CC BY
146
Новый метод анализа бактериальной биопленки
УДК 616-076-092.4/7:579.2 Окончание. Начало е №10
Для большинства клинически значимых условно-патогенных микроорганизмов экспериментально доказаны общие временные особенности образования биопленки [1, 2]. Так, различные виды планктонных бактерий адгезируются к поверхности и присоединяются друг к другу в течение нескольких минут; образуют прочно соединенные микроколонии за 2-4 ч; вырабатывают внеклеточные полисахариды -основное вещество биопленки - за 6-18 ч; формируют полноценные сообщества за 1-2-4 дня (в зависимости от видов микробов и условий роста); быстро восстанавливаются после механического разрушения до зрелой биопленки в течение 24-48 ч.
Поскольку экзополисахаридный матрикс (ЭПМ) является основным барьерным фактором защиты бактерий, обусловливая их толерантность к биоцидам (антибиотикам, антисептикам и т.д.) и компонентам иммунной системы макроорганизма, временной промежуток от 6 до 24 ч - наиболее важный предмет лабораторного анализа.
Мы провели оценку способности штаммов S. aureus (n=48), выделенных из хронических ран (ХР) пациентов, к формированию биопленки. Как известно, стафилококк является комменсалом и обитателем кожных покровов, с чем сопряжена его преобладающая роль в этиологии раневой инфекции. Наличие множества факторов вирулентности также обусловливает его значимость в патогенезе инфекций ран. S. aureus имеет факторы адгезии, которые обеспечивают
ему прикрепление к различным белкам, в частности фибриногену и коллагену. Наличие эластин- и фибронектинсвязывающих белков позволяет стафилококку легко колонизировать ткани раны, а также глубоко проникать и распространяться за счет разрушающего действия мембранных токсинов. Внутриклеточные адгезивные белки способствуют присоединению бактерий друг к другу, что ускоряет формирование биопленки. S. aureus образует также ряд агентов защиты с антифагоцитарной активностью, вызывающих прямое повреждение нейтро-филов, а также вырабатывает факторы, гарантирующие его персистенцию. Высокая степень вирулентности содействует беспрепятственному генерированию стафилококком биопленки в самые ранние сроки от момента адгезии к поврежденным тканям, а также обусловливает его преобладание в инициации инфекционного процесса [3]. В предварительных испытаниях нами показано, что S. aureus - доминирующий представитель (частота обнаружения до 45%) микрофлоры хронических ран [4].
На рис. 1 представлены результаты динамической оценки формирования биопленки штаммами S. aureus, выделенными из ХР при первичном бактериологическом исследовании (на момент поступления пациентов в стационар). При интерпретации полученных данных и определении различных вариантов способности создавать биопленку (отсутствует, низкая, умеренная, выраженная) мы руководствовались прежде всего значениями оптической плотности (OD), измеренными для этанольных экстрактов Congo red спустя сутки инкубации. Основывались на том, что образование бактериями ЭПМ, который окрашивается Congo red,- ключевой момент, характеризующий биопленку и ее патогенетическую роль в развитии и поддержании заболевания.
С учетом условий постановки реакции (размер лунки планшета и количество питательной среды) мы считаем, что проведение измерений после 24-часовой инкубации оптимально для
оценки сформированной биопленки. Через этот же промежуток времени также анализируется, какой характер образования биомассы наблюдается при той или иной степени интенсивности развития микробного конгломерата. Для этого определяют оптическую плотность элюата генцианвиолет/этанол. Оценка результатов через 2, 4, 6, 18, 48 ч инкубации необходима для детального описания динамики накопления биомассы и основного вещества.
Выявлено, что для штаммов S. aureus (n=48), выделенных из ХР, в 70% случаев (n=33) характерна высокая склонность к формированию микробных биопленок. При этом наблюдалось постепенное увеличение значений оптической плотности элюатов Congo red с достижением максимума через 24 ч инкубации (p<0,05) и снижением показателя спустя 48 ч исследования. Наиболее активная адгезия и пролиферация бактерий происходили в период между 2-м и 4-м часами инкубации (р=0,01), после чего биомасса оставалась стабильной - значимые изменения OD экстракта генцианвиолета не регистрировались (рис. 1Г). Показатели абсорбции элюата ген-цианвиолета были ниже значений для раствора Congo red с 4 до 48 ч (p<0,05). Это говорит о том, что при высокой степени интенсивности развития бактерии гораздо активнее образуют защитный ЭПМ, чем накапливают клеточную массу.
