CC BY
47
УДК 616.24-001.8:612-086.2]612-092.4 DOI: 10.12737/23250
РАСТРОВАЯ КРИОЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ ЛЕГКИХ У КРЫС ПРИ
ХОЛОДОВОМ ВОЗДЕЙСТВИИ
С.С.Целуйко, С.В.Зиновьев, М.М.Горбунов, Д.П.Решодько
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Амурская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации,
675000, г. Благовещенск, ул. Горького, 95
РЕЗЮМЕ
Цель исследования - изучить методом растровой криоэлектронной микроскопии без фиксирования и обезвоживания прижизненно важные структуры мукоцилиарного конвейера респираторного и воздухоносного отделов легких у интактных крыс на фоне общего охлаждения. Крысы (самцы) в количестве 40 штук подвергались общему охлаждению в течение 14 дней по 3 часа ежедневно при температуре -15°С. Замороженные в жидком азоте образцы трахеи и легких помещались на замораживающий столик Пельцера (-30С°) приставки DebenCoolstage растрового электронного микроскопа Hitachi S-3400. Исследование проводилось при низком вакууме (80Па) с использованием детектора отраженных электронов (BSECOMP). В результате исследования установлено, что эпителиальная выстилка трахеи крыс покрыта жидким слоем, состоящим из вязкой гелеобразной и водной фаз, маскирующим реснички эпителиоцитов. Слизистый секрет бронхов представлен одиночными пластинками слизи с клеточными элементами. На поверхности альвеол в монослое сурфактанта обнаружены шаровидные скопления решетчатого сур-фактанта. При общем охлаждении на поверхности эпителиального пласта возрастает количество бронхиального секрета, изменяется структура му-коцилиарного аппарата - поверхность слизистой оболочки трахеи становится волнистой и местами отмечается скопление слизи. В эпителиальной выстилке выявляются участки реснитчатого эпителия с преобладанием бокаловидных клеток, лишенных микроворсинок. Секреторная активность бокаловидных клеток и альвеолоцитов 2 типа респираторного отдела сопровождается повышенным выделением секрета, вследствие чего возникает нарушение мукоцилиарного транспорта.
Ключевые слова: криоэлектроннаярастровая микроскопия легких в жидком азоте, общее охлаждение животных.
SUMMARY
SCANNING CRYO-ELECTRON MICROSCOPY OF RAT LUNG AT COLD EXPOSURE
S.S.Tseluyko, M.M. Gorbunov, S.V.Zinoviev, D.A.Reshodko
Amur State Medical Academy, 95 Gor'kogo Str.,
Blagoveshchensk, 675000, Russian Federation
The aim of research is to investigate important structures in vivo of mucociliary conveyor of respiratory and airway parts of the lung of intact rats against general cooling by the method of scanning cryoelectron microscopy without fixation and dehydration. The rats (male) in an amount of 40 pieces were exposed to general cooling during 14 days for 3 hours per day at the temperature of -15°C. Frozen in liquid nitrogen tracheal samples were placed on a freezing Pelzer table (-30°C) of the consoles Deben Coolstage of scanning electron microscope Hitachi S-3400. The study was conducted at low vacuum (80Pa) using backscattered electrons detector (BSECOMP). It was found out that the epithelial lining of the trachea of rats is covered with a liquid layer consisting of viscous gel and aqueous phases masking ciliary epithelial cells. Mucous secretion of the bronchi is presented by single plates with mucus cellular elements. On the alveolar surface in the monolayer of surfactant there were discovered globular clusters of lattice surfactant. With total cooling on the surface of epithelial layer the amount of bronchial secretions increases, the structure of the mucociliary apparatus changes and tracheal mucosa surface becomes wavy and there are sometimes marked accumulations of mucus. In the epithelial lining there are identified areas with the predominance of ciliated epithelium goblet cells lacking microvilli. The secretory activity of goblet cells and type 2 alveolocytes of respiratory department is accompanied by an increased release of secretion causing a disturbance of mucociliary transport.
Key words: scanning cryo-electron microscopy, lungs, total body cooling, animals.
