CC BY
43
ГЕНЕТИКА И ЦИТОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ
УДК 581.3 + 581.163
НОВЫЙ ПОДХОД К ИСПОЛЬЗОВАНИЮ Al ^МОРФОЛОГИЧЕСКОГО МЕТОДА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ АПОМИКСИСА У ЗЛАКОВ
Н.А.Шишкинская, О.И.Юлакопа Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевском
В основу аитморфологического метода выявления аиомиксиса у растений, предложенного С.С.Хохловым и разработанного им и его учениками (Хохлов, Зайцева, Близшок, 1973; Хохлов, Зайцева, Куприянов, 1978; Куприянов, 1989), положено представление о том, ч то переход на апомиктичнос размножение приводит к изменениям в развитии и строении цветка, которые достаточно легко диагностируются и Moiyr быть использованы для идентификации аномиктичных форм. Эти изменения затрагивают как морфологию цветка, гак и те интимные процессы, которые протекают в генеративных органах и лежат в основе развития семени. Главное внимание в этой методике уделено качеству пыльцы, как наиболее доступному для диагностики признаку аиомиксиса. Показателем качества пыльцы является СДП - степень дефектности пыльцы растений, которую определяют как отношение дефектных пыльцевых зерен к общему количеству исследованных. Подробную методику определения СДП можно найти в работах П.Г.Куприянова (1975, 1983). С помощью методов вариационной статистики он обосновал надежность аитморфологического метода выявления аномиктичных форм и установил границу, разделяющую половые и апомиктичные виды по признаку «качество ныльцы». Ей соответствует СД11 ~ 11,7%.
Общеизвестно, что популяции всех видов покрытосеменных характеризуются наличием определенного процента стерильной пыльцы. Уровень содержания стерильной или дефектной пыльцы зависит от способа размножения, плоидности растений, гибридности и других характеристик системы репродукции. Принимая во внимание то, что апомиктичные популяции часто состоят из растений с разными уровнями плоидности, диагностику аиомиксиса следует проводить с учетом не только величины СДП, но и ее варьирования как в пределах одной особи, гак и в популяции.
Необходимо подчеркнуть, что и С.С.Хохлов и П.Г.Куприянов считали антморфологичсский метод методом диагностики не претендующим на окончательное заключение о наличии этого явления. Он позволяет лишь сузить круг исследования за счет исключения из него видов с нормальной пыльцой.
Наличие взаимосвязи между качеством пыльцы и апомиксисом полностью подтвердили результаты наших многолетних исследований эмбриологии злаков. Однако мы пришли к выводу о необходимости нового подхода к использованию аи тморфологического метода. Процедура определения СДП является довольно трудоемкой и длительной, так как она включает микроскопический анализ значительного количества пыльцевых зерен (до 600 штук на одно
1Н1
растение) и биометрическую обработку полученных данных. В то же время получаемые результаты носят предварительный характер, а окончательный вывод о наличии апомиксиса дает только исследование женской генеративной сферы. В связи с этим было желательно найти достаточно надежный визуальный критерий, на основании которого можно различать пыльцу половых и апомиктич-ных форм.
Материал и методы
Однократная фиксация эмбриологического материала (соцветий) производилась в период открытого цветения природных популяций злаков в разных г серафических регионах бывшего СССР.
Видообразец - случайная выборка растений - включал в среднем от 10 до 20 растений. Для фиксации использовали ацетоалкоголь (3:1) или смесь Чем-берлена (Паушева, 1970), а для окраски - ацетокармин или гематоксилин. Окрашенные целиком соцветия промывали проточной водой в течение суток. 'Затем под бинакуляром препаровальными иглами выделяли пыльники, в капле дистиллированной воды иглой раскрывали их и извлекали пыльцу. Остатки пыльника удаляли, а на пыльцу наносили каплю кармина, тщательно перемешивали и добавляли каплю глицерин-желатина, предварительно разогретого на водяной бане. Нщс раз все тщательно перемешивали, препарат накрывали покровным стеклом и подсушивали.
