CC BY
16
УДК 576.52:57.085.23:616-006.66
Новый подход к противоопухолевой терапии: направленная доставка HSP70 к поверхности раковых клеток с помощью супрамолекулярных конструкций на основе пары барстар:барназа
А. М. Сапожников*, А. В. Клинкова, О. А. Шустова, М. В. Гречихина, М. С. Килячус, О. А. Стремовский, Е. И. Коваленко, С. М. Деев
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,
117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10
*E-mail: amsap@ibch.ru
Поступила в редакцию 20.06.2018
Принята к печати 25.08.2018
РЕФЕРАТ Одним из принципиальных отличий многих типов опухолевых клеток от клеток нормальных тканей является транслокация на поверхность плазматической мембраны ряда внутриклеточных протеинов, в частности белка теплового шока 70 кДа (HSP70). Продемонстрировано, что такая необычная поверхностная локализация HSP70 распознается цитотоксическими эффекторами иммунной системы и приводит к усилению их цитолитического действия на данные клетки-мишени. Механизмы этого взаимодействия до конца не раскрыты, однако феномен поверхностной локализации HSP70 на раковых клетках может быть использован для разработки новых подходов к противоопухолевой иммунотерапии. В то же время известно, что присутствие HSP70 на клеточной поверхности не является универсальным признаком раковых клеток. Многие разновидности опухолевых тканей не экспрессируют мембрано-ассоциированные HSP70, что ограничивает потенциальные клинические возможности указанных подходов. В связи с этим в качестве одного из перспективных направлений противоопухолевой иммунотерапии можно рассматривать направленную доставку на поверхность раковых клеток экзогенных HSP70 с целью привлечения и активации цитотоксических эффекторов иммунной системы. Для осуществления адресной доставки HSP70 в опухолевые ткани можно использовать молекулярные конструкции, содержащие рекомбинант-ные мини-антитела к опухолеассоциированным антигенам, в частности, к HER2/neu-антигену и другим маркерам, высоко экспрессирующимся на поверхности широкого спектра раковых клеток. С целью оценки возможности и эффективности применения указанного подхода, в данном исследовании были созданы двухмодульные рекомбинантные конструкции, содержащие в первом модуле мини-антитела к HER2/neu-антигену, а во втором модуле - молекулу HSP70 или ее фрагмент. Избирательное взаимодействие белковых модулей обеспечивалось состыковочным звеном, образуемым входящей в состав молекулярной конструкции парой барназа:барстар - гетеродимером с уникально высокой константой взаимодействия. Результаты, полученные при тестировании указанных препаратов в моделях in vitro, продемонстрировали селективное связывание разработанных конструкций с опухолевыми клетками, экспрессирующими HER2/neu-антиген, и достоверное стимулирующее действие этих препаратов на цитотоксическую активность клеток-эффекторов иммунной системы по отношению к соответствующим клеткам-мишеням.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА барназа:барстар, белок теплового шока 70 кДа, иммунотерапия рака, мини-антитела, NK-клетки, направленная доставка, HER2/neu-антиген.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ HSP70 - белок теплового шока 70 кДа; Hsp70 - индуцируемая форма HSP70 человека; Hsp70/16 - С-концевой фрагмент Hsp70 с молекулярной массой 16 кДа; 4D5 scFv - анти-HER2/neu мини-антитела.
ВВЕДЕНИЕ
Поиск новых подходов к иммунотерапии рака, несмотря на огромное число исследований в этой области, по-прежнему остается актуальной задачей [1—3]. Хорошо известно, что одна из причин появления и развития в организме злокачественных новообразований связана с отсутствием на поверхности опухолевых клеток антигенов, активирующих цито-токсические эффекторы системы иммунологического надзора, ответственные за элиминацию трансформированных клеток. В связи с этим одним из перспективных подходов к противоопухолевой иммунотерапии является направленная модификация поверхности опухолевых клеток молекулярными структурами, распознающимися клетками-киллерами и индуцирующими их цитолитическую реакцию. В последние годы было показано, что к числу таких структур относятся белки теплового шока (heat shock proteins, HSP) с молекулярной массой 70 кДа (HSP70).
