CC BY
36
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
О КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015 УДК 616.155.392.058-036.12-092:612.6
НОВЫЙ АЛЛЕЛЬ HLA-C*12:138, ВЫЯВЛЕННЫЙ У БОЛЬНОЙ ХРОНИЧЕСКИМ МИЕЛОЛЕЙКОЗОМ В ПРОЦЕССЕ ПОИСКА НЕРОДСТВЕННОГО ДОНОРА ДЛЯ ТРАНСПЛАНТАЦИИ АЛЛОГЕННЫХ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
Бидерман Б.В., Якутик И.А., Хамаганова Е.Г., Судариков А.Б., Кузьмина Л.А., Паровичникова Е.Н.,
Савченко В.Г.
ФГБУ Гематологический научный центр Минздрава России, 125167, г. Москва
Резюме. Методом аллельспецифического секвенирования у российской больной хроническим миелолейкозом (ХМЛ) обнаружен новый аллель HLA-C*12:138. Новый аллель отличается от стринга аллелей C*12:03:01G несинонимичной заменой в кодоне 18 (GGA>GTA), приводящей к замене глицина на валин в позиции 18 пептидсвязывающей бороздки. Показано, что аллель является наследуемым, а не возникшим в результате мутации при ХМЛ.
Ключевые слова: новый аллель; HLA-C*12:138; HLA-типирование; аллель-специфическое секвенирование.
Для цитирования: Гематология и трансфузиология. 2015; 60 (2): 4-5.
NEW HLA-C*12:138 ALLELE, DETECTED IN A FEMALE PATIENT WITH CHRONIC MYELOID LEUKEMIA DURING SEARCH FOR UNRELATED DONOR FOR TRANSPLANTATION OF ALLOGENIC HEMOPOIETIC STEM CELLS
Biderman B.V., YakutikI.A., Khamaganova E.G., SudarikovA.B., Kuzmina L.A., Parovichnikova E.N., Savchenko V.G.
Hematología! Research Center, 125167, Moscow, Russia
S u m m a r y.A new allele HLA-C*12:138is detected in a Russian female patient with chronic myeloid leukemia. The new allele differs from C*12:03:01G alleles by nonsynonymous replacement in codone 18(GGA>GTA), leading to replacement of glycine for valine in position 18 of the peptide-binding sulcus. The allele is inherited, but not emerged as a result of mutation in CML.
Key words: new allele; HLA-C*12:138; HLA typing; allele-specific sequencing.
Citation: Gematologiya i transfuziologiya. 2015; 60 (2): 4-5. (in Russ)
В отличие от других распространенных методов ДНК-типирования HLA-генов секвенирование дает возможность выявлять новые аллели. Количество вновь открытых аллелей генов HLA превышает 11 200 и продолжает увеличиваться в связи с возрастающим использованием в практической работе секвенирования [1]. Однако практически отсутствуют сообщения об открытии новых HLA-аллелей в России, что говорит о незначительном числе больных и доноров, типированных по генам HLA методом секвенирования с высоким разрешением. HLA-типирование больных и потенциальных доноров с высоким разрешением является обязательным условием для проведения успешной трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК) от неродственного донора [2]. Высокое разрешение подразумевает разрешение всех неоднозначностей во 2-м и 3-м экзонах генов HLA класса I и во 2-м экзоне генов HLA класса II, которые ведут к замене аминокислотных остатков в до-
Для корреспонденции:
Бидерман Белла Вениаминовна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной гематологии ФГБУ Гематологический научный центр Минздрава России. Адрес: 125167, Москва, Новый Зыковский проезд, д. 4. Телефон: +7(495) 612-65-11 E-mail: bella_biderman@mail.ru
Corresponding author:
Biderman Bella, BD, PhD, senior researcher (bella_biderman@mail.ru).