Для определения СДП производили подсчет' разных типов пыльцевых зерен в нескольких полях зрения, охватывая пе менее 100 штук. За нормальную принимали пыльцу хорошо окрашенную, выполненную, однородную по размеру. Все другие категории пыльцевых зерен (слабоокрашенные, плазмолизиро-ванные, крупные, мелкие, пустые) в соответствии с антморфологнческим методом считали дефектными. Пыльцу для анализа брали с разных частей соцветия. СДП популяции определяли как среднее арифметическое СДП отдельных растений.
Результаты исследований
В таблице 1 представлены результаты анализа качества пыльцы в популяциях, у которых на основании исследования женской генеративной сферы установлен половой способ размножения. Всего таких популяций 33. Примерно половина из них имела высокое качество пыльцы, то есть величина СДП не достигала пограничной величины (11,7%). В трех популяциях (Вго/поря/х variegala. РШагоШея агипсИпасеа, Е1утий сапой®) наблюдалось незначительное превышение этого показателя, а в остальных - уровень стерильности был достаточно высоким. Снижение качества пыльцы у половых видов могло быть вызвано несколькими причинами.
Таблица 1. Качество пыльцы в половых популяциях
Вил Место обитания популяции Качество пыльцы (СДП, %)
Aijrostis borealis Якутия Незрелая пыльца
A.clavata Камчатка 5,3
A.seabra Камчатка 6,8
Alopecurus pratensis 11риполярный Урал 24,7*
Beckmannia syzigachne Камчатка 0,0
Brumopsis canadensis Камчатка 9,5
B. erecta Северный Кавказ 2,4
В pumpclliana Камчатка 8,5
B.gordjaginii Северный Кавказ 2,4
В variegata Северный Кавказ 11,7
Calamagroslis langsdorfii Камчатка 53,1*
Colpodimn humile Саратовская обл. 8,2
Hlyinus caninus Приполярный Урал 12,5
h.jacutensis Якугия 5,3
E.mutabilis Приполярный Урал 13,5
Камчатка, г. Елизово 13,3
Камчатка, побережье Тихого океана 19,7*
Rlytngia lolioides Саратовская обл. 9,1
h'estuca rubra Якугия 9,0
Glyceria lithuanica Камчатка 62,7**
Ley mus mollis Камчатка 5,4
Melica nutans Саратовская обл. 10,0
11риполярный Урал 31 9**
Камчатка 67.8*
Milium vemale Северный Кавказ 6,5
M.effusum Камчатка 5,9
Plialaroides arundinacca Камчатка 15,4
Plileum alpinum Камчатка 20,1*
Ph.phlcoides Саратовская обл. 30,3*
Ph.pratensis Саратовская обл. 6,5
I'oa alpigeua Камчатка 59,6*
P.annua Камчатка 60,0*
Сибирь. р.Усть-Нерта 11,2
Примечание: * Поздний срок шкеации материала: ** Вегетативное размножение.
Во-первых, как показал анализ состояния женской половой сферы, в ряде популяций фиксация материала была произведена в завершающий период цветения, когда прошло оплодотворение и начался естественный процесс отмирания пыльцы (Melica nutans, Alopecurus pratensis и др.). Во-вторых, причиной высокой СДП мог стать переход популяции на вегетативное размножение, которое сопровождается подавлением семенной репродукции. IIa это, в частности, указывал высокий уровень дегенеративных процессов в женской генеративной сфере, например у Glyceria lithuanica и Роа аппиа. И, в-третьих, к спи-
жению качества пыльцы могла приводить полиплоидность отдельных растений в некоторых популяциях (Bromopsix variegata. Milium veníale и др.), на что указывала полинуклеолярная структура ядерного аппарат. Следует отметить, что характерной особенностью пыльцы половых форм является однородность ее по размеру. Как нормальные,, так и дефектные пыльцевые зерна имеют одинаковую величину, но первые выполнены, а вторые характеризуются либо разной степенью плазмолиза, либо полным отсутствием содержимого.
Данные о качестве пыльцы в популяциях, в которых на основании анализа женской генеративной сферы установлены эмбриологические признаки апо-миксиса, представлены в таблице 2. Таких популяций - 26. Уровень дефектности пыльцы (СДП) между популяциями колеблется в широких пределах: от 14,6% у Festuca valesiaca до 98% у Роа glauca.