Семейство белков теплового шока включает в себя широкий спектр высококонсервативных внутриклеточных протеинов, характеризующихся как гетерогенностью физико-химических свойств, так и разнообразием функций. HSP экспрессируются в клетках всех типов, причем уровень этой экспрессии увеличивается во много раз под действием различных повреждающих агентов. Увеличение внутриклеточного содержания HSP является универсальной защитной реакцией клеток, связанной с уникальной способностью данных белков предотвращать индуцированную стрессом агрегацию внутриклеточных протеинов, их денатурацию, обеспечивать репарацию частично поврежденных протеинов или их корректную утилизацию в случае необратимых повреждений. Перечисленные функции, а также участие в процессах фолдинга вновь синтезируемых полипептидов и транспорта внутриклеточных протеинов относят к так называемым «шаперонным» свойствам конститутивного пула HSP, экспрессирущегося в клетках в нормальных физиологических условиях, в отсутствие стресса [4, 5]. Однако локализация HSP не ограничивается внутриклеточным пространством. В большой серии работ было зарегистрировано присутствие этих протеинов на клеточной поверхности. Так, поверхностные HSP обнаружены на плазматической мембране нормальных [6, 7] и опухолевых клеток [8-14], вирус-инфицированных лимфоцитов [15] и Т-клеток, погибающих по программе апоптоза [16-18]. В этих работах было показано, что на клеточной поверхности экспрессируются HSP с различной молекулярной массой, однако наиболее типичны для поверхностной локализации HSP с молекулярной массой 70 кДа (HSP70). Феномен необыч-
ной поверхностной экспрессии HSP описан не только для клеток, культивируемых in vitro, но и для клеток различных тканей, полученных от пациентов [12, 14].
Функции HSP, экспонированных на клеточной поверхности, практически не изучены. Вместе с тем было высказано обоснованное предположение об иммунологической значимости этих поверхностных протеинов, заключающееся в том, что их появление на плазматической мембране может служить сигналом для иммунной системы, активирующим цитотоксические эффекторы и обеспечивающим элиминацию инфицированных, трансформированных и поврежденных клеток [19]. Это обстоятельство позволяет рассматривать HSP как поверхностные маркеры, вовлеченные в систему иммунологического надзора. Действительно, в настоящее время хорошо известно, что различные субпопуляции Т-лимфоцитов и NK-клеток способны распознавать высококонсервативные детерминанты различных HSP. В частности, мембранные HSP70 и Grp75 могут распознаваться уб-Т-клетками не-рестриктированно по молекулам главного комплекса гистосовместимости [20], а индуцируемая форма HSP70 - Hsp70 нерестриктированно разпознается NK-клетками [21, 22]. Поверхностные HSP опухолевых клеток привлекают NK-клетки, количество которых в опухолях, экспрессирующих эти протеины на своей поверхности, может увеличиваться в 500 раз
[23]. Литературные данные свидетельствуют о MHC класса I-нерестриктированном распознавании in vitro Hsp70 человеческими NK-клетками на поверхности клеток эритролейкемической линии К562 и человеческой саркомы, подвергнутых тепловому шоку
[24]. Вместе с тем показано, что поверхностные HSP70 вызывают выраженный гуморальный и клеточный ответ системы адаптивного иммунитета. В ряде работ было продемонстрировано, что HSP70 можно отнести к опухолеассоциированным антигенам, распознаваемым различными типами Т-лимфоцитов, например CD4- CD8- [25], ав- и уб-лимфоцитами [26, 27], а также естественными киллерами (NK-клетками) [10, 11, 21]. Зарегистрированное в этих работах распознавание как конститутивной, так и индуцируемой форм HSP70, МНС-рестриктированными и нере-стриктированными Т-лимфоцитами свидетельствует о важной роли поверхностных HSP70 в противоопухолевых иммунных реакциях. Основываясь на этом, была предложена модель иммунологического надзора, в которой указанные лимфоциты обеспечивают первую линию защиты от инфекционных агентов, несущих на своей поверхности HSP, защиты от вирус-инфицированных и трансформированных клеток, а также от поврежденных аутологичных клеток. Пул лимфоцитов, распознающих консервативные HSP,
возможно, индуцируется в онтогенезе во время развития естественной микрофлоры кожи и кишечника. Периодическая реактивация таких лимфоцитов может быть обусловлена обычными вирусными и бактериальными инфекциями, равно как и различными стрессирующими стимулами [19].
