CC BY
388
Я • 7universum.com
UNIVERSUM:
/УУ\ ХИМИЯ И БИОЛОГИЯ
НОВЫЙ ПЕРСПЕКТИВНЫЙ ШТАММ BACILLUS SUBTILIS
Пархоменко Татьяна Юрьевна
канд. с.-х. наук, с. н. с., ученый секретарь ГБУ «Научно-исследовательский институт сельского хозяйства Крыма»,
РФ, Крым, г. Симферополь E-mail: tat.parkhomenko@rambler. ru
Новиков Илья Анатольевич
младший научный сотрудник, ГБУ «Научно-исследовательский институт сельского хозяйства Крыма»,
РФ, Крым, г. Симферополь
THE NEW PERSPECTIVE STRAIN OF BACILLUS SUBTILIS
Parkhomenko Tatyana
Candidate of Agricultural Sciences, Senior researcher, scientific secretary,
The State budget Institution of Republic Crimea «Research Institute of agricultural of Crimea»,
Russia, Crimea, Simferopol
Novikov Ilya
Junior researcher, The State budget Institution of Republic Crimea
«Research Institute of agricultural of Crimea»,
Russia, Crimea, Simferopol
АННОТАЦИЯ
Новый перспективный штамм 19 идентифицирован как B. subtilis. Изучены его морфолого-биохимические особенности. Штамм по уровню и спектру антагонистической активности не уступает референтному штамму B. subtilis D-26, нефитотоксичен. Штамм B. subtilis 19 не обладает резистентностью к изученным антибиотикам: зона подавления роста составляла от 11 до 24 мм.
Пархоменко Т.Ю., Новиков И.А. Новый перспективный штамм Bacillus Subtilis // Universum: Химия и биология : электрон. научн. журн. 2015. № 3-4 (12) .
URL: http://7universum.com/ru/nature/archive/item/2045
Показано положительное воздействие штамма B. subtilis 19 на развитие растений моркови и пшеницы озимой в условиях вегетационного опыта.
ABSTRACT
The new perspective strain has been identified as B. subtilis. It has been investigated the morphological and biochemical features. The strain by level and spectrum of antagonistic activity doesn't concede to a reference strain B. subtilis D-26, not phytotoxic. The strain B. subtilis 19 doesn't possess resistance to the studied antibiotics — the zone of suppression of growth was from 11 to 24 mm. Positive influence of the strain B. subtilis 19 on development of plants of carrots and winter wheat under green-house experience has been shown.
Ключевые слова: штамм, Bacillus subtilis, антагонистическая активность, резистентность, улучшение развития растений.
Keywords: strain, Bacillus subtilis, antagonistic activity, resistance, improving of development of plants.
Исследования проведены при поддержке РФФИ проект № 14-44-01652 р_юг_а.
Введение. Среди многочисленных способов защиты растений от болезней наиболее безопасным для человека и окружающей среды является биологический контроль численности фитопатогенных микроорганизмов, в том числе с помощью препаратов на основе микроорганизмов с антагонистическими свойствами. Этот прием биологического земледелия может обеспечить контроль развития болезней в течение всего периода вегетации растений и в период хранения продукции и семян. На современном этапе уже разработаны такие препараты, однако продолжается постоянный поиск более эффективных штаммов [2, с. 14].
Биологический контроль развития фитопатогенов осуществляется благодаря способности микроорганизмов продуцировать антибиотические
вещества, лизировать гифы микромицетов, конкурировать за жизненное пространство и питательные вещества, которые необходимы для развития патогенов [3, с. 3]. Успешное применение микроорганизмов с высокой антагонистической активностью зависит от влияния на растение продуцируемых веществ и жизнедеятельности микроорганизмов.
Таким образом, постоянный скрининг активных природных штаммов микроорганизмов — антагонистов фитопатогенов для биологического контроля является актуальным [5, с. 79; 7, с. 244].
Цель работы состояла в исследовании свойств и идентификации нового природного штамма, выделенного как антагонист возбудителей заболеваний растений.
Методика исследования. Объектом исследований был новый штамм Bacillus sp. 19, выделенный из эпифитной микрофлоры семян томата сорта Шанс. Для сравнения в исследованиях были использованы штаммы рода Bacillus: B. megaterium 5719, B. subtilis 5127 из коллекции Института
микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного (Украина), а также типовые штаммы B. licheniformis ATCC 14580T, B. pumilus ATCC 7061T, B. amyloliquefaciens ATCC 23842T, B. subtilis subsp. subtilis ATCC 6051T — из коллекции ВКМ (Россия).
Первичную идентификацию, изучение физиолого-биохимических свойств проводили согласно методическим рекомендациям и определителю Берджи [1, с. 567; 4, с. 43].
