CC BY
69
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ НОВЫЙКАТИОННЫЙПУРПУРИНИМИД... 59
УДК 579.841.11:615.832.3:547.976 1 11 2 12 2 С.С. Брусов , Ю.С. Колоскова , М.А. Грин , И.Г. Тиганова , O.E. Пагина , Э.Р. Толордава , Т.В. Степанова , Г.А. Меерович3, Ю.М. Романова2, А.Ф. Миронов1 НОВЫЙ КАТИОННЫЙ ПУРПУРИНИМИД ДЛЯ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ИНАКТИВАЦИИ БИОПЛЕНОК PSEUDOMONAS AERUGINOSA 1 Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова, Москва 2Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н. Ф. Гамалеи Минздрава РФ, Москва 3Институт общей физики имени A.M. Прохорова РАН, Москва Контактная информация Грин Михаил Александрович, д.х.н., профессор, заместитель заведующего кафедрой химии и технологии биологически активных соединений Московского государственного университета тонких химических технологий им. М.В.Ломоносова адрес: 119571 Москва В-571, пр. Вернадского, 86; тел. +7(495)936-89-01 e-mail: michael grin@mail.ru Статья поступила 28.10.2014, принята к печати 24.11.2014. Резюме Создан новый катионный фотосенсибилизатор для фотодинамической инактивации бактерий на основе Кре-мофорной дисперсии метилового эфира 133-Ы-(Ы-метилникотинил)пурпуринимида. Показана полная фотодинамическая инактивация бактерий Pseudomonas aeruginosa в составе биопленок при использовании этого фотосенсибилизатора в концентрации 1 мМ, времени инкубации 1 час и дозе облучения 105 Дж/см2. Ключевые слова: биопленки, фотосенсибилизаторы, фотодинамическая инактивация, пурпуринимид.
S.S. Brusov1, Yu.S. Koloskova1, M.A. Grin1, I.G. Tiganova2, O.E. Pagina1, E.R. Tolordava2, T.V. Stepanova2, G.A. Meerovich3, Yu.M. Romanova2, A.F. Mironov NEW CATIONIC PURPURINIMIDE FOR PHOTODYNAMIC INACTIVATION OF PSEUDOMONAS AERUGINOSA BIOFILMS 1M.V. Lomonosov Moscow State University of Fine Chemical Technology, Moscow 2N.F. Gamaleva Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Moscow 3A.M. Prokhorov General Physics Institute of Russian Academy of Sciences, Moscow Abstract New cationic photosensitizer for photodynamic antibacterial chemotherapy based on Chremophor dispersion of using methyl ester 13 -N-(N-methylnicotinyl) purpurinimide was developed. It was shown the complete photodynamic inactivation of bacteria Pseudomonas aeruginosa biofilms by using new photosensitizer at the concentration of 1 mM, the incubation time of 1 hour and the irradiation dose of 105 J/cm 2 Key words: biofilms, photosensitizer, photodynamic inactivation, purpurinimide. Введение товозбужденном состоянии [13]. В отличие от антибиотиков, каждый из которых специфически воз- Хронические инфекции, связанные со спо- действует на определенную мишень в микробной собностью патогенных бактерий к образованию клетке, включая клеточную стенку, цитоплазмати-биопленок, являются серьезной медицинской про- ческую мембрану, процессы репликации ДНК, блемой. Бактериальные биопленки представляют транскрипции или трансляции белков, АФК вызы-собой организованные сообщества бактерий одного вают неспецифическое повреждение всех клеточ-или нескольких видов, окруженные экзополимер- ных компонентов, потенциально подверженных ным матриксом, который защищает бактерии от окислительным реакциям [12; 22; 26]. У бактерий воздействия антибиотиков и факторов иммунной не развивается устойчивости по отношению к фо-защиты хозяина [7]. Особой устойчивостью обла- тодинамическому воздействию, бактерицидный дают биопленки грамотрицательных бактерий эффект носит локальный характер и не имеет сис-Pseudomonas aeruginosa, широко распространенные темного действия на нормальную флору организма. при различных внутрибольничных инфекциях (мо- Это происходит потому, что ни фотосенсибилиза-чеполовой