Внутри популяции также наблюдается значительное варьирование величины СДП. Например, у разных растений Festuca drimeja (выборка составила 13 особей) качество пыльцы колебалось от слабой дефектности (СДП не превышала 10%) до полной стерильности. Нормальная (выполненная, не-илазмолизированная пыльца) у одних особей была однородной, у других - различалась но размеру и степени окрашенности. Аналогичная ситуация наблюдалась у F.jimilensis: из 10 растений у трех пыльца была нормальной, а у остальных СДП колебалась от 13.1 до 44,7%.
Дисперсионный анализ и вычисление коэффициента вариации показали достоверность различий между отдельными особями по СДП, а также зависимость качества пыльцы от положения цветка в соцветии.
В разных популяциях одного вида разной была не только средняя степень дефектности пыльцы, но и распределение растений в выборках но данному показателю (рис.i).
Для F.gigantea определена доля влияния на качество пыльцы двух факторов: принадлежности пыльцы разным особям и положения цветка в соцветии. Для первого она составила 29%, а для второго - 16%. Остальное приходится на долю неисследованных и случайных факторов.
Степень дефектности пыльцы в популяции F.valesiaca из коллекции Бот-сада СГУ колебалась от 33,3 до 70,1% и в среднем составила 51,3%. В данном случае низкое качество пыльцы можно было бы целиком отнести на счет апо-миксиса, так как у этого вида нами установлена апоархеспория'.
' шюархесиория - один из типов апомиксиса. при котором зародышевый меток развивается из соматической клетки семяпочки.
Таблица 2.Качество пыльцы в апомиктичных популяциях злаков
Вид Место обитания популяции Качество пыльцы (СДП, %)
Festuca drimeja Северный Кавказ 32,0
F. gigantea Окрестности г.Саратова 41,3
Абхазия 10,0
F.jimilensis Северный Кавказ 20,8
F.rubra Приполярный Урал 26,7
Камчатка, г.Елизово 35,8
Камчатка, побережье Тихого океана 52,9
F.ruprcchtii Абхазия 10,6
F.sulcata Северный Кавказ 38,2
F.valesiaca г.Саратов, Ботсад СГУ* 51,3 14,6
Окрестности г.Саратова 19,7
Ilierochloe glabra Камчатка, г.Елизово 91,5
Камчатка, побережье Тихого океана 81,0
Koeleria sabuletorum Окрестности г.Саратона Незрелая пыльца
Poa angustifolia Камчатка 48,5
Приполярный Урал 28,8
Якутия 63,8
¡•.Саратов 25,5
P. glauca Якутия 98,0
P.macrocalyx Камчатка 79,6
P.malacantha Камчатка 41,0
P.nemoralis Камчатка 53,9
P.pratensis Камчатка 29,2
г.Саратов 31,9
P.radula Камчатка 87,7
P.sublanata Камчатка 77,2
Примечание: * Популяция была исследована днажлы в разные сезоны.
Однако имелась и другая причина: популяция находилась на начальном этапе семяобразования, когда начался естественный процесс дегенерации мужских половых клеток. В этой же популяции в другой сезон средняя СДП равнялась 14,6%, но качество пыльцы среди растений довольно значительно варьировало. Пыльца была неоднородна по размеру, и у разных растений доминировали разные типы пыльцевых зерен.
В другой популяции Р.\чйех1аса из Саратовской области было исследовано 30 растений. Средняя СДП составила 19,7%. Несмотря на сравнительно невысокий уровень дефектности, варьирование пыльцы по размеру было очень значительным: коэффициент вариации колебался от 65,2 до 117,7%. Величина СДП достоверно возрастала с уменьшением диаметра дерновины.
У Р.гиргесЫп при низком уровне средней СДП (10,6%) качество пыльцы в популяции варьировало от 100%-ной фертильности до 18%-ной дефектности. И у этого вида в пределах пыльника наблюдалась неоднородность пыльцы по размеру. Изменения в структуре цветка у некоторых экземпляров
F.ruprechtii говорили о том, что колебания уровня дефектности могут быть связаны с переходом от обоенолости к раздельнополости. Так, в верхних цветках колосков верхней части соцветий завязи были мелкими и часто не содержали зародышевого мешка, а в пыльниках развивалось большое количество пыльцы. В нижних цветках колосков средней и нижней частей соцветий завязи были крупными, а вместо тычинок имелись стаминодии.