Для проведения молекулярно-биологических исследований данных штаммов и подтверждения их принадлежности к роду Bacillus применялись анализ нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК и методы AFLP-ПЦР: Rep-ПЦР [6, с. 50; 8, с. 2286]: ERIC-ПЦР, BOX-ПЦР, а также saAFLP [9, с. 49].
Антагонистическая активность нового штамма изучалась методом штриха, резистентность к антибиотикам — методом лунок. Для изучения фитотоксической активности штамма использовали биотест на проростках
кукурузы. Тест-объект — семена кукурузы, тест-признак — прирост длины корешков проростка.
Результаты исследования. Новый штамм 19 был выделен из эпифитной микрофлоры семян томата как бактерия, обладающая антагонистическими свойствами к фитопатогенам. На основании микроскопирования он был отнесен к роду Bacillus.
Клетки штамма — подвижные палочки, иногда спаренные. Спорообразование начинается на вторые сутки роста.
Штамм Bacillus sp. 19 хорошо усваивает сахарозу, слабее — глюкозу и маннит, глицерин, крахмал, L-арабинозу, мелибиозу, рибозу, слабо усваивает цитраты, не усваивает этанол, D-ксилозу, лактозу. Не разрушает гликоген. Может разлагать полиоксиэтилены Tween 20 и Tween 80 — неионогенные ПАВ, являющиеся эмульгаторами.
При росте на мясо-пептонном бульоне штамм образует пленку сверху розового цвета, не образует индол, образует аммиак, плохо растет при 37° с. Отмечен рост при рН 5.7 и при 7 % NaCl. Максимальная температура роста составляет 45—50° с. Не отмечено роста в анаэробных условиях. При росте на полужидкой питательной среде роста по уколу не наблюдается, отмечен рост штамма только на поверхности среды (аэроб), газа не образует, выделяет красный пигмент, который постепенно диффундирует в питательную среду. На среде Кинга в ультрафиолетовом цвете также наблюдаем темнорозовый пигмент. Имеет каталазу. На лакмусовом молоке на 7-е сутки происходит образование творожистого осадка (свертывание), на 14 сутки осадок растворяется, образуется жидкость желтого цвета. При утилизации молока продуцируется кислота. Штамм разлагает казеин, хорошо гидролизует крахмал, разлагает эскулин, обладает слабой уреазной активностью. Разлагает желатину при культивировании в мясо-пептонном бульоне с образованием розовой пленки на поверхности и красно-бурого осадка.
Проведенный генетический анализ показал, что исследуемый штамм по анализу 16S рРНК совпадает с типовыми штаммами рода Bacillus. Видовая
идентификация, проведенная на основе анализа участка субъединицы Б гиразы (далее gyrB), показала сходство исследуемого штамма с типовым штаммом B. subtilis subsp. subtilis ATCC 6051T. Согласно методу saAFLP, позволяющему отобразить не только видовое, но и штаммовое разнообразие, штамм Bacillus sp. 19 также попал в одну группу со штаммом B. subtilis subsp. subtilis ATCC 6051T.
По антагонистическим свойствам штамм практически не уступает референтному штамму B. subtilis D-26 и имеет широкий спектр антагонистической активности к микромицетам — возбудителям болезней сельскохозяйственных растений (табл. 1).
Таблица 1.
Антагонистическая активность нового штамма Bacillus sp. 19 к микромицетам — возбудителям заболеваний растений
Исследуемый штамм Зона угнетения роста тест-организма, мм
Fusarium oxysporum Penicillium veridicatum Fusarium glumarum Fusarium poea Fusarium moniliforme Eupenicillium meridianum
Bacillus subtilis D-26 7,75 ± 0,75 2,65 ± 0,91 10,00 ± 1,08 5,50 ± 0,53 10,25 ± 0,48 2,04 ± 1,17
Bacillus subtilis 19 5,67 ± 0,67 1,03 ± 0,25 5,71 ± 0,36 5,38 ± 0,71 7,50 ± 1,04 3,25 ± 1,11
Резистентность штамма к антибиотикам является важным показателем. Так, штамм B. subtilis 19 не обладал резистентностью к антибиотикам аминогликозидной группы, которые нарушают синтез белков рибосомами. Зона подавления роста штамма к стрептомицину, канамицину, амикацина сульфату составляла 11 мм. Цефалоспориновые антибиотики, которые разрушают клеточную стенку микроорганизмов, — цефазолин, цефтриаксон, цефатоксим, приостанавливают рост штамма от 20 до 24 мм. Также не наблюдалось устойчивости штамма и к антибиотикам класса пенициллинов, действующих на поздних этапах синтеза клеточной стенки. Зона подавления роста штамма пенициллином, ампициллином, бензилпенициллином, бициллином-3, бициллином-5 составляла 16—17 мм (рис. 1).