системы, слизистой рта, легких), а также тор, ни световое облучение в отдельности не обла-при нагноении ран особенно у иммунодефицитных дают бактерицидным действием или другими по-пациентов [3; 23]. Актуальной проблемой медицин- вреждающими эффектами. ской микробиологии является поиск антибактери- В литературе описано исследование фотоди-альных лекарственных средств нового поколения, намической инактивации планктонных бактерий и эффективных в отношении бактерий в биопленках. биопленок культуры Pseudomonas aeruginosa Альтернативой использованию антибиотиков мо- штамма РА01 при использовании в качестве ФС жет стать ФДГ [1; 2; 5; 6; 8; 9]. индоцианинового зеленого (4,5-бензоидотрикарбо- В основе процесса фотодинамической инак- цианин), поглощающего в ближней инфракрасной тивации бактерий лежат цитотоксические свойства области спектра [19]. Показано, что фотосенсиби-АФК, генерируемых фотосенсибилизаторами в фо- лизатор при концентрации 200 мкг/мл существенно
№ 4/том 13/2014 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
не влияет на жизнеспособность сформированных биопленок. Другим примером антимикробной ФДГ биопленок культуры Pseudomonas aeruginosa штамма ATCC 9027 является использование в качестве ФС 0,01%-ного раствора метиленового синего в фосфатном буфере (максимум поглощения 670 нм), что приводит к снижению концентрации КОЕ/мл лишь на 2 порядка при дозе света 20,6 Дж/см2 [25]. Наиболее значительный бактерицидный эффект был достигнут при использовании 5-аминолевулиновой кислоты. Полная фотодинамическая инактивация биопленок Pseudomonas aeruginosa была достигнута при концентрации ФС 20 мМ, дозе облучения 240 Дж/см2 и двукратной обработке [15].
Способность фотосенсибилизаторов связываться с бактериями зависит от строения клеточной стенки бактерий, которая препятствует проникновению фотосенсибилизатора внутрь.
Изучение структурно-функциональных особенностей ФС показало, что незаряженные (нейтральные) молекулы ФС активно связываются с грамположительными бактериями и при воздействии света инактивируют их, однако их связывание с грамотрицательными бактериями и фотоинактивация последних недостаточно эффективны, тогда как катионные ФС обладают выраженным антибактериальным эффектом [4; 17; 18].
Настоящая статья посвящена результатам предварительных исследований нового катионного фотосенсибилизатора на основе метилового эфира 133 -Ж-(Ж-метилникотинил)-пурпуринимида для фотодинамической инактивации биопленок гра-мотрицательных бактерий Pseudomonas aeruginosa.
Материалы и методы
Получение субстанции ФС
При синтезе субстанции фотосенсибилизатора все реакции проводились в атмосфере аргона в дегазированных растворителях, при комнатной температуре и с защитой от света. Пурпурин 18 1 был получен с использованием известной [14; 20] методики. Электронные спектры регистрировали с помощью спектрофотометра Jasco-UV 7800. Спектры ЯМР были зарегистрированы при 25 °С на спектрометре Bruker DPX 300. Масс-спектры получены на время-пролетном масс-спектрометре Bruker Ultraflex TOF/TOF методом MALDI с использованием 2,5-дигидроксибензойной кислоты (DHB) в качестве матрицы. Колоночную хроматографию проводили с использованием силикагеля 40/60 (Merck). Для препаративной тонкослойной хроматографии использовали пластины 20*20 см с толщиной слоя силикагеля 1 мм (Merk). Аналитическую ТСХ проводили на Kieselgel 60 F245 (Merck).
N-Аминопурпуринимид 2 был получен согласно ранее [16] разработанному способу.
Предлагаемый ФС получают в несколько стадий в соответствии с рис. 1.
На первой стадии метиловый эфир N-аминопурпуринимида 2 получают за счет взаимодействия гидразингидрата с пурпурином 18 1 и последующего метилирования продукта реакции с помощью диазометана.
