CC BY
46
УДК 611.231:611.018.7:616-076.4
НОВЫЙ МЕТОД ИЗУЧЕНИЯ УЛЬТРАСТРУКТУРНОЙ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ПОКРОВНОГО ЭПИТЕЛИЯ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ТРАХЕИ
С.С.Целуйко1, Н.А.Вислобоков2, П.Р.Казанский2, Н.В.Швындина2, В.Я.Шкловер2, Д.А.Семенов',
М.М.Горбунов'
'Амурская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития РФ, 675000, г. Благовещенск,
ул. Горького, 95
2000 «Системы для микроскопии и анализа», 119333, г. Москва, Ленинский проспект, 59
РЕЗЮМЕ
Цель исследования - с помощью нового подхода установить трехмерную пространственную организацию реснитчатого эпителия трахеи интактных крыс. Продемонстрировано, что объемная электронная микроскопия, или сканирующая электронная микроскопия с применением фокусированного ионного пучка - перспективный метод исследования биологических объектов. Послойное травление поперечного среза зафиксированного и контрастированного препарата биологической ткани фокусированным ионным пучком с последующей визуализацией структуры с детектором обратноотраженных электронов в двухлучевой системе FIB/SEM позволяет адекватно восстановить трехмерную структуру объекта из большой серии электронно-микроскопических изображений последовательных поперечных срезов. Полученная при этом структурная информация позволяет визуализировать сложную микроанатомию тканей на субклеточном уровне. В результате выполненных ЗБ-реконструкций получена информация о топологии компартментов реснитчатых эпителиальных клеток слизистой оболочки трахеи крыс и пространственной геометрии ультраструктур, визуализированы внутриклеточные структуры, реконструировано тонкое строение субмикроскопических деталей поверхности эпителия трахеи - ресничек и микроворсинок.
Ключевые слова: ЗВ-реконструкции, реснитчатые клетки, покровный эпителий трахеи.
SUMMARY
NEW METHOD FOR THE STUDY OF ULTRASTRUCTURAL SPATIAL ORGANIZATION OF TECTORIAL EPITHELIUM OF THE TRACHEA MUCOSA
S.S.Tseluyko1, N.A.Vislobokov2, P.RKazanskiy2,
N.V.Shvyndina2, V.Ya.Shklover2, D.A.Semenov1, M.M. Gorbunov1
'Amur State Medical Academy, 95 Gor'kogo Str., Blagoveshchensk, 675000, Russian Federation 2Public Joint Stock Company «Systems for Microscopy
and Analysis», 59 Leninskiy Ave., 119333, Moscow, Russian Federation
The aim of the research is to find out a three-dimensional spatial organization of ciliated epithelium of intact rats trachea. It is demonstrated that solid
electronic microscopy or scanning electronic microscopy with the application of focused ion beam is a perspective method of biological objects study. Layer-by-layer etching of transverse section of fixed and contrasted preparation of biological tissue by the focused ion beam with the further visualization of the structure with the detector of back-reflected electrons in the double-beam system FIB/SEM allows to restore a three-dimensional structure of the object out of a big range of electronically microscopic images of successive transverse sections. Obtained structural information allows to visualize a complex microanatomy of tissues at the subcellular level. As a result of these 3D-reconstruc-tions the information about the topology of compartments of ciliated epithelial cells of rats trachea mucosa and spacious geometry of ultrastructures was obtained, intracellular structures were visualized, and a thin texture of submicroscopic details of trachea epithelium surface (cilia and microvilli) was reconstructed.
Key words: 3D-reconstructions, ciliated cells, tectorial epithelium of trachea.
Ультраструктурная пространственная организация компартментов реснитчатого эпителия трахеи является одним из важных и интереснейших разделов морфологии легких. Знание закономерностей пространственной организации клеточных элементов многоднорядного реснитчатого эпителия воздухоносного отдела легких необходимо для понимания их морфогенеза в индивидуальном и эволюционном развитии.
В настоящее время пространственная ультраструктурная организация клеточных элементов реснитчатого эпителия трахеи изучена недостаточно [1]. В особенности это касается трехмерной организации компартментов эпителиоцитов эпителия трахеи дыхательной системы. Такое состояние дел объясняется двумя причинами. Во-первых, характером основного метода цитологических исследований, который заключается в ультрамикроскопическом изучении срезов, не дающих представления о трехмерной организации клеток. Во-вторых, неспособностью существующих теорий пространственной ультраструктурной организации клеток компенсировать это несовершенство, так как сами теории еще недостаточно разработаны [3, 4, 5]. В этих условиях реконструкция пространственной организации эпителиев остается чисто эмпирической и обладает низкой разрешающей способностью. Исследователю необходимо изучить большое число срезов, что делает реконструкцию очень трудоемкой. В
результате ультраструктурная пространственная организация реснитчатого эпителия, особенности трехмерной структуры, остаются неизвестными, что сдерживает развитие знаний об их морфогенезе. В практическом аспекте установление этих закономерностей поможет выяснению механизмов патологического развития хронического обструктивного бронхита и, возможно, в перспективе позволит управлять данным процессом.