менах, образующих пептидсвязывающую бороздку молекул HLA, а также исключение нулевых аллелей. В номенклатуре HLA, введенной с апреля 2010 г. в связи с широким распространением секвенирования HLA-генов, для обозначения аллелей HLA класса I, имеющих идентичные экзоны 2 и 3, и аллелей HLA класса II с идентичным 2-м экзоном, использовано понятие G-группы (стринга) [3]. Все аллели, входящие в определенную группу, обозначаются по трем первым полям (6 цифр) меньшего по значению алле-ля в группе, за которыми следует буква G, например HLA-А*02:01:01G.
Ген HLA-C кодирует молекулу, которая не только презентирует антигенные пептиды Т-клеткам, но также является лигандом KIR (killer-cell immuno-globulin-like receptors) - рецепторов натуральных киллерных (КК)-клеток. KIR играют важную роль в регулировании функций NK-клеток [4].
Приводим описание нового аллеля гена HLA-С, выявленного у наблюдавшейся в ФГБУ Гематологический научный центр (ГНЦ) Минздрава РФ, Москва, больной М. с диагнозом хронического миелолейкоза, резистентным к терапии ингибиторами тирозинкиназ. HLA-типирование было проведено методом аллельспецифического секвенирования в лаборатории молекулярной гематологии ФГБУ ГНЦ Минздрава РФ с целью поиска неродственного донора для алло-ТГСК.
С*12:03:01:01 С*12:138
С*12:03:01:01 С*12:138
С*12:03:01:01 С*12:138
С*12:03:01:01 С*12:138
С*12:03:01:01 С*12:138
С*12:03:01:01 С*12:138
С*12:03:01:01 С*12:138
Материалы и методы
ДНК пациентки и ее дочери была выделена из периферической крови с помощью набора Invitrogen DNA Isolation Kit («Life Technologies Corp.», США) и генотипиро-вана по локусам HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1 и HLA-DQB1 с использованием коммерческого набора для аллельспецифи-ческого секвенирования ("Protrans GmbH", Германия) согласно инструкции производителя. Нуклеотидные последовательности ПЦР-продуктов были получены на генетическом анализаторе ABI3130 ("Applied Biosystems", США) с помощью набора флюоресцентно-меченных красителей Big-DyeTerminator v.1.1 ("Applied Biosystems", США) и проанализированы в программе SeqPilot ("JSI medical systems GmbH", Германия). Типирование дочери пациентки методом PCR-SSP (sequence specific primers) проводили с помощью коммерческого набора ("Invitrogen", США) для низкого разрешения.
Результаты
Результаты секвенирования генов HLA больной М.: HLA-A*11:01:01 G, *25:01:01G; HLA-B*07:02:01G, *18:01:01G; HLA-DRB1*07:01:01G, * 16:01:01; HLA-DQB1*02:01:01G, *05:02:01G. Секвенирование гена HLA-С* установило носительство аллеля HLA-С*07:02:0Ю, однако секвенс второго HLA-С аллеля отличался от всех имеющихся в базе данных IMGT/ HLA. Наиболее близкая последовательность была у стринга (группы) аллелей C*12:03:01G (в этот стринг входят все аллели гена HLA-С*, имеющие одинаковую нуклеотидную последовательность во 2-м и 3-м экзонах с аллелем C*12:03:01:01), однако новый аллель отличался от него несинонимичной заменой в кодоне 18 (GGA>GTA), приводящей к замене глицина на валин в позиции 18 пептидсвязыва-ющей бороздки (см. рисунок).
Результаты типирования дочери методом PCR-SSP: HLA-A*01, HLA-A*25; HLA-C*06, HLA-C*12; HLA-B*13, HLA-B*18; HLA-DRB1*07. Секвенирование гена HLA-C у дочери установило наличие аллеля из стринга HLA-С*06:02:01G, второй аллель имел ту же новую последовательность, как у самой больной, сопровождающуюся заменой G>V.