Ранее нами было обнаружено, что в ходе этой реакции происходит восстановление виниль-ной группы в положении 3 хлоринового макроцикла до этильной [19], что, по-видимому, связано с окислением гидразина в диимин, который и восстанавливает винильную группу [11].
В настоящей работе для сохранения винильной группы в предлагаемом ФС реакцию проводили в течение 30-40 мин в отсутствие кислорода [16]. Ход реакции контролировали спектрально по смещению основной полосы поглощения в область 706 нм.
На второй стадии метиловый эфир N-аминопурпуринимида 2 обрабатывают хлорангид-ридом никотиновой кислоты и кватернизуют пиридиновый атом азота в пурпуринимиде 3 иодмета-ном, что приводит к целевому соединению 4. Метиловый эфир 133^-никотинилпурпуринимида 3 1Н ЯМР (600 МГц, CDCl3, 5, м.д.) : 9.48 (H, с, 10-H), 9 . 24 (H, с, 5-H), 9,18 (Н, дд, С6-пиридин), 9.03 (Н, дд, С5-пиридин), 8,91 (Н, с, С2-пиридин), 8.52 (H, с, 20-H), 8,46 (H, с, 13^-NH), 7.90 (H, дд, J=18.0 Гц, 11.6 Гц, 31-H), 7.55 (H, м, С4-пиридин), 6.33 (H д, J = 18.0 Гц, E-32-H), 6.21 (H, д, J = 11.6 Гц, Z-32-H), 5.26 (H, д, 17-H), 4.32 (H, м, 18-H), 3.73 (3H, с, 12-CH3), 3.56 (3H, с, 175-CH3), 3.54 (3H, с, 2-CH3), 3.48 (2H, к, 81-CH2), 3.35 (3H, с, 7-CH3), 2.78 (H, м, 171-CH2s), 2.35 (H, м, 172-Ш2а), 2.35 (H, м, 172-CH2b), 2.59 (H, м, 171-CH2b), 1.71 (3H, д, 18-CH3), 1.63 (3H, т, 82-CH3), 0.22 (H, NH), -0.31 (H,NH). UV-VIS (CHCl3), Xmax, нм (относ. инт.): 365, 415 (Cope), 553 и 706 (1: 0.76: 0.44: 0.85). MS (MALDI), m/z: 675.372 [M+](C40H39N7O5). Метиловый эфир 133-N-(N-MemunHUKomunun)nypnypuHUMuda 4 UV-VIS (CHCls), Xmax, НМ (относ. инт.): 365, 415 (Cope), 553 и 706 (1: 0.76: 0.44: 0.85). MS (MALDI- TOF), m/z: 714,003 [M]+ (C41H42N7O5) , 577,892 [M- C7H8N2O], (C41H42N7O5).
Получение водной дисперсии метилового эфира
l^-N-fN-метилникотинил) тппуринимида 4 с использованием Кремофора Для изучения фотодинамической инактивации бактерий в составе биопленок с помощью катионного пурпуринимида 4 была приготовлена его водная дисперсияс использованием Кремофора ELP, который часто используется для солюбилизации слабо растворимых в воде ФС порфириновой природы и обладаюшет дезагрегирующим действием [24].
Растворяли 5 мг метилового эфига 133-N-(N-метилникотинил)пурпуринимида в 6 мл хлороформа. К 5 мл 4%-ного (масс.) раствора Кремофора в дистиллированной воде с температурой 41-43 °С пои перемешивании и барботгоовании азота прибавляли вы-шегоиготовленный раствор пурпуринимида в хлороформе порциями по 1 мл, добавляя каждую последующую порцию после полного испарения хлороформа из предыдущей. После добавления всего объема раствора субстанции в хлороформе и удаления остатков хлороформа током азота дисперсию охлаждали, доводили дистиллированной водой до первоначального объема и Фильтровали через мембранный фильтр «Millipore» с размером пор 0,22 мкм.