При получении изображения методом трансмиссионной электронной микроскопии возникают определенные трудности в интерпретации ультраструктурной организации клеток и тканей [1-9]. Важное преимущество растровой электронной микроскопии заключается в том, что многие образцы могут исследоваться фактически без предварительной подготовки. Толщина образцов не имеет значения, в противоположность просвечивающей электронной микроскопии. Методы криофиксации (фиксации при очень низких - криогенных температурах) позволяют сохранить структуру и состав без использования химических фиксирующих веществ [5, 8]. Кроме того, криогенные методы позволяют получать изображения замороженных биологических образцов без их обезвоживания. При этом методе кусочки тканей без фиксации и заливки в твер-
дые среды быстро охлаждают в жидком азоте при температуре -196°С. Это обеспечивает торможение метаболических процессов клеток и переход воды из жидкой фазы в твердую [10-24]. Таким образом, метод замораживания позволяет изучать прижизненно различные структуры клеток и тканей и является по сути незаменимым экспресс методом для обнаружения различных изменений, происходящих на поверхности клеток и тканей, которые невозможно изучить в достаточно быстрые сроки при других традиционных методах исследования.
Цель исследования - изучить методом растровой криоэлектронной микроскопии без фиксирования и обезвоживания прижизненно важные структуры муко-цилиарного конвейера респираторного и воздухоносного отделов легких у интактных крыс на фоне общего охлаждения.
Материалы и методы исследования
Исследование проводили на крысах-самцах отряда Rodecia массой тела 200-300 г в количестве 40 штук. Животные подвергались общему охлаждению в течение 14 дней по 3 часа ежедневно при температуре -15°С. Крыс декапитировали с соблюдением требований гуманности согласно Приложению №4 «О порядке проведения эвтаназии (умерщвления) животного» к Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных (приложение к Приказу МЗ СССР №755 от 12.08.1977) с целью получения комплекса органов дыхательной системы.
Замороженные в жидком азоте образцы трахеи и легких быстро разрезались охлажденным острым лезвием бритвы на пластинки толщиной 1 мм и помещались на замораживающий столик Пельцера (-30С°) приставки Deben CoolStage растрового электронного микроскопа Hitachi S-3400. Исследование выполнялось при низком вакууме (80Па) с использование детектора отраженных электронов (BSECOMP). Документирование проводилось при ускоряющем напряжении 15000 вольт.
Результаты исследования и их обсуждение
При исследовании поверхности трахеи крыс обращает на себя внимание рельеф ее слизистой оболочки. На поверхности слизистой оболочки трахеи обнаруживается волнообразное скопление слизи, состоящей из вязкой гелеобразной и водной фаз, и маскирующей реснички эпителиоцитов. Реснички плохо различимы, имеют правильную форму и каждая из них отделена друг от друга. При холодовом воздействии на фоне реснитчатого эпителия выделяются верхушки гипертрофированных апикальных полюсов бокаловидных клеток, лишенных микроворсинок, раздвигающих реснички мерцательных клеток (рис. 1). Секреторная активность бокаловидных клеток сопровождается выделением слизи на поверхность эпителия с разрушением апикального полюса. Вследствие этого в слизи нередко обнаруживаются остатки цитоплазматических элементов. Это приводит к слипанию ресничек, и они на некоторых участках располагаются группами, плохо
различимыми в растровом электронном микроскопе. Картина состояния бокаловидных клеток создает впечатление единой секреторной цикличности, так как все слизеобразующие клетки находятся в одной стадии -выделения.
Апикальная поверхность мерцательных клеток в условиях гиперсекреции имеет много выбуханий. Растровый анализ рельефа реснитчатых клеток выявил большое количество грибовидных выпячиваний.
При общем осмотре замороженного среза респираторного отдела легких отчетливо просматриваются альвеолярные ходы и альвеолы (рис. 2, 3). Размеры альвеол колеблются от 18 до 26 мкм. В респираторном отделе легких периферическая зона каждой альвеолы разделяется отходящими внутрь перегородками на два ряда ячеек. Эти перегородки принято называть альвеолярными септами (рис. 2). В септах кроме эластических волокон располагается сеть тонких коллагеновых волокон, фибробласты, тучные клетки, а также кровеносные капилляры. На поверхности альвеол в монослое сурфактанта обнаружены шаровидные скопления решетчатого сурфактанта размерами от 550 до 230 нм (рис. 4).
