CC BY
662
УДК 615.322:543.872
НОВЫЙ ПОДХОД В ОЦЕНКЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ ПРОЦЕССА АУТООКИСЛЕНИЯ АДРЕНАЛИНА
© Е.И. Рябинина , Е.Е. Зотова, Е.Н. Ветрова, Н.И. Пономарева, Т.Н. Илюшина
Воронежская государственная медицинская академия им. Н.Н. Бурденко, ул. Студенческая, 10, Воронеж, 394036 (Россия), e-mail: ryabinina68@mail.ru
Определена антиоксидантная активность водных извлечений шести распространенных лекарственных трав по ингибированию реакции аутоокисления адреналина. Предложен новый временной критерий в оценке антиоксидантной активности. Доказано, что период индукции можно считать величиной, определяющей антиоксидантную активность растительных экстрактов в анализе ингибирования реакции аутоокисления адреналина.
Ключевые слова: растительное сырье, антиоксидантная активность, аутоокисление адреналина.
Введение
Вопросы кислородного метаболизма в организме человека являются объектами постоянного внимания медиков, химиков и биохимиков. При нарушении баланса между биохимическими механизмами окси-геназной утилизации кислорода, механизмами защиты от вредных воздействий его высокореакционных метаболитов возникает окислительный стресс. Фармакологическая коррекция окислительного стресса осуществляется с помощью биологически активных веществ (БАВ), в частности антиоксидантов. Они прерывают быстрорастущие процессы окисления, образуя малоактивные радикалы, легко выводящиеся из организма. Одной из самых перспективных групп БАВ, обладающей антиоксидантной активностью, являются растительные фенольные соединения, среди которых ведущее место занимают полифенолы [1, 2]. Поэтому одним из важных показателей качества растительного сырья является их антиоксидантная активность. С целью выявления состояния антиоксидантной защиты организма в условиях патологического процесса исследуется активность супероксидисмутазы (СОД; КФ 1.15.1.1), важнейшего фермента этой системы, катализирующего превращение высокореакционного супероксид аниона в относительно менее активную перекись водорода и молекулярный кислород. Один из широко используемых подходов для определения активности СОД основан на способности фермента ингибировать супероксидрадикалы в реакции аутоокисления адреналина в щелочной среде [3]. На основе этого подхода разработан метод измерения антиоксидантной активности различных видов лекарственного растительного сырья и препаратов на их основе. Антиоксидантная активность не может измеряться напрямую, обычно измеряют влияние антиоксидантов на степень окисления, которая является функцией многих параметров, в частности времени. Предложенный в [3] метод, как правило, из-за разного выбранного времени ингибирования аутоокисления адреналина, выдает противоречивые данные, т.е. не коррелирующие между собой.
Цель данной работы - разработка универсального критерия в оценке антиоксидантной активности при исследовании процесса аутоокисления адреналина.
Экспериментальная часть
В качестве объекта исследования использовали готовое сырье надземной части шести видов лекарственных растений: мяты перечной (Mentha piperita L.), череды (Satureja hortensis L.), шалфея (Salvia officinalis L.), зверобоя (Hypericum perforatum L.), мелиссы (Melissa officinalis L.), тысячелистника (Achillea millefolium L.), выпускаемых ЗАО фирма «Здоровье» и приобретенных в аптечной сети.
* Автор, с которым следует вести переписку.
Водное извлечение готовилось путем нагревания около 1,5 г сырья, измеренного на аналитических весах марки CAS CAUY, имеющих I (специальный) класс точности по ГОСТ 24104-2001 и дискретность
0,1 мг, со 100 мл воды на водяной бане с обратным холодильником в течение 20 мин.
В полученных экстрактах потенциометрическим методом определяли содержание дубильных веществ [4]. Количественное содержание флавоноидов определяли спектрофотометрически [5], а аскорбиновой кислоты - титриметрическим методом [6]. Погрешность измерения не превышала 5%, доверительный интервал вычисляли по стандартной процедуре с использованием коэффициента Стьюдента (доверительная вероятность составляет 0,95).
