CC BY
10Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского Серия «Биология, химия». Том 21 (60). 2008. № 2. С. 97-101.
УДК 578.52
ОБНАРУЖЕНИЕ МЕТОДОМ RAPD-PCR ДНК ВИРУСА ЯДЕРНОГО ПОЛИЭДРОЗА НЕПАРНОГО ШЕЛКОПРЯДА В ГУСЕНИЦАХ НЕПАРНОГО ШЕЛКОПРЯДА !-ГО ЛИЧИНОЧНОГО ВОЗРАСТА
Оберемок В.В.
При помощи метода RAPD-PCR и праймера OPA-08 обнаружена ДНК вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда в гусеницах непарного шелкопряда I-го личиночного возраста. Наличие вирусной ДНК в гусеницах непарного шелкопряда I-го личиночного возраста свидетельствует о возможности трансовариальной передачи вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда.
Ключевые слова: вирус ядерного полиэдроза непарного шелкопряда, трансовариальная передача вируса, RAPD-маркеры.
ВВЕДЕНИЕ
Повреждение лесных насаждений гусеницами непарного шелкопряда (Lymantria dispar) на Украине известны со второй половины XIX ст. [1]. Периодические вспышки массового размножения наблюдаются ежегодно в тех или иных частях ареала насекомого [2].
Широкому распространению непарного шелкопряда способствует легкость, с которой он адаптируется к различным экологическим условиям, большая биологическая пластичность, высокая плодовитость, возможность быстрого расселения гусениц I-го личиночного возраста и др. эколого-физиологические особенности [1] (рис. 1). Общепризнанно, что непарный шелкопряд - одно из важнейших звеньев в общей цепи причин массового усыхания дубрав [2].
Рис. 1. Яйца непарного шелкопряда и гусеницы I-го личиночного возраста.
Вспышки численности непарного шелкопряда сопровождаются эпизоотиями вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда (Lymantria dispar Nucleopolyhedrovirus), которые снижают численность личинок в популяциях до низких уровней [3]. Вирус ядерного полиэдроза непарного шелкопряда относится к
• Ч*
ъ
Ф
«Ь
Оберемок В.В.
сем. Baculoviridae. К этому семейству относится группа вирусов, паразитирующих на артроподах. Они распространены широко во всем мире. Вирусы паразитируют на 600 видах преимущественно из отр. Lepidoptera [4] (рис. 2).
Рис. 2. Полиэдры вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда (рисунок получен при помощи техники фазового контраста).
Согласно большинству накопленных в настоящее время данных, развитие эпизоотий среди насекомых стимулируется ростом плотности популяции, при котором инфект быстро распространяется. При переходе популяции филлофага в фазу депрессии его чувствительность к патогенам снижается, достигая минимума в период нового роста численности [5]. Скрытая инфекция неопределенно долго сохраняется в латентной форме в популяциях хозяина, трансовариально передается из поколения в поколение, не проявляя симптомов болезни. Однако под воздействием стрессоров различной природы латентный вирус может перейти в активную форму и вызвать острый инфекционный процесс. В роли стрессоров могут выступать пессимальные условия температуры и влажности, голод, неблагоприятный корм, скученность, хронические болезни вирусного происхождения [6].
Трансовариальная передача вирусов в природе является одним из основных процессов распространения вирусной инфекции. Тем не менее, наличие трансовариальной передачи вирусов у многих видов насекомых (в том числе вируса ядерного полиэдроза у непарного шелкопряда) является спорным вопросом [7]. Обнаружение и изучение процесса трансовариальной передачи вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда является актуальной проблемой, так как позволяет находить способы управления этим процессом для повышения эффективности борьбы с насекомым.
Исходя из сказанного выше, целью нашего исследования стало обнаружение возможности трансовариальной передачи вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для изучения трансовариальной передачи вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда использовали яйца непарного шелкопряда, собранные в Челябинской обл. (Россия) в 2006 г. Вылупившихся из яиц гусениц сразу заморозили. Для установления наличия ДНК вируса в гусеницах !-го личиночного
возраста применили метод RAPD-PCR с использованием праймера 0РА-08.
В качестве маркеров вирусной ДНК использовали продукты амплификации ДНК методом RAPD-PCR с использованием праймера 0РА-08 вирусных полиэдров препаратов из Киргизии, Китая, России и Украины (рис. 2).
Рис.3. Электрофореграмма продуктов амплификации ДНК вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда из разных вирусных препаратов: 1 - из Украины, 2 -из Китая (I); 3 -из России; 4 -из Китая (II), 5 - из Киргизии, 6 - маркер молекулярных весов ДНК от 200 до 1000 пар нуклеотидов с шагом в 100 пар нуклеотидов (снизу вверх); 01, 02, 03 - условные зоны продуктов амплификации ДНК вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда.
RAPD-PCR проводили по следующей методике. Образцы ДНК вируса выделяли из гусениц непарного шелкопряда I-го личиночного возраста. Экстракцию тотальной ДНК проводили согласно стандартной методике [8]. Для RAPD-PCR использовали праймер 0PA-08 - GTGACGTAGG (Operon Technologies, USA).
Амплификацию ДНК проводили в реакционной смеси объемом 29 мкл на термоциклере «Терцик» (ДНК-Технология, Россия) с использованием реактивов для полимеразной цепной реакции «АмплиСенс-200-1» (АмплиСенс, Москва). Реакционная смесь объемом 29 мкл содержала: 5-х PCR-буфер - 5 мкл; MgSO4, 50 Mm - 1.5 мкл; H2O MilliQ - 3 мкл; dNTP-mix - 2.5 мкл, 2 Mm; T^-полимераза, 5 ед/мкл - 0.5 мкл; минеральное масло - 10.5 мкл; праймер, А260 10 ОЕ/мл - 1 мкл; ТЕ-буфер с исследуемой ДНК - 5 мкл. Амплификацию ДНК проводили в течение 45 циклов. Первые 5 циклов шли по схеме: 93 0С - 1 мин, 35 0С - 1 мин, 72 0С - 1 мин. Последующие 40 циклов шли по схеме: 93 0С - 0.5 мин, 35 0С - 0.5 мин, 72 0С - 0.5 мин. Терминальную стадию синтеза проводили при 72 0С - 3 мин.