В существующих условиях возможна лишь эмпирическая методика реконструкции трехмерной структуры тканей по серийным срезам. Поскольку такая методика не опирается на модели и не предполагает никакого знания о клеточном строении на каждом последующем уровне, то для осуществления реконструкции требуются максимальное число срезов и сложная процедура их совмещения [2]. Разрешающая способность этой методики остается низкой даже при использовании такой современной техники, как растровая и трансмиссионная электронная микроскопия и компьютерные технологии реконструкции и визуализации. В итоге, недостаточность знаний о пространственной организации клеточных элементов тормозит изучение закономерностей их морфогенеза в процессе нормального развития и не позволяет понять суть их трансформации при патологии. В предлагаемой статье предпринята попытка решения указанной проблемы.
Цель исследования - с помощью нового подхода установить трехмерную пространственную организацию реснитчатого эпителия трахеи интактных крыс.
Результаты исследования и их обсуждение
В настоящей работе был исследован образец участка ткани эпителия трахеи интактных крыс. Все исследования были проведены с учетом требований Хельсинской декларации Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных исследований с участием человека» с поправками 2000 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом М3 РФ от 19.06.2003, №266. В качестве метода подготовки препарата для последующей объемной реконструкции был использован стандартный протокол изготовления образцов для просвечивающей электронной микроскопии. Образец ткани фиксируют в 2,5%-м глютаральде-гиде, далее в 1%-м растворе осмиевой кислоты; дегидратируют переводя через серию растворов этанола (50, 75 и 95%) в 100% ацетон; далее выдерживают в смеси 50% ацетон + 50% аралдит и заливают в арал-дит.
Подготовленный вышеописанным методом образец закрепляют на предметном столике и помещают в электронный микроскоп «Quanta 3D FEG» (производство компании FEI), оснащенный двухлучевой системой FIB/SEM. Особенность данного прибора заключается в наличии ионной пушки (фокусированный ионный пучок - FIB), с помощью которой возможно травление образца, а также напыление защитного слоя металла на образец. Также прибор оснащен электронной пушкой, как стандартный ска-
нирующий электронный микроскоп (SEM). С помощью электронного пучка возможно получение растровых изображений поверхности образца.
Выбрав область интереса на образце, сначала с помощью газоинжекционной системы (GIS) и ионной пушки напыляют защитный слой платины толщиной
0,2 мкм на поверхность данной области. Далее, с помощью ионного пучка при токе 2,5 пА и ускоряющем напряжении 30 kV протравливают канавки с трех сторон от области интереса, тем самым обособляя блок (примерно 10x10x10 мкм) для последующей объемной реконструкции (рис. 1).
С помощью электронного пучка при токе 0,1 пА и ускоряющем напряжении 3 kV получают изображение передней поверхности блока, используя детектор обратно отраженных электронов. Затем данную поверхность стравливают на глубину 50 нм с помощью фокусированного ионного пучка и снова получают изображение поверхности блока. Повторяя процедуру стравливания и сканирования, получают набор слайдов. В данной работе был получен набор из 150 слайдов. Поскольку указанная процедура весьма трудоемкая и требует много времени, было использовано программное обеспечение Auto Slice & View G3 для получения набора слайдов в автоматическом режиме.
Для последующей объемной реконструкции мик-роанатомического строения и субклеточных структур используют программный комплекс Amira ResolveRT. Данное программное обеспечение является мощным универсальным инструментом объемной реконструкции и моделирования, и с успехом применяется в различных областях науки и техники, таких как медицина, биология, материаловедение, исследование нанораз-мерных объектов. С помощью Amira ResolveRT набор слайдов обрабатывают и получают объемную реконструкцию изучаемого объекта. При этом ЗО-рекон-струкцию можно проводить как в автоматическом режиме - реконструкции объема по контрасту исходных изображений (рис. 2), так и в ручном режиме - по-слайдовой разметке отдельных структур (рис. 3, 4). Программа позволяет рассчитывать такие параметры объекта, как линейные размеры, объемы и площади поверхности отдельных деталей структуры. Проведение расчетов и визуализация результатов осуществляются непосредственно в программной среде Amira ResolveRT.
Результаты исследования свидетельствуют о том, что объемная электронная микроскопия, или сканирующая электронная микроскопия с применением фокусированного ионного пучка - перспективный метод исследования биологических объектов. Послойное травление поперечного среза зафиксированного и контрастированного препарата биологической ткани фокусированным ионным пучком с последующей визуализацией структуры с детектором обратноотраженных электронов в FIB/SEM позволяет адекватно восстановить трехмерную структуру объекта из большой серии электронно-микроскопических изображе-
ний последовательных поперечных срезов. Получен- зуализировать сложную микроанатомию тканей на
ная при этом структурная информация позволяет ви- субклеточном уровне.