Об антиоксидантной активности исследуемого растительного сырья судили по их способности ингибировать аутоокисление адреналина in vitro и тем самым предотвращать образование активных форм кислорода [3]. Для этого к 4 мл 0,2 М натрий-карбонатного буфера, рН = 10,65 (устанавливаемое добавлением к 0,2 М раствору Na2CO3 сухого реактива NaHCO3), добавляли 0,2 мл 0,1% (5,46 мМ) аптечного раствора адреналина гидрохлорида, тщательно и быстро перемешивали, помещали в спектрофотометр СФ-46 и определяли оптическую плотность через 30 сек в течение 10 мин при длине волны 347 нм в кювете толщиной 10 мм на спектрофотометре СФ-46 (Di). Далее к 4 мл буфера (рН=10,65) добавляли 0,06 мл исследуемого экстракта и 0,2 мл 0,1% адреналина гидрохлорида, перемешивали и измеряли оптическую плотность, как описано выше (D2). Для учета влияния собственной окраски экстрактов, которые поглощают определенную длину волны в видимой части спектра, в качестве контрольной пробы использовали буферированный раствор экстракта, без адреналина. Антиоксидантную активность (АА) исследуемых препаратов выражали в процентах ингибирования аутоокисления адреналина и вычисляли по формуле:
AA = CAZ52H00, о%.
А
Величина АА более 10% свидетельствует о наличии антиоксидантной активности.
Обсуждение результатов
Результаты количественного определения содержания биологически активных веществ в исследуемых образцах лекарственных растений [4-6] представлены в таблице 1. Полученные данные показывают, что содержание биологически активных веществ в растениях варьируется в широких пределах. Так, массовая доля дубильных веществ в растительном сырье колеблется в довольно значительных пределах от ~1,2% у Mentha piperita L. до ~10% у Hypericum perforatum L.
Сумма флавоноидов в образцах изученных растений варьируется от 1,120 до 4,315%. Наибольшее содержание флавоноидов определили в Hypericum perforatum L. и Salvia officinalis L. Наименьшее содержание этой группы веществ установили в Satureja hortensis L.
Количество аскорбиновой кислоты в сырье изученных растений изменяется от 0,067 до 0,283%. Наименьшее содержание аскорбиновой кислоты - в Satureja hortensis L., а наибольшее - в Mentha piperita L.
Поскольку реальные объекты представляют собой довольно сложные по химическому составу системы, то проблемой практического использования антиоксидантов растительного происхождения является количественная оценка их антиоксидантной активности, которая реализуется за счет суммарного содержания и действия восстановителей различной природы. Кроме того, при оценке антиоксидантной способности необходимо учитывать не только природу и содержание восстановителей в исследуемом объекте, но и возможность их взаимного влияния (например синергизм или антагонизм).
Таблица 1. Состав водных извлечений исследуемого растительного сырья
Исследуемое растительное сырье Содержание, %
дубильных веществ флавоноидов аскорбиновой кислоты
Mentha piperita L. 2,205±0,039 0,283±0,00б
Satureja hortensis L. 4,4б00±0,0130 1,120±0,019 0,0б7±0,003
Salvia officinalis L. 5,7б80±0,0132 2,787±0,029 0,078±0,013
Hypericum perforatum L. 10,5580±0,0412 4,315±0,013 0,189±0,011
Melissa officinalis L. 4,5115±0,0030 2,0б0±0,053 0,245±0,007
Achillea millefolium L. 2,8400±0,0180 1,940±0,013 0,098±0,00б
В данной работе нами использован метод оценки антиокислительной активности антиоксидантов на начальных этапах свободнорадикального окисления по ингибированию супероксидрадикала в реакции аутоокисления адреналина в щелочной среде при длине волны 347 нм [3].