В респираторном отделе при холодовом воздействии выявляются участки ателектазов, в то же время на периферии легкого наблюдаются эмфизематозно измененные зоны (рис. 5). Часть альвеол находится в спавшемся состоянии и заполнена жидкостью. Стенки альвеол утолщены за счет значительного числа колла-геновых волокон, имеющих различное направление, расположенных обычно вокруг кровеносных капилляров. Толщина межальвеолярных перегородок увеличивается, хотя встречаются участки с истончением стенки, в связи с чем увеличивается диаметр альвеол (рис. 5). Возрастает диаметр бронхиальных сосудов, в перибронхиальной соединительной ткани обнаруживается явление отека.
Таким образом, при охлаждении в легких появляются очаги фиброза и явления отека. Кровеносные сосуды в большинстве случаев расширены. Усиливается миграция тучных клеток и эозинофилов к эпителию бронхов. Многочисленные макрофаги в расширенных альвеолярных мешочках респираторного отдела легких содержат множество вакуолей и включений. Происходит перестройка слизистой оболочки терминальных бронхиол с явлениями нарушения скорости обновления.
Полученные факты позволяют предположить, что длительное действие низких температур изменяет поверхностную структуру легких, сосудов микроцирку-ляторного звена, что ведет к нарушению кровоснабжения легких. Вероятно, это один из факторов, вызывающих перестройку эпителия и появления участков метаплазии и ателектазов воздухоносного и респираторного отделов легких экспериментальных животных, влияющих на сурфактантно-мукоцилиар-ный клиренс.
На поверхности эпителиального пласта возрастает количество бронхиального секрета, в его составе выявляется высокое содержание гликозаминогликанов,
микроорганизмов и наночастиц. вается продукция сурфактанта с последующей дис-
В респираторном отделе легких при длительных хо- функцией аэрогематического барьера и развитием лодовых воздействиях развивается альвеолит, увеличи- отека в межальвеолярных перегородках (рис. 4).
Рис. 1. А - растровая электронограмма поверхности просвета трахеи, секреторная активность бокаловидных клеток сопровождается выделением слизи с клеточными элементами на поверхность эпителия. Б - растровая электронная микроскопия бронха, стрелками указаны скопления слизи. Датчик отраженных электронов. Давление в камере - 80 Ра. Крио-метод замораживания. Увеличение: А - 1200, Б - 300.
Рис 2. Растровая электронная микроскопия легких у интактных крыс. А - стрелками указаны альвеолярные ходы. Б - стрелками указаны альвеолярные поры Кона. Препарат получен методом замораживания и раскалывания. Датчик отраженных электронов. Давление в камере - 80 Ра. Увеличение: А - 100, Б - 1000.
Рис 3. Растровая электронная микроскопия легких у интактных крыс. Препарат получен методом замораживания и раскалывания. Стрелками указаны альвеолы (А, Б). Датчик отраженных электронов. Давление в камере -80 Ра. Увеличение: А, Б - 1000.
'¿ij»MrtfF ¡Яыи|
/ > ■ / /
*
Л
S3400 15.0kV x&Tg&BSECOMP 80Ра i I I i t I i i i 10.Our
Л
S3400 15.0kV x20.0k BSECOMP 80Pa
Рис. 4. Растровая электронная микроскопия легких у интактных крыс. Стрелками указаны скопления слизи и решетчатого сурфактанта (А, Б). Препараты получены методом замораживания и раскалывания. Датчик отраженных электронов. Давление в камере - 80 Ра. Увеличение: А - 3700, Б - 20000.
Рис. 5. Растровая электронная микроскопия легких у крыс при холодовом воздействии. А - стрелками указаны увеличенные альвеолярные ходы и альвеолы. Б - на поверхности альвеол скопление сурфактанта. Препараты получены методом замораживания и раскалывания. Датчик отраженных электронов. Давление в камере - 80 Ра. Увеличение: А - 100, Б - 1010.