Продукты амплификации разделяли методом электрофореза в 1,8 %-ном агарозном геле [8] и после окрашивания бромистым этидием анализировали под ультрафиолетом. В качестве маркера использовали DNA-markers M 100 (ИзоГен, Москва) с длиной фрагментов 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 и 1000 пар нуклеотидов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Методом RAPD-PCR и праймера 0PA-08 было обнаружено, что вирус встречается в гусеницах I-го личиночного возраста с частотой 0.43 (три из семи)
Оберемок B.B.
(рис. 4). Из рис. 4 видно, что условные зоны продуктов амплификации ДНК вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда встречаются у особей № 3, 5 и 7. Полученные результаты свидетельствуют о возможности трансовариальной передачи вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда.
Рис. 4. Электрофореграмма продуктов амплификации ДНК вируса с использованием праймера 0PA-08, где 3, 5, 7 - продукты амплификации ДНК вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда; 1, 2, 4, 6 - отсутствие продуктов амплификации ДНК; 8-маркер молекулярных весов ДНК от 100 до 1000 п. н. с шагом в 100 п. н. (снизу вверх); 01, 02, 03 - условные зоны продуктов амплификации ДНК вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда
Попадание вируса к гусеницам могло быть обусловлено также присутствием вируса на поверхности яиц, так как для гусениц непарного шелкопряда характерно питание хорионом яйца во время вылупления и после него. Следует отметить, что вероятность такого попадания вируса на поверхность яйца из материнського организма существенно выше, чем из окружающей среды. Такой способ передачи вируса от матери к потомству (через внешнюю поверхность яйца) также следует отнести к трансовариальному пути.
ВЫВОД
У гусениц I-го личиночного возраста методом RAPD-PCR с использованием праймера 0PA-08 была обнаружена вирусная ДНК. Полученные результаты свидетельствуют о возможности трансовариальной передачи вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда.
Список литературы
1. Киреева Н.М. Экология и физиология непарного шелкопряда. - К: «Наукова думка», 1983. - 128 с.
2. Воронцов А.И. Лесная энтомология. -М.: Высшая школа, 1982. - 384 с.
3. Doane C.C. Primary Pathogens and their Role in the Development of an Epizootic in the Gypsy Moth // J. Invertebr. Pathol. - 1970. - Vol. 15. - P. 21-33.
4. Herniou E.A., Olszewski J.A., O'Reilly D.R., Cory J.S. Ancient Coevolution of Baculoviruses and Their Insect Hosts // Journal of Virology. - 2004. - Vol. 7. -P. 3244-3251.
5. Бахвалов С.А., Башев А.Н., Кнор Н.Б. Динамика популяций шелкопряда монашенки Lymantria monacha L. (Lymantriidae: Lepidoptera) и поражающего его бакуловируса в Западной Сибири // Лесоведение. - 1998. - № 4. - С. 26-33.
6. Гулий В.В., Рыбина С.Ю. Вирусные болезни насекомых и их диагностика. - Кишинев, 1988. - 187 с.
7. Ильиных А.В., Ульянова В. Г. Латентность бакуловирусов // Известия РАН. Серия биологическая - 2005. -№ 5.- С. 599-606.
8. Sambrook J., Fritisch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: Laboratory Manual. - New York: Cold Spring Harbour Univ. Press. - 1989. - 1626 p.
Оберемок В.В. Виявлення методом RAPD-PCR ДНК вiрусу ядерного полiедрозу непарного шовкопряда у гусеницях непарного шовкопряда I-го личиночного вжу // Вчеш записки Тавршського нацюнального ушверситету iм. В.1. Вернадського. Сeрiя „Бюлопя, хiмiя". - 2008. - Т. 21 (60). -№2. -С. 97-101.
Методом RAPD-PCR задопомоги праймеру 0PA-08 було виявлено ДНК вiрусу ядерного жшедрозу непарного шовкопряда у гусшь непарного шовкопряда I-го личиночного вжу. Наявнiсть ДНК вiрусу у гусiнь непарного шовкопряда I-го личиночного вжу свiдчить про можливють трансоварiальноl передачи вiрусу ядерного жшедрозу непарного шовкопряда.
Ключовi слова: вiрус ядерного полiедрозу непарного шовкопряда, трансоварiальна передача вiрусу, RAPD-маркери.
Oberemok V.V. Detection of DNA of Lymantria dispar Nucleopolyhedrovirus at 1st instar gypsy moth caterpillars with RAPD-PCR method // Uchenye zapiski Tavricheskogo Natsionalnogo Universiteta im. V. I. Vernadskogo. Series «Biology, chemistry». - 2008. - V.21 (60). - № 2. - P. 97-101.
With the help of RAPD-PCR method and primer 0PA-08 DNA of Lymantria dispar Nucleopolyhedrovirus was detected. Presence of virus DNA at 1st instar gypsy moth caterpillars testifies the possibility of transovarial transmission of Lymantria dispar Nucleopolyhedrovirus.
Keywords: Lymantria dispar Nucleopolyhedrovirus, transovarial transmission of virus, RAPD-markers.
Пост упила в редакцию 20.03.2008 г.
