CC BY
152НОВЫЕ ВЗГЛЯДЫ НА МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ИЕРСИНИОЗА
Н. У. Нарзуллаев, М. Р. Мирзоева, Г. С. Остонова
Бухарский государственный медицинский институт
АННОТАЦИЯ
В статье приведены результаты многолетнего обследования 250 больных генерализованной формой иерсиниоза. Бактериологическим методом при спорадическом иерсиниозе (218 пациентов) в 1 случае (0,46 %) диагноз под -твержден гемокультурой, в 65 (29,8 %) — копрокулътурой, во время водной вспышки иерсиниоза возбудитель выделен из кала у 5 из 32 заболевших (15,6 %). Серологические методы исследования позволили подтвердить диагноз генерализованной формы иерсиниоза в поздние сроки заболевания у 87,6 % больных реакцией непрямой гемагглютинации, у 80,6 % — реакцией агглютинации. Иммунодиагностические тесты позволяют диагностировать иерсиниоз в первые дни заболевания (реакция коагглютинации), а также при формировании затяжных, хронических, вторично-очаговых форм (реакция непрямой иммуно-флюоресценции, Вестерн-блот).
Ключевые слова: иерсиниоз, лабораторная диагностика.
NEW VIEWS ON THE METHODS OF DIAGNOSIS OF YERSINIOSIS
N. U. Narzullaev, M. R. Mirzoeva, G. S. Ostonova
Bukhara State Medical Institute
ABSTRACT
The results of long-term examinations of 250 patients suffering from generalized form ofyersiniosis are presented in the article. By means of bacteriological method, at sporadic yersiniosis (218 patients) in 1 case (0,46 %) the diagnosis was confirmed with hemoculture, and in 65 (29,8 %] — with stool culture; at waterborne outbreak of yersiniosis the agent was excreted from feces at 5 of 32 patients (15,6 %). Serological study methods enabled to confirm the diagnosis of generalized form of yersiniosis in late periods of disease at 87,6 % of patients suffering from reaction of indirect hemagglutination and at 80,6 % of patients suffering from reaction of agglutination. Immunodiagnostic tests enable diagnosing of yersiniosis in early days of disease (reaction of co-agglutination] and also at formation of lingering, chronic, and secondary focal forms (reaction of indirect immunofluorescence, Western blot].
Keywords: yersiniosis, laboratory diagnostics
Иерсиниоз — широко распространенный сапрозоонозный бактериоз, вызываемый Yersinia enterocolitica. Природным резервуаром Y. enterocolitica является почва. Источник заражения для людей — сельскохозяйственные и домашние животные, реже — грызуны. Редко источником заражения может быть больной человек и бактериовыделитель Y. enterocolitica. Фекально-оральный механизм заражения иерсиниоза реализуется пищевым, водным и бытовым путями. Обычно человек инфицируется при употреблении продуктов животноводства, контаминированных Y. enterocolitica (молока, молочных продуктов, мяса, тушек цыплят, яиц), а также овощей и фруктов, которые употребляются в пищу в сыром или недостаточно термически обработанном виде, длительное время сохраняющихся при низких температурах (1).
Водный путь заражения при иерсиниозе встречается реже, наблюдается при употреблении загрязненной воды колодцев, открытых водоемов, природных источников, в отдельных случаях — водопроводной воды. Так, в 2002 г. в небольшом городе Донецкой области наблюдалась водная вспышка иерсиниоза (32 заболевших), обусловленная инфицированием водопроводной воды Y.enterocolitica (2).
Иерсиниоз регистрируется повсеместно в виде спорадических случаев и эпидемических вспышек. Для спорадического иерсиниоза характерен незначительный весенний и выраженный осенне-зимний подъем заболеваемости (3). Клинически иерсиниоз характеризуется исключительным многообразием синдромов, нередко системного характера, что в сочетании со сложностью лабораторного подтверждения диагноза объясняет актуальность данной проблемы не только для инфекционистов, но и врачей смежных специальностей (терапевты, гастроэнтерологи, хирурги, ревматологи, дерматологи, аллергологи и т.д.) (4, 5). Разнообразие проявлений иерсиниоза обусловливает важность лабораторного подтверждения диагноза. Своевременная лабораторная диагностика заболевания является залогом полного выздоровления, а также предупреждения рецидивов и хронизации заболевания.
Целью работы являлся анализ эффективности различных методов лабораторной диагностики иерсиниоза.
Материал и методы исследований: С 2018г. нами обследовано 250 больных генерализованной формой иерсиниоза (138 мужчин и 112 женщин), в том числе 32 во время эпидемической вспышки заболевания. Среди остальных 218 больных преобладали единичные, не связанные друг с другом случаи и только у 11,5 % в семьях заболевало 2-3 человека одновременно. Возраст больных был от 15 до 68 лет, преобладали молодые люди и лица среднего возраста. Обследование больных генерализованной формой иерсиниоза осуществляли бактериологическим методом, постановкой
серологических реакций непрямой гемагглютинации и агглютинации (РИГА и РА), у 64 пациентов спорадическим иерси- ниозом — реакцией коагглютинации (РКоА). Кроме этого, у 87 больных с реактивным артритом диагностика иерсиниозной этиологии заболевания осуществлялась реакцией непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) с использованием тест-системы производства EUROIMMUN AG (Германия). С целью выявления иерсиниоза методом иммуноблотинга (Вестерн-блот) обследовано 104 больных с применением тест-системы EUROIMMUN AG (Германия).
