружены ДНК-маркеры борьбы защитных сил организма с вирусом ядерного полиэдроза. На электрофореграмме они имеют вид широких полос и обладают длиной около 50 п и. ДНК-маркеры образованы фрагментами геномов вируса и продуктами амплификации этих фрагментов Наличие в гусенице данных ДНК-маркеров свидетельствует о том. что защитные силы организма (ферментные системы) борются с вирусной инфекцией, фрагментируя его геном.
57
Список литературы
1. Киреева Н.М. Экология и физиология непарного шелкопряда,- К: «Наукова думка», 1983. - 128 с.
2. Воронцов ATI. Лесная энтомология. - М.: Высшая школа, 1982. - 384 с.
3. Doane С. С. Primary pathogens and their role in the development of an epizootic in the gypsy moth .1. Invertebr. Pathol. - 1970. - Vol. 15. - P. 21-33.
4. Herniou E.A., Olszewski J.A., O'Reilly D R., Cory J.S, Ancient Coevolution of Baculoviruses and Their Insect Hosts Journal of Virology. - 2004. - Vol. 7. - P. 3244-3251.
5. Бахвалов C.A.. Башев А Н.. Кнор Н. Б. Динамика популяций шелкопряда монашенки Lymantria monacha L. (Lymantriidae: Lepidoptera) и поражающего его бакуловируса в Западной Сибири Лесоведение. - 1998. - № 4. - С. 26-33.
6. Ильиных А.В.. Бахвалов С.А., Моховиков С М. Естественное вирусоносительство у массовых видов лесных насекомых-фитофагов и его связь с жизнеспособностью хозяев Вопросы вирусологии. - 1995. -№4. -С. 186-187.
7. Ponomarev V.I. Population-genetic characteristics of outbreaks of mass propagation of gypsy moth (Lymantria dispar. L) /7 Russian journal of ecology. - 1994. - V.25. -№ 5.
8. ГулийВ.В.. Рыбина С.Ю. Вирусные болезни насекомых и их диагностика. - Кишинев. 1988. - 187 с.
9. Kalia V., Chaudhari S.. Gujar G.J. Optimization of production of nucleopolyhedrovirus of Helicoverpa armigera throughout larval stages // Phytoparasitica. - 2001. - Vol. 29, №1. - P. 23-28.
10. Злотин A 3. Техническая энтомология. - К.: Наукова думка, 1989. - 184 с.
11. Vlak J.M. Genetic engineering of baculoviruses for insect control. In. Oakeshott J, Whitten M.J. (eds) Molecular approaches to fundamental and applied entomology. - New York Springer-Verlag. 1992. - P. 90-127.
12. Moscardi F. Assessment of the application of baculoviruses for control of Lepidoptera Annual review of entomology. - 1999. - Vol. 44. - P. 257-289.
13. Оберемок В.В. Исследование строения генома вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда методом RAPD-PCR Международный симпозиум Восточно-Палеарктической региональной секции МОББ. - Санкт-Петербург. - 2007. - С. 175-178.
14. Sambrook J.. Fritisch E.F.. Maniatis Т. Molecular Cloning: Laboratory Manual. - New York: Cold Spring Harbour Univ. Press. — 1989. — 1626 p.
15. Рокицкий П.Ф. Биологическая статистика. - Минск: Вышейш. шк., 1973. - 320 с.
Оберемок В.В. Новий шлях активгзацп латентного Bipycy ядерного noiie.ipoiv непарного шовкопряда Вчеш записки Тавршського нацюнального ушверситету ¡м. ВТ. Вернадського. Сер1я ..Бюлопя. х1м1я'\ -2007. - Т. 20 (59). - № 3. - С. 51-58.
Запропоновано новий шлях актив1зацй латентного Bipycy ядерного по.шедрозу непарного шовкопряда за використання фрагмента геному Bipycy. Знайдено ДНК-маркери боротьби захисних сил оргашзму непарного шовкопряда з BipycôM ядерного по.шедрозу.
Ключом слова: Bipyc ядерного пол1едрозу непарного шовкопряда. метод RAPD-PCR. генетичш маркери. Bipy сний жшедр.
Oberemok Г. Г. А new way of activization of latent Lymantria dispar Nucleopolyhedrovirus
Uchenye zapiski Tavricheskogo Natsionalnogo Universiteta im. V. I. Vernadskogo. Series «Biology, chemistry». - 2007. - V.20 (59)Г-№ 3. - P. 51-58.
A new way of activization of latent Lymantria dispar Nucleopolyhedrovirus is suggested. The way is based on a use of virus genome fragments. DNA markers of protective mechanisms of a gypsy moth against Lymantria dispar Nucleopolyhedrovirus are found.
Keywords: Lymantria dispar Nucleopolyhedrovirus. RAPD-PCR method, genetic markers, virus polyhedron.
Поступила в редакцию 10.09.2007 г.
58