Фотодинамическая инактивация биопленок Pseudomonas aeruginosa с помощью катионного пурпуринимида 4
В работе использовали клинический изоляг Pseudomonas aeruginosa от больного мочекаменной болезнью. Бактерии культивировали в бульоне LB. Биопленки Pseudomonas aeruginosa выращивали в течение 18 ч при 37 °С на колышках, погруженных в лунки 96-луночного планшета с бульонной культурой Pseudomonas aeruginosa, используя приспособление «Calgary Device» (фирма «Innovotech»: крышка для планшета с колышками, которые опускаются в каждую лунку).
Поверхностная доза (Дж/см )
Рис. 1. Реагенты и условия: i, Py, N2H4, 0,5h, then Рис. 2. Эффективность фотодинамической инактивации H2O/HCl 0,5h; CH2N2 0,5h; ii, C5H4NCOCl, Py, 1h; iii, бактерий Pseudomonas aeruginosa 32 в составе CH3I, A, 2h. биопленки в зависимости от дозы облучения ФС:
1 - культура + физиологический раствор;
2 - культура + кремофор ELP;
3 - культура + катионный пурпуринимид 1мМ.
О
0,2 0,4 0,6 0,8 1
Концентрация фотосенсибилизатора (мМ)
Рис. 3. Фотодинамическая инактивация катионным пурпуринимидом бактерий Ps. aeruginosa 32 в составе биопленок в зависимости от концентрации ФС. Доза облучения 44 Дж/см2.
1 - необлученный контроль;
2 - культура облучена дозой 44 Дж/см2.
Выросшие биопленки отмывали от планктонных клеток, дважды опуская колышки в планшеты с дистиллированной водой, и погружали в 1мМ раствор предлагаемого фотосенсибилизатора (кремофорная дисперсия метилового эфира 133-N-(N-метилникотинил) пурпуринимида).
После инкубации с фотосенсибилизатором в течение 60 минут крышку с колышками переносили в планшет с физиологическим раствором и облучали лампой ЛФД-03-Биоспек с плотностью мощности излучения в спектральном диапазоне поглощения фотосенсибилизатора (680-730 нм) примерно 30 мВт/см2. Изменение дозы облучения осуществлялось за счет времени облучения.
После облучения биопленки из каждой лунки разрушали методом соникации, режим которой был подобран таким образом, чтобы число вышедших из биопленки живых бактерий, было максимальным, и после серии десятикратных разведений
в физиологическом растворе из каждой лунки высевали по 20 мкл на 6 секторов чашки Петри с питательным агаром для подсчета жизнеспособных бактерий. Число выросших колоний подсчитывали после 24 ч инкубации в термостате при 37 °С.
Число выросших колоний в данном разведении умножали на 50*10" где n - номер разведения. Таким образом определяли количество живых бактерий в миллилитре (КОЕ/мл).
Визуализация бактерий Ps. aeruginosa 32 в составе биопленок до и после фотодинамического воздействия катионного пурпуринимида Окраска красителем «Live/Dead Biofilm Viability Kit» позволяет дифференцировать жизнеспособные и нежизнеспособные бактерии в биопленках. В комплект для окрашивания входят два флуоресцентных красителя SYTO®9 (компонент А) и пропидиум иодид (компонент В). Метод окрашивания основан на различной способности двух красителей проникать внутрь бактериальной клетки. SYTO®9 (3,34 мМ в DMSO) - зеленый флуоресцентный краситель, связывается с ДНК и окрашивает как живые, так и мертвые бактерии с неповрежденными и поврежденными клеточными мембранами, а пропидиум иодид (20 мМ в DMSO) - красный флуоресцентный краситель, красит мертвые бактерии с поврежденными клеточными мембранами.
Длины волны возбуждения для SYTO®9 и пропидиум иодида составляют 480 и 490 нм, а спектральные максимумы полос флуоресценции -соответственно 500 и 635 нм. Максимум флуоресценции катионного пурпуринимида лежит в области 720 нм. При микроскопии использовали зеленый фильтр, который пропускает длины волн от 515 до 555 нм, и красный фильтр, который пропускает длины волн от 590 до 650 нм.