Так как антагонистическая активность штаммов связана
с продуцированием ими биологически активных веществ, была проведена оценка фитотоксичности штамма. Показано, что как при использовании
исходной концентрации, так и при разбавлении водной суспензии штамма Bacillus sp. 19 от 10 до 1000 раз, этот показатель достоверно не отличается от референтного штамма B. subtilis D-26 и не превышает 12 %.
к го
1 ® ф
ф ^
Sr -Q ^ 3 05 «О
5 «
О з
со =5 о со QQ
□ Стрептомицин ■ Канамицин □ Ампициллин □ Бензилпенициллин
■ Пенициллин □ Бициллин-3 ■ Амикацин □ Цефазолин
■ Цефтриаксон □ Цефотаксим
Рисунок 1. Устойчивость штамма Bacillus subtilis 19 к различным антибиотикам
В вегетационныхй опытах показано, что предпосевная обработка штаммом B. subtilis 19 достоверно повышает биомассу проростков моркови сорта Шантане на 15 % в сравнении с контрольным вариантом — обработкой водой, на 18 % в сравнении с обработкой референтным штаммом. Отмечено позитивное влияние штамма на развитие растений моркови. Так, под действием штамма B. subtilis 19 повышается высота растений на 34 % и сухая масса надземной части — на 47 % в сравнении с контролем. Не отмечено положительного влияния штамма на развитие корневой системы моркови.
На растениях пшеницы озимой сорта Паляница исследуемый штамм способствовал лучшему развитию растений. Так, воздушно-сухая масса надземной части и корневой системы пшеницы в контрольном варианте составляла 0,12 г и 0,11 г соответственно. При обработке семян перед высевом штаммом B. subtilis 19 эти показатели достоверно увеличивались — воздушносухая масса корневой системы составляла 0,19 г (превышение контроля
на 61 %), корневой системы — 0,18 г (превышение показателя контрольного варианта на 54 %).
Вывод. Таким образом, выделенный штамм 19 общепринятыми микробиологическими и новыми молекулярно-биологическими методами идентифицирован как B. subtilis. Исследованный штамм по уровню и спектру антагонистической активности не уступает референтному штамму B.subtilis D-26, не фитотоксичен. Штамм B. subtilis 19 не обладает резистентностью к антибиотикам аминогликозидной группы, цефалоспоринам и пенициллинам. Зона подавления роста составляла от 11 до 24 мм. Показано положительное воздействие штамма B. subtilis 19 на развитие растений моркови и пшеницы озимой в условиях вегетационного опыта.
Список литературы:
1. Определитель бактерий Берджи. Справочное издание / под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита и др. в 2-х томах. — М.: Мир,1997. — Т. 2. — с. 567—568.
2. Рева О.Н., Полтавський А.П. Использование полимеразной цепной реакции для идентификации штаммов эндофитного экотипа Bacillus amyloliquefaciens // Мшробюлопчний журнал. — 2005. — Т. 67, № 4. — с. 14—20.
3. Смирнов В.В., Рева О.Н., Вьюницкая В.А. Распределение бактерий рода Bacillus на кластеры по спектру антагонистической активности // Мжробюлопчний журнал. — 1995. — Т. 57, № 1. — с. 3—13.
4. Смирнов С.Р. Резник, Сороулова И.Б. Методические рекомендации по выделению и идентификации бактерий рода Bacillus из организма человека и животных // Институт микробиологии и вирусологии. — Киев, 1983. — 51 с.
5. Шерстобоева О.В. Елементи технологи застосування Bacillus polymyxa — дiазотрофа з антифунгальними властивостями // Физиология и биохимия культурных растений. Научно-теоретический журнал. — 2003. — Т. 35, № 1 (201). — с. 79—83.
6. Epplen J.T. Oligonucleotide Fingerprinting using Simple repeat Motifs: A convenient, Ubiquitously Applicable Method to Detect Hypervariability for Multiple Purposes / J.T. Epplen, H. Ammer, C. Epplen // eds G. Burke, G. Dolf, A.J. Jeffreys, Wolff r. Basel: Birkhauser, 1991. — Р. 50—69.
7. Huang Zh., Bonsall R.F., Mavrodi D.V. et al. Transformation of Pseudomonas fluorescens with genes for biosynthesis of phenazine-1-carboxylic acid improves biocontrol of rhizoctonia root rot and in situ antibiotic production // FEMS Microbiolocy Ecology. — 2004. — Vol. 49, Issue 2. — P. 243—251.
8. Louws F.J., Fulbright D.W., Stephens C.T.et al. Specific genomic fingperints of phytopathogenic Xanthomonas and Pseudomonas Pathovars and strains generated with repetitive sequences and PCR.// Appl. environ. Microbiol. — 1994. — Vol. 60. — с. 2286—2295.
9. Zotov V.S., Punina N.V., Khapchaeva S.A., Didovich S.V. et al. New taxonomic marker — hin-region // Ekologicheskaya genetika. — 2012. — Т. 2. — C. 49—62.