Применение HSP70 для противоопухолевой терапии давно привлекает внимание исследователей, использующих разнообразные подходы к данной проблеме [28-32]. Однако большинство этих подходов основаны на способности HSP70 образовывать прочные комплексы с опухолеспецифичными пептидами, а не на прямом распознавании цитотокси-ческими эффекторами иммунной системы мембра-но-ассоциированных HSP70. Возможно, это связано с тем, что экспрессия этих протеинов на раковых клетках in vivo наблюдается не во всех типах опухолевых тканей. Данное обстоятельство служит основанием для предположения, что индукция транслокации HSP70 на поверхность опухолевых клеток или направленная доставка в злокачественные новообразования таких молекул с целью привлечения и активации цитотоксических эффекторов иммунной системы является новым перспективным направлением для противоопухолевой иммунотерапии [33].
В недавних исследованиях ряда авторов и в наших предварительных экспериментах было установлено, что активирующим влиянием на натуральные киллеры обладают не только полноразмерные молекулы HSP70, но и синтетические аналоги некоторых фрагментов HSP70. В частности, внесение синтетических фрагментов HSP70 в культуру NK-клеток человека, как и в опытах с рекомбинантным HSP70, существенно стимулирует продукцию клетками-киллерами интерферона гамма [34, 35]. Таким образом, молекулы HSP70 и фрагменты этого протеина можно рассматривать как перспективные структуры для биоинженерного создания молекулярных конструкций, предназначенных для направленной модификации поверхности опухолевых клеток с целью усиления противоопухолевого цитотоксического иммунного ответа. Адресная доставка подобных «цитолитиче-ских маркеров» может осуществляться с помощью включения в разрабатываемые рекомбинантные конструкции модуля рекомбинантных мини-антител (не вызывающих прямой цитотоксической реакции иммунной системы) к опухолеспецифическим антигенам, в частности, антител к HER2/neu-антигену (р185НЕМ) и другим раковым маркерам, экспрессиру-ющимся на поверхности широкого спектра злокачественных новообразований.
Данное исследование было направлено на разработку способа адресной HER-2/neu направленной доставки HSP70 или фрагмента этой молекулы
к поверхности опухолевых клеток с помощью двух-модульной конструкции с использованием пары барназа:барстар в качестве состыковочного звена белковых модулей. В указанной конструкции функция первого модуля, имеющего в своем составе высокоспецифичное противораковое мини-антитело и барназу, заключается в прицельном связывании с поверхностью раковых клеток. В свою очередь, экспонированная на опухолевых клетках в результате этого взаимодействия барназа служит сайтом селективного связывания с клетками-мишенями второго модуля, составленного из барстара и HSP70 (или его фрагмента). Избирательное взаимодействие первого и второго модулей в разрабатываемом подходе обеспечивается уникально высокой константой связывания барстара с барназой; этот белковый гетеродимер образует комплекс с Кл ~ 10-14 М, сравнимый только со стрептавидин-биотиновой системой (Кл ~ 10-15 М). В ходе наших предыдущих исследований была доказана перспективность применения комплекса барназа:барстар для адресной доставки различных препаратов к раковым клеткам [36-39].