Такой выбор полос пропускания фильтров обеспечил возможность получения достоверной
0
1,2
информации в присутствии заметной флуоресценции катионного пурпуринимида. Каждое поле зрения фотографировали через красный и зеленый фильтры, изображения совмещали с помощью программы, приложенной к микроскопу.
Культуру Ps. aeruginosa 32 выращивали в LB-бульоне в термостате с аэрацией при 37 °С 18 ч до стационарной фазы. Ночную культуру разводили в 100 раз LB-бульоном в объеме 10 мл и стерильно вносили по 1 мл в чашки Петри (0=35 мм) со стерильным покровным стеклом (18мм х 18мм) на дне.
После инкубации из чашек Петри осторожно удаляли отсасыванием культуральную жидкость вместе с планктонными бактериями, вносили в чашки Петри по 300 мкл раствора фотосенсибилизатора, а для темновых контролей - 300 мкл физиологического раствора и 300 мкл раствора фотосенсибилизатора.
Инкубировали при комнатной температуре в течение 60 мин в темноте, затем отбирали растворы, чашки промывали физиологическим раствором три раза и вносили физиологический раствор в объеме 1 мл в чашки Петри.
Одну чашку, обработанную фотосенсибилизатором, облучали красным светом ксеноновой лампы со средней плотностью мощности 30±1 мВт/см2 и плотностью световой дозы (за 20 мин облучения) D=36 Дж/см2.
Флуоресцентные красители разводили в воде для инъекций из расчета 3 мкл SYTO®9 и 3 мкл пропидиум иодида на 1 мл воды. Из чашек Петри удаляли физиологический раствор и инкубировали биопленки на покровных стеклах в чашках с раствором «Live/Dead Biofilm Viability Kit» в течение 25 мин в темноте, после чего сразу же промывали три раза водой для инъекций и анализировали в микроскопе (флуоресцентный микроскоп Nikon H600L модель «Nikon Eclipce Ni» (Япония)) с флуоресцентным объективом 40 х. Инструментальное увеличение составило 600х.
Результаты
Изучение зависимости эффективности фотодинамической инактивации от дозы облучения проводили при концентрации пурпуринимида 4 в кремоФорной дисперсии 1 мМ и времени инкубации 1 час (рис. 2).
Полная инактивация наблюдалась при плотности облучения 0=105 Дж/см2 (кривая 3). При длительном (60 мин) облучении в отсутствии Фотодинамического агента гибель бактерий в биопленках не наблюдалась (кривая 1). Кремофор ELP также не вызывал гибели бактерий (кривая 2). Однако было обнаружено, что в биопленках, инкубированных с раствором Фотосенсибилизатора в концентрации 1 мМ в течение 1 часа, наблюдалась частичная инактивация бактерий (на два порядка по сравнению с контролем без Фотосенсибилизатора). Это, предположительно, может быть связано с со-нодинамическим возбуждением Фотосенсибилизатора при соникации, которая проводилась для разрушения биопленок при подсчете жизнеспособных колоний (аналогично тому, что наблюдалось для опухолевых клеток, см., например, [19]).
Изучалась также зависимость фотодинамической инактивации бактерий в биопленках от концентрации катионного пурпуринимида (рис. 3).
Из рис. 2 следует, что инкубация бактерий Ps. aeruginosa 32 в составе биопленок в течение 1 часа с предлагаемым фотосенсибилизатором в концентрации 1 мМ и последующим облучением с поверхностной дозой 0=44 Дж/см2 на 4 порядка снижает жизнеспособность бактериальных клеток в составе биопленок по сравнению с контролем.
Визуализацию бактерий Pseudomonas aeruginosa 32 в составе биопленок до и после фотодинамического воздействия пурпуринимида 4 проводили методом флуоресцентной микроскопии с использованием маркера «Live/Dead Biofilm Viability Kit», позволяющего дифференцировать жизнеспособные и нежизнеспособные бактерии в биопленках (рис. 4; см. вклейку).