В двух камчатских популяциях зубровки (Hieroc.hloe glabra) пыльцы у растений было мало, или она отсутствовала совсем. Почти полная пыльцевая стерильность была обусловлена не только апомиксисом, но и тем что популяция находилась в завершающей фазе цветения.
Все изученные виды мятлика имели низкое качество пыльцы (см. таблицу 2), что в значительной степени связано с апомиксисом, гак как все популяции характеризовались автономным эмбриогенезом. При разных величинах СД11 (от 28,8% у Рпа angustifolia до 98% у P.gluuca) во всех изученных популяциях наблюдалось сильное варьирование размеров пыльцы. Так, например, у P.malacantha диаметр пыльцы колебался от 0,06 до 5,15 мкм, а у P.macrocalyx от 0,08 до 6,35 мкм. В пыльниках было много пустых пыльцевых зерен.
Обсуждение
Проведенное исследование показало, что в большинстве случаев между половыми и апомиктичными популяциями злаков существуют значительные различия по признаку «качество пыльцы». Однако такая закономерность проявляется только при условии правильного выбора времени фиксации материала (начальная стадия открытого цветения). Поздний срок фиксации искажает действительную картину состояния мужской генеративной сферы у половых видов, значительно повышая уровень дефектност и за счет начала естественных дегенеративных процессов. С другой стороны, даже при своевременной фиксации, влияние таких факторов как полиплоидия и переход на вегетативное размножение снижает качество пыльцы. В результате этого величина СДП половых видов может сравняться, а иногда и превысить СДП псевдогамных апо-миктов, качество пыльцы которых бывает достаточно высоким, что связано с необходимостью у них оплодот ворения для развития эндосперма. Таким образом, действие целого ряда факторов может стереть 1рань между качеством пьшьцы половых и апомиктичных популяций и затруднить диагностику ано-миксиса.
Однако при совпадении количественных показателей СДП у половых и апомиктичных популяций, качественные характеристики пыльцы всегда остаются разными. У половых форм пыльца однородна по размеру, а у апомиктичных - легко визуально разделяется на три группы: крупная, средняя и мелкая.
Варьирование размера пыльцы апомиктов может быть следствием ее генетической неоднородности, обусловленной такими явлениями как нередукция, анеуплоидия, дополнительные деления половых клеток. Они могут приводить к формированию разных типов пыльцы: нередуцированной, редуцированной,
аиеунлоидкой и с дополнительными спермиями, которые неизбежно будут иметь разный размер. В соответствии с антморфологическим методом нормальными считаются только выполненные пыльцевые зерна среднего размера, а крупные и мелкие - дефектными. Такое определение, на наш взгляд, является некорректным, гак как разные по размеру и нлоидности, но выполненные пыльцевые зерна могут, а скорее всего, должны быть функциональными. Формирование генетически неоднородной пыльцы, на наш взгляд, является одним из механизмов регуляции соотношения плоидности зародыша и эндосперма. Большинство апомикзичных злаков являются факультативными апомиктами, у которых наряду с разными типами нередуцированных зародышевых мешков развиваются и нормально функционируют редуцированные зуспорические. Обеспечить оптимальное соотношение плоидности зародыша и эндосперма во всех типах женских гаметофигов можно, в том числе, и за счет производства генетически неоднородной пыльцы.
В отличие от апомиктов, для половых форм формирование генетически и, как следствие, морфологически неоднородной пыльцы имело бы противоположный эффект, так ее участие в оплодотворении привело бы к дисбалансу плоидности зародыша и эндосперма. Отклонение от соотношения 2п:3п, характерное для половых видов, нарушило бы процессы эмбрио- и эндоспермогенеза (Ноглер, 1990; На1§, \Vestoby, 1991) и снизило семенную продуктивность. В связи с этим, если у половых видов в результате спонтанных нарушений мик-роспорогенеза и образуются отклоняющиеся типы пыльцевых зерен, то только в единичном количестве.
Учитывая все вышесказанное, в качестве основного критерия при диагностике аломиксиса антморфологическим методом вместо количественной оценки степени дефектности пыльцы целесообразнее использовать визуальный признак «морфологическая неоднородность пыльцы». Это значительно сокращает и упрощает анализ.