Заключение
При исследовании поверхности трахеи и легких крыс методом растровой криоэлектронной микроскопии выявлены прижизненно важные структуры муко-цилиарного конвейера респираторного и воздухоносного отделов легких.
При охлаждении морфофункциональные изменения в той или иной степени затрагивают все элементы поверхностного эпителия и, прежде всего, мерцательные клетки. Структура мукоцилиарного аппарата меняется, поверхность слизистой становиться волнистой и местами теряет четкость. Так же имеются участки реснитчатого эпителия с преобладанием бокаловидных клеток, лишенных микроворсинок. Секреторная активность бокаловидных клеток и альвеолоцитов 2 типа сопровождается повышенным выделением секрета, вследствие чего возникает нарушение мукоцилиарного транспорта. Предложенный нами способ имеет преимущества перед другими известными методами, так как исследуются нативные свойства слизистой оболочки трахеи и альвеол. При выбранном режиме замораживания отсутствует фаза кристаллизации воды в
жидком азоте, что является наиболее физиологическим методом исследования.
ЛИТЕРАТУРА
1. Альбертс Б., Брей Д., Льюис Д., Рэфф М., Робертс К., Уотсон Д. Молекулярная биология клетки. В 3-х т. Т.1. М.: Мир, 1994. 517 с.
2. Гоулдстейн Д., Ньюбери Д., Эчлин П., Джой Д., Фиори Ч., Лифшин Э. Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ. В 2-х т. T.2. М.: Мир, 1984. 349 с.
3. Белоус A.M., Бондаренко В.А. Криоповреждения биомембран. Структурно-функциональные нарушения митохондрий и лизосом // Актуальные проблемы криобиологии / под ред. Н.С.Пушкаря, А.М.Белоуса. Киев: Наукова думка, 1981. С.41-88.
4. Белоус A.M., Бондаренко В.А. Механизмы развития холодового повреждения мембран клеток // Криобиология и криомедицина: сб. науч. трудов. Вып.9. Киев: Наукова думка, 1981. С.3-17.
5. Боровягин В.Л. Методы ультратонких срезов, негативного контраста и скалывания в исследованиях ультраструктурной организации модельных и клеточ-
ных мембран // Успехи современной биологии. 1974. Т.77, №3. С.399-421.
6. Капрельянц A.C. Электронно-микроскопическое исследование охлажденных до -196°С эритроцитов // II Всесоюзный симпозиум «Криогенные методы в электронной микроскопии»: тезисы докладов. Пущино, 1977. С. 44-45.
7. Кириллов В.А., Конев C.B. Изменение ориентации плоскости скола клеточных мембран при использовании метода замораживания-скалывания как показатель изменения структуры мембран // Цитология. 1984. Т.16, №5. С.521-525.
8. Кузьминых С.Б., Аллахвердиев Б.Л., Хуцян С.С. Проблемы развития и аппаратура криометодов // II Всесоюзный симпозиум «Криогенные методы в электронной микроскопии»: тезисы докладов. Пущино, 1977. С. 101-107.
9. Лозина-Лозинский Л.К. Очерки по криобиологии. Л.: Наука, 1972. 287 с.
10. Ландышев Ю.С., Доровских В.А., Целуйко С.С., Лазуткина Е.Л., Ткачева С.И., Чапленко Т.Н. Бронхиальная астма. Благовещенск: АГМА, 2010. 136 с.
11. Радюк М.С. Реконденсация паров воды как причина артефактов при исследовании сколов мембран, получаемых методом замораживания-скалывания // Цитология. 1982. Т.24, №1. С.115-116.
12. Репин Н.В., Скорняков Б.А. Методические особенности и техническое обеспечение электронно-микроскопического метода замораживания-скалывания // Криобиология и криомедицина: сб. науч. трудов. Вып.10. Киев: Наукова думка, 1982. С.89-92.
13. Целуйко С.С., Доровских В.А., Красавина Н.П. Морфологическая характеристика соединительной ткани органов дыхания при общем охлаждении. Благовещенск: АГМА, 2000. 256 с.