На рис. 4 (А) в интактном контроле доминирует зеленое окрашивание.
Это свидетельствует о том, что большинство клеток в биопленке живые. Рис. 4 (В) иллюстрирует наличие единичных клеток красного окрашивания после инкубации с фотосенсибилизатором, что свидетельствует о незначительной темновой гибели клеток в составе сенсибилизированных биопленок.
На рис. 4 (С) наблюдается преобладание красного окрашивания, которое указывает на большое количество мертвых бактерий с поврежденными клеточными мембранами, что свидетельствует о фотодинамической инактивации бактерий Ps. aeruginosa 32 в составе биопленок.
Таким образом, данные микроскопического исследования, позволяющие наблюдать в препарате живые и мертвые клетки, подтверждают результаты, полученные при выявлении жизнеспособных клеток методом титрования опытных и контрольных культур, демонстрируя эффективное взаимодействие предлагаемого фотосенсибилизатора с биопленкой, вызывающее гибель содержащихся в ней бактерий.
Заключение
Проведенные исследования показали, что предлагаемый катионный фотосенсибилизатор на основе метилового эфира 133-Ж-(Ж-метилникотинил)-пурпуринимида обладает высокой антибактериальной эффективностью против грамотрицательных бактерий Ps. aeruginosa в составе биопленок. Дополнительным преимуществом предлагаемого фотосенсибилизатора является тот факт, что его спектральная полоса поглощения имеет максимум в диапазоне 706 нм, в котором собственное поглощение биологических тканей невелико.
Это позволит эффективно осуществлять лечение очагов инфекции с глубокой инфильтрацией в ткани.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты № 13-03-00577 и 14-03-31935) и Гранта Президента РФ по поддержке ведущих научных школ НШ-2038.14.7.
Литература
1. Белый Ю.А., Терещенко A.B., Плахотный М.А. Интравитреальная фотодинамическая терапия внутриглазного воспалительного процесса с препаратом фотодитазхин // Российский биотерапевтический журнал. - 2009. - Т.8, №2. - С. 28.
2. Гладышее A.A., Телегина Л.В.,Соколов В.В. и др. Эндолорингиальная электро-лазерная хирургия и ФДТ при вирусассоциированном рецидивируюшем папилломатозе гортани и трахеи // Российский биотерапевтический журнал. - 2009. - Т.8, №2. - С. 323.
3. Лагун Л.В., Жаворонок С.В. Бактериальные биопленки и их роль в развитии инфекции мочевыводя-щих путей // Медицинский журнал БГМУ. - 2013. - №4. - С. 21-7.
4. Лукъянец Е.А., Ворожцое Г.Н., Калия О.Л. и др. Патент РФ № 2282647, приоритет от 31.05.2005, опубл. 27.08.2006.
5. Меерович И.Г., Оборотова H.A. Применение липосом в фотохимиотерапии: 1. Липосомы в ФДТ // Российский биотерапевтический журнал. - 2003. - Т.3, № 4. - С. 3-8.
6. Меерович И.Г., Оборотова H.A. Применение липосом в фотохимиотерапии: 2. Липосомальные формы для создания фотоактивируемых липосомальных препаратов в фотобиологических исследованиях // Российский биотерапевтический журнал. - 2004. - Т. 3, № 1. - С. 6-12.
7. Романова Ю.М., Толордава Э.Р., Диденко Л.В., Гинцбург А.Л. Биопленки как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития // ВРАМН. - 2011. - №10. - С. 31-9.
8. Соловьева А.Б., Толстых П.И., Сорокатый H.H. и др. ФДТ обширных гнойных ран и ожогов с комплексами амфифильных полимер-порфирин, иммобилизованными на наночастицах гидроксиапатита // Российский биотерапевтический журнал. - 2011. - Т. 10, № 1. - С. 81.
9. Странадко Е.Ф. Основные этапы развития и современное состояние ФДТ в России // Российский биотерапевтический журнал. - 2012. - Т. 11, № 2. - С. 51.