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Принципы создания двухмодульных молекулярных конструкций для адресной доставки HSP70 к опухолевым клеткам
Для создания надмолекулярного комплекса, содержащего белок HSP70 и адресующее мини-антитело, с помощью модуля барназа:барстар необходимо было присоединить HSP70 к одному из компонентов модуля - барстару. Из экспериментальных данных [10] известно, что за стимуляцию цитотоксической и пролиферативной активности NK-клеток отвечает С-концевой домен HSP70. Поэтому в конструируемом рекомбинантном белке необходимо было оставить С-конец HSP70 свободным и доступным для взаимодействия с естественными киллерами, а барстар присоединять к Оконцу с помощью гибкого линкерного пептида, обеспечивающего свободу вращения функциональных доменов в целевом рекомбинантном белке. На основе этих теоретических предпосылок была сконструирована плазми-да, кодирующая целевой рекомбинантный белок His6-барстар-HSP70, представляющий собой белок HSP70 (индуцируемая форма HSP70 человека -Шр70), соединенный ^концом с барстаром через шарнирный пептид иммуноглобулина IgG3 человека (ThrProLeuGlyAspThrThrffisThrSerGly) и содержащий гексагистидиновый хвост на Оконце (рис. 1). Аналогичные процедуры были проведены для получения второй разновидности эффекторного модуля, содержащего в своем составе не полноразмерную
Spe I Hind\\
Рис. 1. Схема плазмиды pET22_His_barstar_Hsp70, кодирующей второй модуль молекулярной конструкции, содержащий эффекторный белок Hsp70. Т7 lac - ранний промотор РНК-полимеразы фага Т7, HSP70 - ген Hsp70, Amp - ген устойчивости к антибиотику ампициллину
молекулу Hsp70, а ее С-концевой фрагмент с молекулярной массой 16 кДа - His6-6apcTap-Hsp70/16. В качестве первого, направляющего, модуля с адресными aHra-HER2/neu мини-антителами в работе использовалась созданная ранее конструкция 4D5 scFv-дибарназа [36].
Культуры опухолевых клеток-мишеней
В качестве клеток-мишеней, обрабатываемых разработанными конструкциями, были выбраны клетки аденокарциномы яичника SKOV3 и клетки карциномы молочной железы человека ВТ 474, сверхэкс-прессирующие HER-2/пеи-антиген. Клетки культивировали в 6-луночных планшетах (Nunk, США) и в культуральных флаконах (25 см2, Costar, США) в питательной среде RPMI 1640 (Flow Laboratories, Великобритания), содержащей 10% фетальной сыворотки теленка (FCS), 50 мкг/мл стрептомицина («Синтез», Россия) и 50 мкг/мл пенициллина («Биосинтез», Россия) в 5% СО2 при +37оС. Адгезионные клетки, прикрепляющиеся к подложке флаконов для культивирования, снимали с подложки раствором Версена. В качестве контроля использовали клетки линии HEK-293 - клетки эмбриональной почки, культивируемые в таких же условиях.
Проверку уровня экспрессии опухолеспецифиче-ского антигена HER-2/neu на поверхности культивируемых клеточных линий проводили с помощью флуоресцентной микроскопии и ранее созданных нами рекомбинантных конструкций для визуализации раковых клеток, экспрессирующих антиген HER-2/neu (анти-HER2/пеи-мини-антитело-барстар • GFP -барназа) [36, 37]. В результате было продемонстриро-
вано, что образцы используемых клеточных культур характеризуются необходимым высоким уровнем экспрессии поверхностного антигена HER-2/neu (данные не приведены).
Обработка клеток-мишеней тестируемыми конструкциями
Доставку Hsp70 и его фрагмента Hsp70/16 к опухолевым клеткам осуществляли в составе рекомби-нантных белков барстар-Шр70 и барстар-Шр70/16. Первым этапом адресной доставки являлось связывание анти-HER2/neu-мини-антитела (белок 4D5 scFv), входящего в состав первого модуля разработанного надмолекулярного комплекса, с соответствующим опухолеспецифическим антигеном на клеточной поверхности (20 мкг/мл, 60 мин). Затем за счет взаимодействия барназа-барстар рекомбинантные белки барстар-Шр70 и барстар-Шр70/16 также прочно адсорбировались на клеточной мембране (50 мкг/мл, 60 мин).
Оценка эффективности связывания разработанных конструкций с клетками-мишенями
Для оценки эффективности адресной доставки белка теплового шока на поверхность клеток-мишеней применяли метод проточной цитофлуориметрии. Окрашивание образцов клеток, провзаимодейство-вавших с первым и вторым модулями разработанного надмолекулярного комплекса, проводили по стандартной методике [14]. В работе использовали антитела BRM22 к С-концу HSP70 и вторые антитела - anti-mouse IgG-FITC (Sigma, США). Измерения проводили на проточном лазерном цитофлуори-метре FACScan (Becton Dickinson, США). В каждом образце анализировали не менее 10000 клеток. Статистический анализ проводили с использованием компьютерной программы WinMDI для обработки гистограмм, полученных во время цитофлуориметри-ческого анализа.