14. Целуйко С.С., Семенов Д.А., Перельман Ю.М., Одиреев А.Н. Морфофункциональная характеристика слизеобразующих компонентов воздухоносного отдела легких крыс при осмотическом стрессе // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. 2015. Вып.57. С.70-76.
15. Целуйко С.С., Зиновьев С.В., Горбунов М.М., Решодько Д.П. Растровая электронная микроскопия криогенных объектов легких крыс при холодовом воздействии // Амурский медицинский журнал. 2016. №2(14). С.47-51.
16. Adams G.D.J. Freeze-drying of biological materials // Drying technol. 1991. Vol.9, Iss.4. Р.891-925.
17. Barresi A.A., Fissore D., Pisano R. Freeze-drying techniques. New ways to enhance process control and recipe development in pharmaceuticals freeze-drying // Pharm. Manuf. Packing Sourcer. 2009. Vol.43, №5. Р.36-42.
18. Barresi A.A., Ghio S., Fissore D., Pisano R. Freeze-drying of pharmaceutical excipients close to collapse temperature: influence of the process conditions on process time and product quality // Drying technol. 2009. Vol.27, Iss.6. Р.805-816.
19. Collins S.P., Pope R.K., Scheetz R.W., Ray R.I.,
Wagner P. A., Little B.J. Advantages of environmental scanning electron microscopy in studies of microorganisms // Microsc. Res. Tech. 1993. Vol.25, №5-6. P.398-405.
20. Franks F. Auffret T. Freeze-drying of Pharmaceuticals and Biopharmaceuticals. Cambridge: Royal Society of Chemistry, 2007. 211 p.
21. Hottot A., Andrieu J., Vessot S., Shalaev E., Gatlin L. A., Ricketts S. Experimental study and modeling of freeze-drying in syringe configuration. Part I: freezing step // Drying Technol. 2009. Vol.27, Iss.1. P.40-48.
22. Nail S.L., Jiang S., Chongprasert S., Knopp SA. Fundamentals of freeze-drying // Pharm. Biotechnol. 2002. Vol.14. P.281-360.
23. Rey L. Potential prospects in freeze-drying // Freeze-Drying/Lyophilization of Pharmaceutical and Biological Products / L.Rey, J.C.May, eds. New York: Marcel Dekker Inc., 1999. P.465-471.
24. Severs N.J. Freeze-facture electron microscopy // Nat. protoc. 2007. Vol. 2, №3. P. 547-576.
REFERENCES
1. Alberts B. Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson D. Molecular Biology of the Cell. Moscow: Mir; 1994 (in Russian).
2. Goldstein J., Newbury D., Echlin P., Joy D., Fiori C., Lifshin E. Scanning electron microscopy and X-ray microanalysis. Vol.2. Moscow: Mir; 1984 (in Russian).
3. Belous A.M., Bondarenko V.A. Cryodestruction biomembranes. Structural and functional abnormalities of mitochondria and lysosomes. In: Pushkar N. S., Belous A. M., editors. Actual Problems of Cryobiology. Kiev: Naukova Dumka; 1981: 41-88 (in Russian).
4. Belous A.M. Bondarenko V.A. Mechanisms of development of cold damage cell membranes. In: Cryobiol-ogy and cryomedicine. Kiev: Naukova dumka; 1981: 3-17 (in Russian).
5. Borovyagin V.L. Methods of ultrathin sections, negative contrast, and chipping in the research model and ultrastructural organization of cell membranes. Uspekhi sovremennoy biologii 1974; 77(3):399-421 (in Russian).
6. Kaprelyants A.C. Electron microscopic examination cooled to -196°C erythrocytes. In: Cryogenic methods of electron microscopy. Pushchino; 1977: 44-45 (in Russian).
7. Kirillov V.A., Konev C.B. Change the orientation of the cleavage plane of cell membranes using the method of freeze-fracture as an indicator of changes membrane structure. Tsitologiya 1984; 16(5):521-525 (in Russian).