Обсуждение
Аллельспецифическое (гаплотипспецифическое) секвенирование отличается от локусспецифического секвенирования тем, что в начале методики происходит разделение генов HLA (2n) на два отдельных гаплотипа (n), а после расщепления HLA-гаплотипов - их секвенирование. Преимущество аллельспецифи-ческого секвенирования перед локусспецифическим в том, что оно обычно позволяет избежать неоднозначностей, возникающих вследствие гетерозигот-ности генов HLA, поскольку примерно 90% людей гетерозиготны по каждому гену HLA [5]. Аллельспе-цифическое секвенирование отвечает требованию к
1 14
GC ТСС САС ТСС ATG AGG TAT ТТС TAC АСС GCC GTG ТСС CGG
15 CCC GGC CGC 18 GGA GAG CCC CGC TTC АТС GCA GTG GGC TAC 28 GTG
29 GAC GAC ACG CAG ТГС GTG CGG TTC GAC AGC GAC GCC GCG 42 AGT
43 CCA AGA GGG GAG CCG "1 CGG GCG CCG TGG GTG GAG CAG GAG 56 GGG
57 CCG GAG TAT TGG GAC CGG GAG АСА CAG AAG TAC AAG CGC 70 CAG
71 GCA CAG GCT GAC CGA GTG AGC CTG CGG AAC CTG CGC GGC 84 TAC
85 TAC AAC CAG AGC GAG GCC 91 G
Нуклеотидные последовательности 2 экзона нового аллеля HLA-C*12:138 и наиболее сходного с ним HLA-C*12:03:01:01. Пробелы показывают совпадение с последовательностью HLA-C*12:03:01:01. Числа над секвенсом указывают номера кодонов.
открытию новых аллелей комитета ВОЗ по номенклатуре HLA [3] о том, что новый аллель должен быть секвенирован отдельно от второго аллеля. Результаты секвенирования генов HLA больной М. показали наличие нового аллеля из стринга C*12:03:01G. Поскольку секвенсы, полученные при исследовании опухолевого материала, не принимаются к рассмотрению в качестве новых HLA-аллелей комитетом по номенклатуре HLA-аллелей, мы исследовали гены HLA дочери больной. Результаты HLA-типирования дочери методом PCR-SSP показали, что она наследовала от матери HLA-гаплотип HLA-A*25^*12^*18-HLA-DRB1*07. Это дало возможность предположить, что дочь могла наследовать от матери новый аллель. Данный факт подтвердился при секвенировании, т.е. мы показали, что новый аллель не возник вследствие мутаций, связанных с ХМЛ, и является наследуемым. Последовательности 2 и 3-го экзонов нового аллеля были представлены в базу данных GeneBank [6] и получили входящий номер KM197168. В сентябре 2014 г. номенклатурным комитетом ВОЗ новому аллелю официально присвоено имя С*12:138.
Таким образом, использование аллельспецифи-ческого секвенирования дало возможность выявить новый аллель гена HLA-C, отличающийся по аминокислотной последовательности от известных и не выявляемый при использовании метода PCR-SSP.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Robinson J., Halliwell J.A., McWilliam H., Lopez R., Parham P., Marsh S.G. The IMGT/HLA database. Nucleic Acids Res. 2013; 41(Database issue): D1222-7. doi: 10.1093/nar/gks949.
2. Lee S.J., Klein J., Haagenson M., Baxter L.A., Confer D.L., Eapen M., et al. High resolution donor-recipient HLA matching contributes to the success of unrelated donor marrow transplantation. Blood. 2007; 110(13): 4576-83.
3. Marsh S.G., Albert E.D., Bodmer W.F., Bontrop R.E., Dupont B., Erlich H.A., et al. Nomenclature for factors of the HLA system, 2010. Tissue Antigens. 2010; 75(4): 291-455. doi: 10.1111/j.1399-0039.2010.01466.x.
4. Leung W. Use of NK cell activity in cure by transplant. Br. J. Haematol. 2011; 155(1): 14-29. doi: 10.1111/j.1365-2141.2011.08823.x.
5. Blasczyk R. HLA diagnostic sequencing - conception, application and automation. J. Lab. Med. 2003; 27(9/10): 359-68.
6. Biderman B.V., Khamaganova E.G., Yakutik I.A. Homo sapiens MHC class I antigen (HLA-C) gene, HLA-Cw*12 new allele, exons 2, 3 and partial cds. 2014. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ KM197168.
Поступила 02.12.14 Received 02.12.14