В опытах по визуализации адресной доставки Hsp70 и его фрагмента Hsp70/16 на поверхность опухолевых клеток-мишеней была использована лазерная конфокальная микроскопия. В этих экспериментах клетки-мишени, последовательно обработанные первым и вторым модулями разработанных конструкций, окрашивали по стандартной методике анти-HSP70-антителами и вторыми антителами, конъюгированными с флуорохромом AF488 (Molecular Probes, США). Полученный после центрифугирования осадок этих клеток помещали на предметное стекло с последующим нанесением специальной полимеризующейся гелеобразной среды Mowioll, сохраняющей морфологию клеток и предохраняю-
щей флуорохром от выгорания (Biomeda, США), накрывали покровным стеклом и оставляли в темноте до микроскопического анализа. Фотографирование клеток проводили на конфокальном микроскопе ECLIPSE TE2000-E (Nikon, Япония).
Оценка влияния обработки опухолевых клеток разработанными конструкциями на цитотоксическую активность NK-клеток по отношению к этим клеткам-мишеням
В серии экспериментов in vitro, направленных на анализ противоопухолевого эффекта разработанных конструкций, в качестве цитотоксических клеток-эффекторов использовали NK-клетки, выделенные из периферической крови человека. Для изоляции NK-клеток из фракции мононукле-аров, полученной с помощью седиментации донорской крови на градиенте плотности, использовали метод магнитной сепарации с применением набора для выделения NK-клеток (MACS NK cell isolation kit II, Miltenyi Biotec, Германия). Оценку уровня ци-тотоксичности, опосредованной NK-клетками, проводили с помощью нерадиоактивной тест-системы CytoTox96 (Promega, США), основанной на количественном определении выхода лактатдегидрогеназы (ЛДГ) из клеток-мишеней, обусловленного цитоли-тическим действием естественных киллеров на опухолевые клетки. Эксперименты проводили в соответствии с протоколом компании-производителя тест-системы. Каждую экспериментальную точку повторяли в трех репликах. NK-клетки вносили в лунки в соотношении 7:1 к клеткам-мишеням. В качестве мишеней использовали клетки линии ВТ 474, внесенные в лунки за 4 ч до эксперимента с последующей их обработкой тестируемыми рекомбинантны-ми конструкциями. На каждом этапе описываемой процедуры после внесения в лунки компонентов надмолекулярного комплекса и последующей инкубации клеток-мишеней в их присутствии (30 мин при 4°С) клетки осаждали на центрифуге с последующим удалением супернатанта и отмывкой лунок от несвязав-шихся рекомбинантных протеинов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Проведенный цитофлуориметрический анализ продемонстрировал эффективность использования разработанных конструкций для доставки Hsp70 и Hsp70/16 на поверхность опухолевых клеток-мишеней. В опытах, проведенных с линиями клеток ВТ 474 и SKOV3, были получены аналогичные данные, характеризующие связывание Hsp70 и Hsp70/16 c клеточной поверхностью. Поэтому ниже представлены результаты взаимодействия разработанных конструкций с клеточной линией ВТ 474.
2 3
\
101 102 103 FL2 LOG
101 102 103 FL2 LOG
Рис. 2. Цитофлуориметрический анализ связывания комплекса 4D5 scFv-дибарназа - барстар-^р70 (А) и 4D5 scFv-дибарназа - барстар-^р70/16 (Б) с поверхностью клеток ВТ 474. Клетки инкубировали с компонентами конструкций, затем образцы окрашивали по стандартной методике первыми (BRM22) и вторыми антителами, меченными флуорохромом FITC. По оси абсцисс - интенсивность флуоресценции, по оси ординат - количество событий. 1 - контроль: аутофлуоресценция; 2 - контроль: 4D5 scFv-дибарназа; 3 - контроль: барстар-^р70 (А) или барстар-^р70/16 (Б); 4 - 4D5 scFv-дибарназа -барстар-^р70 (А) или барстар-^р70/16 (Б)
Было продемонстрировано, что компоненты надмолекулярной структуры 4D5 scFv-дибарназа -барстар-Шр70(Шр70/16) эффективно связываются с поверхностью клеток: 4D5 scFv-дибарназа с антигеном р185НЕН2, а затем барстар-Шр70(Шр70/16) взаимодействует с 4D5 scFv-дибарназой (рис. 2). Кроме этого, наши данные свидетельствуют о способности белков барстар-Шр70 и барстар-Шр70/16 самостоятельно взаимодействовать с клеточной мембраной, что приводит к смещению пиков на гистограммах соответствующих контрольных образцов в область повышенного уровня флуоресценции. По литературным данным, некоторые типы опухолевых клеток способны адсорбировать на своей поверхности экзогенные ^Р70 [15, 16].