Литература
Куприянов Г1.Г., Жолобова В.Г. Уточнение понятий нормальная и дефектная пыльцы в аптморфологичсском методе II Лпомиксис и цитоэмбриология растений. Саратов, 1975. Вып.З. С.47-52.
Куприянов П.Г. Соотносительная роль факторов, вызывающих появление дефектных пыльцевых зерен в природе // Апомиксис и цитоэмбриология растений. Саратов, 1983. Вып.5. С.3-33.
Куприянов, П.Г. Диагностика систем семенного размножения в популяциях цветковых растений. Саратов, 1989. 160с.
Ноглер Г.А. Гаметофитный апомиксис // Эмбриология растений: использование в генетике, селекции и биотехнологии. Г.2. М., 1990. С.39-82.
Паушева З.П. Практикум по цитологии растений. М., 1970.- 45 с.
Хохлов С.С., Зайцева М.И., Близнюк Л.А. Антморфологический метод обнаружения апомиктичных форм в природе // Проблемы аномиксиса у растений и животных. Новосибирск, 1973. С. 19-21.
Хохлов С.С., Зайцева M.И., Куприянов 11.Г. Выявление апомиктичных форм во Флоре цветковых растений СССР. Саратов, 1978. 224 с.
Haig П., Wcstoby M. Genetic imprinting in endosperm - its effect on seed development in crosses between species, and between different ploidies of same species, and its implication for the evolution of apomixis // Phil. Trans. Roy. Soc. London (B) Biol. Sci. 1991. N 333. P.l-13.
УДК 581 -163
ПОЛУЧЕНИЕ ФОРМ КУКУРУЗЫ С ЗАМЕЩЕННОЙ ЦИТОПЛАЗМОЙ МЕТОДОМ AI 1ДРОГЕ1IE3A IN VIVO
А.Н. Завалишина, B.C. Тырнов Саратовский государственный университет ми. Н.Г. Чернышевского
Цитоплазматическая мужская стерильность (ЦМС) широко используется в селекции при получении гетерозисных гибридов растений. Кроме того, цитоплазма может оказывать влияние на устойчивость к факторам внешней среды и заболеваниям, длительность вегетационного периода, качество белка, урожайность и ряд других признаков (Орлов, 2001). Все это свидетельствует о важной роли цитоплазмы в изменении признаков и необходимости исследования закономерностей их проявления.
Изменчивость признаков под влиянием цитоплазмы исследуют, как правило, в потомстве, полученном путем реципрокных и насыщающих скрещиваний. Однако эти методы не позволяют достаточно полно и точно дифференцировать вклад генома и плазмона, так как этим методам может сопу тствовать ряд явлений, искажающих результаты - кроссинговер, предпочтительное отхожде-ние отдельных хромосом материнской формы в женские гаметы, влияние спорофита и др. Более привлекательно использование для создания аллоплазмати-ческих линий явления андрогенеза in vivo. Его суть заключается в следующем. При оплодотворении, в силу ряда причин, енермий замещает ядро яйцеклетки. В результате развивается андрогенный зародыш, имеющей материнскую цитоплазму и ядро отцовского родителя. Среди андрогенных растений встречаются гаплоиды и диплоиды. Частота встречаемости андрогенных особей в норме в природе крайне низкая. Для кукурузы установлена средняя частота встречаемости андрогенеза от 1:80000 до 1:800000 (Chase, 1969; Тырнов, 1986). Вместе с тем у этой культуры была обнаружена линия, имеющая ген ig (indeterminate gametophyte), у которой андрогенез встречался с частотой свыше 2 % (Kermi-cle, 1969, 1971, 1994).Такая частота позволяла использовать эту линию в практической селекции для ускоренного создания аналогов линий с ЦМС.
Линия с геном ig (W23 ig) была получена нами из Краснодарского НИИСХ. Однако она оказалась крайне позднеспелой. Начало цветения наступало только в конце августа в нашей зоне Юго-Востока. Поэтому было необходимо создать более скороспелые, вызревающие андрогенезиидуцирущие формы кукурузы, которые можно было бы использовать как для практической селекции, так и для фундаментальных исследований. Это, естественно, трсбо-