На рисунке 1 представлена динамика реакции аутоокисления адреналина, имеющая сигмоидный характер. Форма начального участка кривой указывает на существование индукционного периода реакции. Введение в реакционную смесь растительных экстрактов, различающихся концентрацией БАВ, не оказывает влияние на форму кривой. Ингибирующее действие рассматриваемых экстрактов проявляется в уменьшении значения оптической плотности (по сравнению с контрольной пробой) и во влиянии на индукционный период, продолжительность которого различна в зависимости от используемого растительного сырья.
Антиоксидантная активность (АА) рассчитывается как относительная величина и определяется соотношением экстинкций при определенном времени протекания реакции, т.е. времени экспозиции. Для оценки влияния растительных экстрактов на процесс аутоокисления адреналина было выбрано разное время экспозиции: 3, 5 и 10 мин.
Предпочтение данному временному интервалу обусловлено наиболее высокой интенсивностью образования продукта окисления адреналина в данный промежуток времени и рекомендациями исследователей [3, 7]. Расчет антиоксидантной активности (АА) показал, что все исследуемые растительные экстракты проявляют высокую антиоксидантную активность (табл. 2).
Антиоксидантная активность (АА) растительных экстрактов в зависимости от времени экспозиции
Исследуемое растительное сырье АА, %
3 мин 5 мин 10 мин І-инд
Mentha piperita L. 50,0 34,15 21,67 48,65
Satureja hortensis L. 71,09 59,15 46,0 65,21
Salvia officinalis L. 88,28 84,86 60,2 85,88
Hypericum perforatum L. 92,96 92,19 65,3 92,95
Melissa officinalis L. 78,13 70,07 57,7 75,55
Achillea millefolium L. 57,81 48,94 38,8 58,65
Рис. 1. Зависимость оптической плотности (D347) от времени реакции аутоокисления адреналина (t) в отсутствие и в присутствии экстрактов растений
В водных извлечениях АА уменьшается в ряду: Hypericum perforatum L. > Salvia officinalis L. > Melissa officinalis L.> Satureja hortensis L. > Achillea millefolium L. > Mentha piperita L., что хорошо согласуется с данными определения антиоксидантной активности амперометрическим методом [8]. Анализируя полученные данные, можно отметить, что прослеживается корреляция между показателем АА образцов лекарственных растений и суммарным содержанием в них всех биологически активных веществ (БАВ): дубильных веществ, флавоноидов и аскорбиновой кислоты (рис. 2). Наилучший результат аппроксимации экспериментальных данных был получен с использованием полиноминальной зависимости при времени
экспозиции, равном 5 мин. Наблюдающееся отклонение от линейной зависимости, при достижении определенной концентрации (~7-8%) биологически активных веществ, связано со сменой антиоксидантного действия прооксидантным [9]. Однако следует отметить, что, наряду с положительными моментами, данный метод имеет и недостатки. Результаты, полученные в разное время экспозиции, сильно разнятся между собой (табл. 2) и не могут отвечать критерию оценки качества растительного сырья. Поэтому мы предлагаем ввести новый временной параметр - период индукции, который имеется на всех кривых аутоокисления адреналина в присутствии растительных экстрактов (рис. 1) и увеличивается с ростом процента БАВ в экстрактах. Скорее всего, именно в это время БАВ и проявляют свое антиоксидантное действие. При истощении раствора (уменьшении концентрации БАВ) лимитирующей становится реакция окисления адреналина, и на кривой наблюдается второй, более вертикальный участок. Для определения индукционного периода (1инд, мин) рассчитывали точку пересечения прямых линий - горизонтальной, характеризующей длительность индукционного периода, и наклонной, характеризующей протекание самой реакции (рис. 1). Для расчета антиоксидантной активности (АА) сначала определяли показатель экстинкции (О2), отражающий скорость ингибирования аутоокисления адреналина в присутствии исследуемых экстрактов при 1инд, а затем показатель экстинкции (Э^, ответственный за аутоокисление адреналина в данный момент времени. Если перестроить график (рис. 2) в координатах АА, рассчитанной по оптической плотности растворов в момент времени, равный от суммарного содержания биологически активных веществ (БАВ, %) (рис. 3), и считать, что зависимость имеет тот же полиноминальный характер, то наблюдается возрастание коэффициента корреляции (Я2 = 0,9984). Таким образом, за временной критерий в данном методе необходимо принимать время периода индукции, которое для каждого экстракта индивидуально, а не нормированную разницу оптических плотностей для каких-то определенных временных интервалов.