В 15% случаев (n=7) штаммы S. aureus обладали умеренной способностью формировать биопленку. Как видно из рис. 1В, при таком варианте накопление ЭПМ активнее всего происходило в период между 6-м и 18-м часами инкубации (p<0,01), к 48-му часу оптическая плотность Congo red снижалась (р=0,015). К 6 часам исследования своего максимума достигали значения абсорбции экстракта генцианвиолета (p<0,05) с последующим снижением к 48 часам (р=0,01), что характеризует динамику изменения биомассы как умеренную.
При слабой способности возбудителей инфекции к биопленкообразованию (рис. 1Б) максимальные показатели OD элюата Congo red регистрировались только через 6 ч инкубации (p<0,01), а к 18 и 24 часам, когда происходит непосредственное образование сформировавшегося микробного конгломерата, наблюдалось снижение величины абсорбции (p<0,05). Динамика накопления биомассы была схожей с процессом накопления ЭПМ, однако величины оптической плотности экстракта генциан-виолета во все сроки превышали показатели для Congo red (p<0,05).
При отсутствии способности анализируемых бактерий формировать биопленку (рис. 1А) динамика накопления ее матрикса также отсутствовала на протяжении всего исследования: значения OD Congo red / этанол не изменялись. Однако период с 4 до 18 ч отличался наиболее интенсивным образованием биомассы (p<0,01). Частота выделения S. aureus с низкой формирующей активностью или ее отсутствием была одинаковой и составляла 7,5% (n=4).
Следовательно, разные уровни способности микроорганизмов к формированию биопленки характеризуются определенными особенностями динамики этого процесса: при выраженной активности они синтезируют защитный матрикс, а при ее отсутствии - интенсивно накапливают клеточную массу.
На следующем этапе мы рассмотрели возможность применения предложенного нами метода исследования образования бактериальной биопленки для оценки эффективности терапии. Для этого провели сравнительный анализ способности к созданию микробных конгломератов у S. aureus, выделенного до и после лечения больных с ХР. Пациентов разделили на две группы. В протокол лечения группы 1 (n=35) включили аппаратные методы - ультразвуковой дебридмент (диссектором «Sonoca-185» (25 кГц),
Рис. 1.
Динамика
изменения
оптической
плотности
растворов
Congo red / этанол
и генцианвиолет/
этанол для
штаммов S. aureus
при исследовании
способности
формирования
биопленки*
■ S
г
'.«
2 1.1
fi !.S
1 '.И
I С. а
л / * " *
у / f* »
Е 1,1 / J
& /*'
а.! /*
ЦП
1 4 f IS Нем н л Сшрт ltd 14 45 wr
* на рисунок нанесены значения медианы. А, Б, В, Г - представлена динамика изменения оптической плотности этанольных экстрактов Congo red и генцианвиолета для штаммов с отсутствием способности формировать биопленку, а также с низкой, умеренной и высокой способностью соответственно
Рис. 2.
Частота выделения
штаммов S. aureus
с различной
способностью
формировать
биопленку
у пациентов
группы 1
до и после
проведенного
лечения
^Н i
2
Отсутствует Низкая Умеренная Выраженная
1, 2 - представлены результаты, полученные при первичном исследовании и после проведенного лечения соответственно
«Soring», Германия) и вакуум-терапию (аспиратором В-40А производства НПО «Висма-Планар», Беларусь). После подготовки раны выполнялось закрытие раневого дефекта путем аутодермопластики (АДП). В предоперационном плане группы 2 (n=17) фигурировали только традиционные методы с использованием повязок с антисептическими препаратами (хлоргек-сидин, повидон-йод), мазями на полиэтиленгли-колевой основе. После консервативного лечения этим пациентам также осуществлялась АДП. У представителей обеих групп интраопераци-онно перед АДП производился забор раневого отделяемого для микробиологического анализа.
Выявлено, что после аппаратной терапии изменилась частота обнаружения штаммов S. aureus, обладающих различной способностью формировать биопленку. Так, увеличилась доля выделения S. aureus c отсутствием или низким уровнем активности - до 40% (n=13) и 30% (n=10) случаев соответственно (относительно 7,5% при первичном исследовании, х2=8,6; р=0,003; Х2=4,5; р=0,03). В то же время доля обнаруженных штаммов с высокой предрасположенностью к образованию биопленки снизилась до 15% (n=6) по сравнению с исходными 70% (х2 =19,6; р<0,001) (рис. 2).