Рис. 1. А - блок, подготовленный к получению серии срезов и слайдов. Сверху напылен слой платины, по бокам протравлены канавки для переосаждения стравленного материала. Промежуточный этап получения слайдов. Б, В, Г, Д, Е - серия последовательных срезов. 1. Митохондрии. Видны на всех снимках, яркие белые структуры, в данном случае сильно разветвленные. Внутри просматриваются кристы. 2. Реснички. 3. Микроворсинки. 4, 11. Эндоплазматический ретикулум. 5. Плотный клеточный контакт. 6. Десмосомы. 7. Бактерии. 8. Органеллы с гетерогенным содержимым. 9. Секреторные гранулы. 10. Включения в клетке, ограничивающей выводной проток белково-слизистой железы из подслизистой основы. 12. Лизосомы. 13. Микроорганизмы.
Рис. 2. Реконструкция объема образца с помощью программного обеспечения Amira ResolveRT в автоматическом режиме (функция Volume Rendering). Объемная структура построена по контрасту исходных изображений.
Рис. 3. Реконструкция участка эпителия трахеи (несколько клеток). Желтым (1) обозначены митохондрии, зеленым (2) - бактерии, розовым (3) - включения в клетке, ограничивающей выводной проток белково-слизистой железы, фиолетовым (4) - лизосомы, черным (5) - расширенные канальцы ЭПР, зеленым - бактерии.
Рис. 4. Все то же самое, что на рисунке 3, но с мембранами. Голубым (1) обозначены мембраны, синим (2) -плотный клеточный контакт и десмосомы.
5. Ultrastructure and stereology of cardiomyocytes in the development of regenerative and plastic myocardial insufficiency during ontogeny / L.M.Nepomnyashchikh [et al.] // Bull. Exp. Biol. Med. 2011. Vol.151, №1. P.88-94.
REFERENCES
1. VideoTesT-Moifologiya [VideoTesT-Morphology]. Available at: http:www.videotest.ru/ru/app/179 (accessed 02 August 2012).
2. Pogorelov A.G., Aksirov A.M., Golichenkov V.A., Pogorelova M.A., Yashin V.A. Tsitologiya 2007; 49(9):784.
3. Savost'yanov G.A. Osnovy strukturnoy gistologii. Prostranstvennaya organizatsiya epiteliev [The basics of structural histology. Spatial organization of epithelium]. St. Petersburg: Nauka; 2005.
4. Shklover V.Ya., Kazanskiy PR., Tseluyko S.S. XXIV Rossiyskaya konferentsiya po elektronnoy mikroskopii: tezisy dokladov (XXIV Russian conference on electronic microscopy: abstracts). Chemogolovka; 2012: p.511.
5. Nepomnyashchikh L.M., Lushnikova E.L., Molodykh N.A., Klinnikova M.G., Molodykh O.P Ultrastructure and stereology of cardiomyocytes in the development of regenerative and plastic myocardial insufficiency during ontogeny. Bull. Exp. Biol. Med. 2011; 151(1): 88—94.
Поступила 07.08.2012
Контактная информация
Сергей Семенович Целуйко, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой гистологии, Амурская государственная медицинская академия, 675000, г. Благовещенск, ул. Горького, 95.
E-mail: agma@nm.ru Correspondence should be addressed to Sergey S. Tseluyko, MD, PhD, Professor, Head of Department of Histology>, Amur State Medical Academy, 95 Gor'kogo Str., Blagoveshchensk, 675000, Russian Federation.
E-mail: agma@nm.ru
В результате выполненных ЗО-реконструкций получена информация о пространственной геометрии реснитчатых клеток эпителиального пласта трахеи крыс, визуализированы внутриклеточные структуры, реконструировано тонкое строение субмикроскопиче-ских деталей поверхности эпителия трахеи - ресничек и микроворсинок.
ЛИТЕРАТУРА
1. ВидеоТесТ-Морфология. URL:
http:www.videotest.ru/ru/app/179 (дата обращения: 02.08.2012).
2. Количественный анализ изменения объема бластомера мыши в результате осмотического шока: 3-D реконструкция и лазерная сканирующая микроскопия / А.Г.Погорелов [и др.] // Цитология. 2007. Т.49, №9. С.784.
3. Савостьянов Г.А. Основы структурной гистологии. Пространственная организация эпителиев. СПб.: Наука, 2005. 375 с.
4. Шкловер В.Я., Казанский П.Р, Целуйко С.С. 3D-реконструкция биологических объектов с использованием системы Dual Beam FIB/SEM Quanta 3D FEG // XXIV Российская конференция по электронной микроскопии: тезисы докладов. Черноголовка, 2012. С.511.