10. Странадко Е.Ф., Корабоев УМ., Толстых М.П. Фотодинамическая терапия при гнойных заболеваниях мягких тканей // Хирургия. - 2000. - Т. 9. - С. 67-70.
11. Furst A., Berlo R.S., Hooton S. Hydrazine as a reducing agent for organic compounds // Chem. Rev. - 1965. - 65. - P. 51.
12. Hamblin M.R., Hasan T. Photodynamic therapy: a new antimicrobial approach to infectious disease? // Photochem. Photobiol. Sci. - 2004. - 3. - P. 436-50.
13. Jori G., Brown S.B. Photosensitized inactivation of microorganisms // Photochem. Photobiol Sci. - 2004. -3. - P. 403-5.
14. Lee S-J. H., Jagerovic N., Smith K.M. Use of the chlorophyll derivative, purpurin-18 for syntheses of sensitizers for use in photodynamic therapy // J. Chem. Soc., Perkin Trans 1. - 1993. - P. 2369-77.
15. Lee C.F., Lee C.J., Chen C.T., Huang C.T. Delta-aminolaevulinic acid mediated photodynamic antimicrobial chemotherapy on Pseudomonas aeruginosa planktonic and biofilm cultures // J. Photochem. Photobiol. B. - 2004. - 75. - P. 21-5.
16. Li J.Z., Li L., Kim J.H. et al. Synthesis of Chlorophyllous Chlorin Derivatives Possessing Stereo-isomeric Character // J. Porphyrins Phthalocyanines. - 2011. - 15. - C. 264-70.
17. Malik Z., Ladan H., Nitzan Y. Photodynamic inactivation of Gram-negative bacteria: problems and possible solutions // J. Photochem. Photobiol. - 1992. - 14. - P. 262-6.
18. Minnock A., Vernon D.I., Schofield J. et al. Photoinactivation of bacteria. Use of a cationic water-soluble zinc phthalocyanine to photoinactivate both gram-negative and gram-positive bacteria // J. Photochem. Photobiol. - 1996. - 32. - P. 159-64.
19. Mironov A.F., Grin M.A., Nochovny S.A., Toukach F.V. Novel cycloimides in the chlorophyll a series // Mendeleev Commun. - 2003. - 4. - P. 156-8.
20. Mironov A.F., Kozyrev A.N., Brandis A.S. Sensitizers of second generation for photodynamic therapy of cancer based on chlorophyll and bacteriochlorophyll derivatives // Proc. SPIE. - 1993. - 1922. - P. 204-8.
21. Omar Gh.S.M. Killing of organisms responsible for wound infections using a light-activated antimicrobial agent / For the degree of Doctor of Philosophy in the Faculty of Medicine University College London. -2010. - P. 329.
22. Pace J.L., Rupp M.E., Finch R.G. Biofilms, Infection, and Antimicrobial Therapy // CRC Press Tay-lor&Francis Group. - 2005. - 7. - P. 109-53.
23. Rossolini G., Mantegoni E. Treatment and control of severe infections caused by multiresistant Pseudomonas aeruginosa // Clin Microbiol Infect. - 2005. - 11. - P. 17-32.
24. Sharonov G. V., Karmakova T.A., Kassies R. et al. Cycloimide bacteriochlorin p derivatives: photodynamic properties, cellular- and tissue distribution // Free radicals in biology and medicine. - 2006. - 40. - P. 407419.
25. Street C.N., Gibbs A., Pedigo L. et al. In vitro photodynamic eradication of Pseudomonas aeruginosa in planktonic and biofilm culture // Photochemistry and Photobiology. - 2009. - 85. - P. 137-43.
26. Wainwright M. Photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT) // J. Antimicrob. Chemother. - 1998. -42. - P. 13-28.
27. Wakako Hiraoka, Hidemi Honda et al. Comparison between sonodynamic effect and photodynamic effect with photosensitizers on free radical formation and cell killing //Ultrasonic Sonochemistry. - 2006. - 13. -P. 535-42.