Как известно, воздействие низкочастотным ультразвуком является одним из наименее травматичных видов дебридмента, который позволяет очистить рану от контаминированных бактериями нежизнеспособных тканей, фибрина и детрита. За счет сочетания эффектов кавитации и вибрации ультразвук оказывает прямое бактерицидное действие. Экспериментально доказано, что низкочастотный ультразвук разрушает внеклеточный матрикс биопленки, вследствие чего бактерии в ране становятся доступными для факторов иммунной защиты макроорганизма. Использование в процессе лечения
низкодозированного отрицательного давления приводит к удалению экссудата, что препятствует адгезии микроорганизмов [1]. В итоге создаются помехи для реконтаминации раны микробами, то есть идет воздействие на самые ранние стадии формирования биопленки -адгезию бактерий, их пролиферацию, появление микроколоний, начальный синтез ЭПМ. Следовательно, микробный кластер просто не успевает образовываться. При применении нашего метода анализа эффективность аппаратной терапии на начальных этапах создания биопленки может быть оценена по оптической плотности растворов красителей, измеренной через 2,
4, 6, 18 ч инкубации.
Лечение в группе 2, с использованием только стандартных повязок с антисептическими препаратами и мазями на полиэтиленгликолевой основе, не сопровождалось изменением способности S. aureus формировать биопленку. Так, аналогично результатам, полученным на момент поступления, штаммы стафилококка, выделенные из ран пациентов при интраоперационном исследовании (перед АДП), с наибольшей частотой (75%, n=13) демонстрировали выраженную склонность к биопленкообразованию. В 25% случаев (n=4) регистрировались штаммы с умеренным таким свойством. Необходимо отметить, что перед проведением пластического закрытия ран в группе 2 не обнаруживались штаммы
5. aureus с низкой или отсутствием способности формировать биопленку.
Таким образом, аппаратные методы лечения создают благоприятные условия для заживления за счет повреждающего действия ультразвука, отрицательного давления на биопленку в ране и активирующего влияния на механизмы иммунной защиты. У всех пациентов группы 1 после аппаратной терапии исход АДП был успешным: полная фиксация лоскута происходила к 3-4-му дню послеоперационного периода с полным приживлением на 7-9-е сутки. Это позволяет сделать вывод, что незначительный слой ЭПМ (перед проведением АДП выделялся S. aureus с отсутствием или низкой способностью формировать биопленку) не создает препятствия для воздействия факторов иммунитета и не мешает заживлению, поэтому контаминация ран S. aureus не сопровождается развитием инфекционного процесса или нарушением приживления пересаженного лоскута.
Штаммы S. aureus, выделенные из ран пациентов при интраоперационном исследовании и обладающие, согласно разработанной нами
методике, низкой способностью к образованию биопленки, дополнительно анализировались посредством атомно-силовой микроскопии. На рис. 3 представлены трехмерный микрорельеф поверхности микробного конгломерата и ее вертикальный профиль, полученные после обработки результатов сканирования с помощью специальной компьютерной программы. Видно, что для биопленки S. aureus, выделенного из раны перед АДП, характерно преимущественное скопление микробных тел и отсутствие основного вещества.
В свою очередь, у четырех пациентов группы 2, которых лечили только с использованием стандартных повязок, в послеоперационном периоде наблюдался лизис: к 3-4-м суткам сохранялась бледность и нестабильность лоскута с его отторжением к 7-8-му дню. При интра-операционном исследовании из ран выделялся S. aureus с выраженной способностью формирования биопленки. Необходимо отметить, что лизис лоскута не сопровождался признаками активации инфекционного процесса - отделяемое из-под лоскутов было серозным или отсутствовало, состояние окружающих рану тканей не изменялось. Это позволяет предположить, что наличие в ране S. aureus, способного быстро (в период с 2 до 4 ч инкубации in vitro) накопить и сформировать (к 24 ч инкубации in vitro) выраженный слой ЭПМ, мешает дальнейшей фиксации и приживлению лоскута. На рис. 4 представлены результаты визуализации такой биопленки (из ран пациентов с лизисом лоскута), образованной после 24-часовой инкубации. Она характеризуется небольшим количеством микробных тел, погруженных в слой экзополисахаридного матрикса.
Таким образом, предложенный в данной статье метод рекомендуется для обоснования выбора лечения пациентов с хроническими ранами. Обнаружение S. aureus с высокой или умеренной способностью формировать биопленку является показанием для применения аппаратной терапии в целях подготовки раны к пластическому закрытию (ультразвуковая и/или вакуум-терапия), в случае низкой такой способности или ее отсутствия рекомендуется использовать консервативное лечение.