Клетки линии ВТ 474 экспрессируют антиген р185НЕН2, к которому направлено мини-антитело первого модуля. В качестве контроля на неспецифическое связывание 4D5 scFv-дибарназы с поверхностью клеток использовали линию эмбриональных клеток почки НЕК-293. Результаты цитофлуориметрическо-го анализа показали отсутствие неспецифического связывания с клеточной мембраной как первого модуля (4D5 scFv-дибарназа), так и второго (барстар-Шр70(Шр70/16)) (данные не приведены).
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что использование системы бар-наза-барстар обеспечивает высокоспецифичную и эффективную доставку конструкций, содержащих Шр70 или его С-концевой фрагмент, на поверх-
A
Б
л
-ч--ч-i— CÛ
m >
О ^
on
Рис. 3. Визуализация комплекса 4D5 scFv-дибарназа -6apcTap-Hsp70 (А) и 4D5 scFv-дибарназа - барстар-Hsp70/16(Б)на поверхности клеток ВТ 474(верхний ряд) и SKOV3 (нижний ряд). Клетки последовательно инкубировали с компонентами комплексов, затем образцы окрашивали антителами по стандартной методике. Первые антитела - BRM22 к С-домену HSP70, вторые - антитела,меченные флуорохромом Alexa Fluor 488. Ядра клеток окрашены DAPI. В - контроль: клетки окрашены вторыми антителами. Размер масштабной шкалы - 10 мкм
Б
В
ность опухолевых клеток, экспрессирующих маркер HER2/neu.
С целью визуализации эффективности использования разработанных конструкций для адресной доставки Hsp70 и фрагмента этой молекулы Hsp70/16 на поверхность клеток ВТ 474 и SKOV3 была использована лазерная конфокальная микроскопия. Клетки-мишени, последовательно обработанные первым и вторым модулями разработанных конструкций, окрашивали по стандартной методике анти-HSP70-антителами и вторыми антителами, конъюгированными с флуорохромом AF488. Уровень флуоресцентного окрашивания клеток анализировали на конфокальном микроскопе ECLIPSE TE2000-E. Полученные результаты подтвердили присутствие Hsp70 и Hsp70/16 на поверхности обработанных клеток-мишеней (рис. 3).