8. Kuz'minykh S.B., Allakhverdiev B.L., Hutsyan S.S. Problems of development and equipment cryotechniques. In: Cryogenic methods of electron microscopy. Pushchino; 1977: 101-107 (in Russian).
9. Lozina-Lozinsky L.K. Essays on Cryobiology. Leningrad: Nauka; 1972 (in Russian).
10. Landyshev Y.S., Dorovskich V.A., Tseluyko S.S., Lazutkina E.L., Tkacheva S.I., Chaplenko T.N. Bronchial asthma. Blagoveshchensk; 2010 (in Russian).
11. Radyuk M.S. Re-condensation of water vapor as the cause of the artifacts in the study of membrane chips, obtained by freeze-fracture. Tsitologiya 1982; 24(1):115-
116 (in Russian).
12. Repin N.V., Skornyakov B.A. Methodical features and technical support for electron microscopy method of freeze-fracture In: Cryobiology and cryomedicine: republican interdepartmental collection. Kiev: Naukova dumka; 1982: 89-92 (in Russian).
13. Tseluyko S.S., Dorovskich V.A., Krasavina N.P. Morphological characteristics of the connective tissue of the respiratory system with a total cooling. Blagoveshchensk; 2000 (in Russian).
14. Tseluyko S.S., Semenov D.A., Perelman J.M., Odi-reev A.N. Morphofunctional characteristic of mucus-producing components in rat's airways under osmotic stress. Bulleten' fiziologii ipatologii dyhania 2015; 57:70-76 (in Russian).
15. Tseluyko S.S., Zinoviev S.V., Gorbunov M.M., Reshodko D.P. Scanning electron microscopy cryogenic objects lungs of rats at cold exposure. Amurskiy meditsin-skiy zhurnal 2016; 2:47-51 (in Russian).
16. Adams G.D.J. Freeze-drying of biological materials. Drying technology 1991; 9(4):891-923.
17. Barresi A.A., Fissore D., Pisano R. Freeze-drying techniques. New ways to enhance process control and recipe development in pharmaceuticals freeze-drying. Pharm. Manuf. Packing Sourcer 2009; 43(5):36-42.
18. Barresi A.A., Ghio S., Fissore D., Pisano R. Freeze-drying of pharmaceutical excipients close to collapse temperature: influence of the process conditions on process time and product quality. Drying Technol. 2009; 27(6):805-816.
19. Collins S.P., Pope R.K., Scheetz R.W., Ray R.I., Wagner P.A., Little B.J. Advantages of environmental scanning electron microscopy in studies of microorganisms. Microsc. Res. Tech. 1993; 25(5-6):398-405.
20. Franks F., Auffret T. Freeze-drying of Pharmaceuticals and Biopharmaceuticals. Cambridge: Royal Society of Chemistry; 2007.
21. Hottot A., Andrieu J., Vessot S., Shalaev E., Gatlin L. A., Ricketts S. Experimental study and modeling of freeze-drying in syringe configuration. Part I: freezing step. Drying Technol. 2009; 27(1):40-48.
22. Nail S.L., Jiang S., Chongprasert S., Knopp SA. Fundamentals of freeze-drying. Pharm. Biotechnol. 2002; 14:281-360.
23. Rey L. Potential prospects in freeze-drying In: Rey L., May J.C., editors. Freeze-Drying/Lyophilization of Pharmaceutical and Biological Products. New York: Marcel Dekker Inc.; 1999: 465-471.
24. Severs N.J. Freeze-facture electron microscopy. Nat. protoc. 2007; 2(3):547-576.
Поступила 02.11.2016
Контактная информация Сергей Семенович Целуйко, доктор медицинских наук, профессор, проректор по научной работе, заведующий кафедрой гистологии и биологии, Амурская государственная медицинская академия, 675000, г. Благовещенск, ул. Горького, 95.
E-mail: agma@nm.ru Correspondence should be addressed to Sergey S. Tseluyko,
MD, PhD, DSc, Professor, Vice Rector for Scientific Work, Head of Department of Histology and Biology, Amur State Medical Academy, 95 Gor'kogo Str., Blagoveshchensk, 675000, Russian Federation.
E-mail: agma@nm.ru