Разработанный нами метод сочетает в себе два основных подхода к изучению образования бактериальной биопленки: динамический (оценка основных этапов формирования после 2, 4, 6, 18, 24, 48 ч инкубации) и статический (одновременная оценка основных моментов,
3Р-топография биопленки S. aureus,
выделенного на фоне приживления пересаженного лоскута
(размер изображения 20x20 цм, 256x256 пикселей)
Вертикальный профиль поверхности биопленки
3Р-топография S. aureus, обладающего высокой способностью формировать биопленку (размер изображения 20x20 цм, 256x256 пикселей)
Вертикальный профиль поверхности биопленки
Рис. 3. Результаты атомно-силовой микроскопии S. aureus, обладающего низкой способностью формировать биопленку
Рис. 4.
Результаты
атомно-силовой
микроскопии
S. aureus,
обладающего
выраженной
способностью
формировать
биопленку
Вниманию авторов
характеризующих биопленку: накопления биомассы и синтеза ЭПМ). Он позволяет получить заключение менее чем за двое суток, что приближает его к классическому бактериологическому исследованию и делает возможным использование в клинической лабораторной микробиологии. Определение результатов сразу после окончания каждого периода инкубации в предложенном способе напоминает детекцию в режиме реального времени.
Метод является простым и доступным, исключает необходимость эксплуатации специального дорогостоящего оборудования и труднодоступных красителей. Это обеспечивает возможность его широкого применения в работе бактериологических отделов клинико-диагностических лабораторий для распознавания инфекций, в патогенезе которых ключевое значение имеет биопленка, а также обоснования различных путей их лечения и мониторинга эффективности. ЕИ
Статья поступила в редакцию 03.02.2016 г.
Юлия Ярец,
заведующий клинико-диагностической лабораторией РНПЦ радиационной медицины и экологии человека, кандидат медицинских наук, доцент
Наталья Шевченко,
завлабораторией клеточных технологий
РНПЦ радиационной медицины и экологии человека,
кандидат биологических наук, доцент
Summary
It is presented the new laboratory method of detection of bacterial biofilm formation in the article. All the examined strains of bacteria are divided into the following categories: no biofilm producers, weak, moderate, or strong biofilm producers accordingly the digital data of the optical density measured for stained with crystal violet and Congo red bacterial films. The described method will be useful in medical practice for the diagnostics of the biofilm-related infection: healthcare-associated infection, device-related infections, chronic tissue infections and for the optimization of the infection treatment protocols.
l See: http://innosfera.by/2016/11/bacterial_biofilm
Литература
Wolcott R. The role of biofilms: are we hitting the right target? Current concepts in wound Healing: Update 2011 / R. Wolcott, S. Down // Plastic and reconstructive surgery. 2011. Vol. 127, N1S. P. 28S-37S. Lebeaux D. From in vitro to in vivo models of bacterial biofilm-related infections / D. Lebeaux [et a l.] // Pathogens. 2013, N2. P. 288-356.
Distribution, organization, and ecology of bacteria in chronic wounds / K. Kirketerp-Mu ller // J Clin Microbiol. 2008. Vol. 46, N8. P. 2717-2722. 4. Ярец Ю.И. Динамика микробного состава хронической раны с учетом особенностей предоперационной подготовки / Ю.И. Ярец, Н.И. Шевченко, Л.Н. Рубанов // Проблемы здоровья и экологии. 2012. Т. 32, № 2. С. 108-114.
3.
Начиная с №1 2017 г. авторские экземпляры журнала можно получать по заказу в электронном виде (формат pdf) бесплатно и в бумажном - платно. Поэтому просим делать заказ заранее, чтобы редакция смогла учесть его при формировании тиража.
Базовые требования
; .
к подаче материалов
Статьи следует предоставлять в электронном и бумажном виде. Все материалы должны являться оригинальными, то есть не опубликованными ранее в других изданиях. Язык текста - русский или белорусский.
Иллюстративный материал (таблицы, рисунки, диаграммы, фото и пр.) необходимо предоставлять отдельными файлами высокого разрешения. Диаграммы/графики должны быть созданы в программе Excel и содержать исходные численные данные для их построения. Не следует использовать растровые блок-схемы и диаграммы. Формулы набирать в редакторе формул MathType.
На английский язык должны быть переведены заголовок статьи, аннотация, ключевые слова, место работы автора. Фамилию и имя необходимо указывать латиницей точно по паспорту. Аннотация - не менее 700 знаков - должна кратко отражать суть статьи: предмет и проблема, методы исследования, основные результаты. Чем точнее ключевые слова будут определять тематику статьи, чем лаконичнее и яснее вы изложите основную идею в аннотации, тем проще будет заинтересованным пользователям встретить ваше исследование в Интернете, поисковых системах и электронных базах данных.