Влияние разработанных конструкций на активацию цитотоксических эффекторов иммунной системы проводили в in vitro модели взаимодействия NK-клеток с опухолевыми клетками-мишенями. В качестве мишеней использовали клетки линии ВТ 474. Оценка взаимодействия клеток-эффекторов с клетками-мишенями в этой модели показала, что адресная доставка как молекул Hsp70, так и Hsp70/16 к поверхности опухолевых клеток значительно увеличивает противоопухолевый цитолитический эффект NK-клеток. В наших экспериментах адресная доставка к клеткам линии ВТ 474 полноразмерной молекулы Hsp70 приводила к усилению цитолитического действия NK-клеток
40
I II III IV V VI Условия обработки клеток-мишеней
Рис. 4. Сравнение влияния обработки клеток-мишеней рекомбинантными конструкциями, содержащими ^р70 и ^р70/16, на цитолитическую активность NK-клеток. Условия обработки:
I - контроль (без обработки); II - 4D5 scFv-дибарназа; III - барстар-^р70/16; IV - барстар-^р70; V - 4D5 scFv-дибарназа + барстар-^р70/16; VI - 4D5 scFv-дибарназа + барстар-^р70
более чем в 5 раз, а доставка Шр70/16 - С-концевого фрагмента этой молекулы - более чем в 4 раза. Обработка клеток-мишеней отдельными составляющими разработанного надмолекулярного комплекса («нацеливающий» модуль - 4D5 scFv-барназа и «эф-
фекторные» модули - барстар-Шр70 и барстар-Hsp70/16) не оказывала существенного влияния на цитолитическое действие NK-клеток. Полученные результаты представлены на рис. 4.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проведенное исследование продемонстрировало эффективность разработанной нами двухмодульной молекулярной конструкции для адресной доставки к опухолевым клеткам-мишеням белка теплового шока Шр70 и его С-концевого фрагмента - молекул, активирующих цитотоксические эффекторы иммун-
ной системы. Предлагаемый подход может стать основой для создания новых препаратов для противоопухолевой иммунотерапии. •
Работа поддержана грантом РНФ № 14-24-00106 (конструирование генов и получение рекомбинантных белков) и программой Президиума РАН «Фундаментальные исследования для биомедицинских технологий» (исследование цитотоксической активности клеток-эффекторов иммунной системы).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Shilova O.N., Shilov E.S., Lieber A., Deyev S.M. // J. Control Release. 2018. V. 286. P. 125-136. doi: 10.1016/j. jconrel.2018.07.030.
2. Deyev S.M., Lebedenko E.N., Petrovskaya L.E., Dolgikh D.A., Gabibov A.G., Kirpichnikov M.P. // Russian Chemical Reviews. 2015. V. 84. № 1. P. 1-26.
3. Polanovski O.L., Lebedenko E.N., Deyev S.M. // Biochemistry (Moscow). 2012. V. 77. № 3. P. 227-245.
4. Craig E.A., Weissman J.S., Horwich A.L. // Cell. 1994. V. 78. P. 365-372.
5. Hartl F.U. // Nature. 1996. V. 381. P. 571-580.
6. Erkeller-Yeksel F.M., Isenberg D.A., Dhillon V.B., Latchman D.S., Lydyard P.M. // J. Autoimmun. 1992. V. 5. P. 803-814.
7. Ishiyama T., Koike M., Akimoto Y., Fukuchi K., Watanabe K., Yoshida M., Wakabayashi Y., Tsuruoka N. // Clin. Exp. Immunol. 1996. V. 106. P. 351-356.
8. Ferrarini M., Heltai S., Zocchi M.R., Rugarli C. // Int. J. Cancer. 1992. V. 51. P. 613-619.
9. Altmeyer A., Maki R.G., Feldweg A.M., Heike M., Protopopov V.P., Masur S.K., Srivastava P.K. // Int. J. Cancer. 1996. V. 69. P. 340-349.
10. Multhoff G., Hightower L.E. // Cell Stress Chaperones. 1996. V. 1. P. 167-176.
11. Multhoff G., Botzler C., Jennen L., Schmidt J., Ellwart J., Issels R. // J. Immunol. 1997. V. 158. P. 4341-4350.
12. Rogias J., Wallen E.S., Loening S.A., Moseley P.L. // Adv. Exp. Med. Biol. 1998. V. 451. P. 225-229.
13. Sapozhnikov A.M., Ponomarev E.D., Tarasenko T.N., Telford W.G. // Cell Prolif. 1999. V. 32. P. 363-378.
14. Hantschel M., Pfister K., Jordan A., Scholz R., Andreesen R., Schmitz G., Schmetzer H., Hiddenman W., Multhoff G. // Cell Stress Chaperones. 2000. V. 5. P. 438-442.
15. Di Cesare S., Poccia F., Mastino A., Colizzi V. // Immunology. 1992. V. 76. P. 341-343.
16. Poccia F., Piselli P., Vendetti S., Bach S., Amendola A., Placido R., Colizzi V. // Immunology. 1996. V. 88. P. 6-12.
17. Sapozhnikov A.M., Gusarova G.A., Ponomarev E.D., Telford W.G. // Cell Proliferation. 2002. V. 35. P. 193-206.
18. Torok Z., Horvath I., Goloubinoff P., Kovacs E., Glatz A., Balogh G., Vigh L. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 2192-2197.