Рис. 2. Зависимость антиоксидантной активности (АА) от содержания биологически активных веществ (БАВ,%) в растительных экстрактах для трех интервалов времени реакции аутоокисления адреналина в присутствии экстрактов
Рис. 3. Зависимость антиоксидантной активности (АА), рассчитанной по оптической плотности растворов на момент времени, равный периоду индукции реакции адреналина экстрактами, от содержания в них БАВ
Выводы
1. Исследован состав водных извлечений шести распространенных лекарственных трав, и определена антиоксидантная активность растительных экстрактов по ингибированию реакции аутоокисления адреналина. Установлено, что все исследуемые лекарственные растения в той или иной степени обладают достаточно высокой антиоксидантной активностью.
2. Выявлена корреляционная связь между суммарным содержанием биологически активных веществ в растительном сырье и антиоксидантной активностью. При достижении определенной концентрации (~7-8%) биологически активных веществ их антиоксидантное действие сменяется прооксидантным.
3. Предложен новый временной критерий оценки антиоксидантной активности растительных экстрактов в анализе ингибирования реакции аутоокисления адреналина. Доказано, что период индукции можно считать величиной, определяющей антиоксидантную активность экстрактов.
Список литературы
1. Прида А.И., Иванова Р.И. Природные антиоксиданты полифенольной природы (антирадикальные свойства и перспективы использования) // Пищевые ингридиенты. Сырье и добавки. 2004. №2. С. 76-78.
2. Рыжикова М.А., Фархутдинова Р.Р., Сибиряк С.В., Загудиллин Ш.З. Влияние водных извлечений из лекарственных растений на процессы свободно-радикального окисления // Экспериментальная и клиническая фармакология. 1999. Т. 62, №2. С. 36-38.
3. Патент №2144674 (Россия). Способ определения антиоксидантной активности супероксидисмутазы и химических соединений / Т.В. Сирота / 20.01.2000.
4. Рябинина Е.И., Зотова Е.Е., Пономарева Н.И., Рябинин С.В. Сравнительное исследование мелиссы лекарственной и шалфея лекарственного на содержание полифенолов // Вестник ВГУ. Серия: Химия. Биология. Фармация. 2009. №2. С. 32-36.
5. Малахова А.И., Федоровский Н.Н. Исследование состава травы мелиссы лекарственной и ее водного извлечения // Науки о человеке : материалы VIII конгресса молодых ученых и специалистов. Томск, 2007. С. 230-231.
6. Государственная фармакопея СССР. XI изд. М., 1990. Вып. 2. 397 с.
7. Хасанова С.Р., Плеханова Т.И., Гашимова Д.Т., Галиахметова Э.Х., Клыш Е.А. Сравнительное изучение антиоксидантной активности растительных сборов // Вестник ВГУ. Серия: Химия. Биология. Фармация. 2007. №1. С. 163-166.
8. Мисин В.М., Сажина Н.Н., Завьялов А.Ю., Яшин Я.И. Измерение содержания фенолов в экстрактах лекарственных трав и их смесях амперометрическим методом // Химия растительного сырья. 2009. №4. С. 127-132.
9. Gutteridge V., Westermarck T., Halliwell B. Oxygen damage in biological systems / Free radical, Aging and Degenerative Disease. Ed. By Yohson Y. New York, 1986.
Поступило в редакцию 8 сентября 2010 г.
После переработки 16 декабря 2010 г.