19. Multhoff G., Botzler C., Issels R. // Biol. Chem. 1998. V. 379. P. 295-300.
20. Breloer M., Fleischer B., Bonin A. // J. Immunol. 1999. V. 162. P. 3141-3147.
21. Multhoff G., Botzler C., Wiesnet M., Eissner G., Issels. R. // Blood. 1995. V. 86. P. 1374-1382.
22. Ponomarev E.D., Tarasenko T.N., Sapozhnikov A.M. // Immunol. Lett. 2000. V. 74. P. 133-139.
23. Hightower L.E., Hendershot L.M. // Cell Stress Chaperones. 1997. V. 2. P. 1-11.
24. Multhoff G. // Int. J. Hyperthermia. 1997. V. 13. P. 39-48.
25. Tamura Y., Tsuboi N., Sato N., Kikuchi K. // J. Immunol. 1993. V. 151. P. 5516-5524.
26. Menoret A., Patry Y., Burg C., Le Pendu J. // J. Immunol. 1995. V. 155. P. 740-747.
27. Wei Y-g., Zhao X., Karuya Y., Fukata H., Teshigawara K., Uchida A. // Cancer Res. 1996. V. 56. P. 1104-1110.
28. Srivastava P.K., Amato R.J. // Vaccine. 2001. V. 19. P. 25902597.
29. Sashchenko L.P., Dukhanina E.A., Yashin D.V., Shatalov Y.V., Romanova E.A., Korobko E.V., Demin A.V., Lukyanova T.I., Kabanova O.D., Khaidukov S.V., Kiselev S.L., Gabibov A.G., Gnuchev N.V., Georgiev G.P. // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 2117-2124.
30. Shevtsov M.A., Komarova E.Y., Meshalkina D.A., Bychkova N.V., Aksenov N.D., Abkin S.V., Margulis B.A., Guzhova I.V. // Oncotarget. 2014. V. 5. P. 3101-3114.
31. Yuan J., Kashiwagi S., Reeves P., Nezivar J., Yang Y., Arrifin N.H., Nguyen M,. Jean-Mary G., Tong X., Uppal P., et al. // J. Hematol. and Oncol. 2014. V. 7. P. 15.
32. Yashin D.V., Ivanova O.K., Soshnikova N.V., Sheludchen-kov A.A., Romanova E.A., Dukhanina E.A., Tonevitsky A.G., Gnuchev N.V., Gabibov A.G., Georgiev G.P., Sashchenko L.P. // J. Biol. Chem. 2015. V. 290. P. 21724-21731.
33. Guzhova I.V., Margulis B.A. // Hum. Vaccin. Immunother. 2016. V. 12. P. 2529-2535.
34. Kovalenko E.I., Vlaskin P.A., Kanevskii L.M., Strel'nikova Y.I., Sapozhnikov A.M. // Dokl. Biol. Sci. 2006. V. 406. P. 4-6.
35. Multhoff G., Pfister K., Gehrmann M., Hantschel M., Gross C., Hafner M., Hiddemann W. // Cell Stress Chaperones. 2001. V. 6. P. 337-344.
36. Deyev S.M., Waibel R., Lebedenko E.N., Schubiger A.P., Plückthun A. // Nature Biotechnology. 2003. V. 21. P. 14861492.
37. Shipunova V.O., Zelepukin I.V., Stremovskiy O.A., Nikitin M.P., Care A., Sunna A., Zvyagin A.V., Deyev S.M. // ACS Appl. Mater. Interfaces. 2018. V. 10. № 20. P. 17437-17447. doi: 10.1021/acsami.8b01627
38. Martsev S.P., Chumanevich A.A., Vlasov A.P., Dubnovitsky A.P., Tsybovsky Y.I., Kravchuk Z.I., Cozzi A., Arosio P., Deyev S.M. // Biochemistry. 2000. V. 39. № 27. P. 8047-8057.
39. Generalova A.N., Sizova S.V., Zdobnova T.A., Zarifullina M.M., Oleinikov V.A., Zubov V.P., Deyev S.M., Artemyev M.V., Baranov A.V. // Nanomedicine. 2011. V. 6. № 2. P. 195-209.