Результаты и обсуждение: В диагностике инфекционных заболеваний бактериологи ческое подтверждение играет неоспоримую роль [6]. Бактериологическое исследование испражнений больных проводилось у всех больных спорадическим иерсиниозом, а также при водной вспышке заболевания. Исследуемый материал (фекалии, моча, смыва с задней стенки глотки, сгусток крови, мокрота, желчь, ликвор, операционный материал и др.) засевают на жидкую питательную среду накопления, в качестве которой использовали фосфатно-буферный раствор с pH 7,6-7,8. В пробирки с 5 мл жидкой среды вносили материал и выдерживали в холодильнике при температуре 3-4 °С в течение 15 суток, каждые 5 дней делая высевы на плотные среды Эндо, Серова, с бромтимоловым синим. Видовую принадлежность выделенных культур устанавливали на основании комплексов типичных морфологических, культуральных, биохимических, антигенних и других свойств. Окончательный ответ бактериологического исследования можно получить спустя 17-21 суток. Оптимальные сроки забора материала — первые 7-10 дней болезни. Бактериологичекая диагностика при иерси- ниозе имеет низкую результативность (10-25 %) [7]. Во время водной вспышки иерсиниоза возбудитель выделен из кала у 5 из 32 заболевших (15,6 %). При бактериологическом обследовании больных спорадической формы иерсиниоза (218 пациентов) возбудитель в 1 случае (0,46 %) выделен из крови, в 65 (29,8 %) — из испражнений. Таким образом, бактериологический анализ трудоемок и длителен, крайне редко удается получить культуру Y. enterocolitica из материала больных с затяжным течением и вторично-очаговыми формами иерсиниоза [8], поэтому особое значение в диагностике иерсиниоза приобретают иммунодиагно- стические методы, которые позволяют обнаружить антигены Y. enterocolitica в клиническом материале до 10-го дня от начала болезни (иммуноферментный анализ (ИФА), реакция коагглютинации (РКоА), реакция иммунофлуоресценции (РИФ), реакция непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ), реакция агглютинации и лизиса (РАЛ) [8-12].
В качестве экспресс-метода в диагностике иерсиниоза мы использовали РКоА с помощью тест-систем Санкт-Петербургского НИИ им. Пастера. РКоА основана на определении бактериального антигена в различных биологических жидкостях
(кровь, слюна, моча, копрофильтрат) на принципе соединения белка А золотистого стафилококка с Fc-фраг- ментом иммуноглобулинов человека. При этом Fab-фрагменты антител остаются свободными для реакции с гомологичными антигенами. Белок А имеет сродство к Fc-фрагменту иммуноглобулинов, поэтому такие бактерии, обработанные иммунной диагностической сывороткой неспецифически адсорбируют антитела сыворотки, которые затем взаимодействуют активными центрами с соответствующими микробами, выделенными от больных. В результате коагглютинации образуются хлопья, состоящие из стафилококков, антител диагностической сыворотки и определяемого микроба. Использование РКоА эффективно в ранние сроки заболевания (до 90 % положительных результатов получено на 1-й неделе заболевания), но малоэффективно при обследовании пациентов на 2 неделе болезни и позже [9]. С помощью РКоА было обследовано 64 пациента иерсиниозом (спорадические случаи). Применение РКоА в первые 5-6 дней от начала заболевания позволило уточнить этиологию заболевания в 84,4 % случаев. Наиболее часто антигены Y. enterocolitica определялись в слюне (71,9 %) и ко-профильтратах (60,9 %), реже — в крови (28,1 %) и моче (37,5 %). У 29 (53,7 %) больных иерсиниозом обнаружен антиген 0:3, у 18 (33,3 %) — антиген 0:9, у 7 (13,0 %) — антиген 0:5. Для ранней диагностики иерсиниоза перспективным является РНИФ, которую используют не только для определения антигенов, но и для титрования антител. На поверхность предметных стекол наносили бактериальные мазки Yersinia enterocolitica (серовары 0:3, 0:6, 0:9). Стекла инкубируют с образцами разведенной сыворотки или плазмы крови пациента. Имеющиеся в положительных образцах специфичные антитела классов IgG или IgM к Yersinia enterocolitica связываются с бактериальными антигенами. Связавшиеся антитела выявляют флюоресцентным окрашиванием. Характер свечения оценивается с помощью флюоресцентного микроскопа. Данным методом нами обследовано 87 больных с реактивным артритом, из них у 42 (48,3 %) выявлены IgM к Y. enterocolitica. Серовар 0:3 определен у 38,0 %, 0:6 — у 9,2 %, 0:9 —у 6,9 %, при этом у 6,9 % больных обнаружены антитела к нескольким антигенам возбудителя — 0:3 и 0:9; 0:3, 0:6 и 0:9.
Для определения специфических антител к антигенам Y. enterocolitica
Таблица. Диагностически значимые YOP, использованные в recombine Yersinia производства _Mikrogen, Германия_
Антиген Размер (кДа) Функция
Y0PM 58 Ингибирование агрегации тромоцитов
Y0PH 46 Резистентность к фагоцитозу, цитотоксичность (?)
V-AG 38 Ингибирование TNF-a
Y0PD 35 Ингибирование TNF-a
Y0PN 34 Ассоциирован с Yersinia артритом (?)
Y0PE 25 Цитотоксичность
используют серологические методы. Широкое распространение в клинической практике получила РИГА.
Метод основан на определении титра антител в сыворотках крови больных с использованием в качестве антигена липополисахарида (ЛПС) из Y. enterocolitica серологических вариантов 0:3 и 0:9 [13]. РИГА исследовалась всем больным генерализованной формой иерсиниозом. При обследовании на 1-й неделе болезни РИГА была положительной у 71 больного (28,4 %) в титрах 1:200 — 1: 100 с антигеном 0:3 и 0:9, а нарастание титра антител на 3-й неделе отмечалось в 87,6 % случаев. Этиологическая роль серовара 0:3 установлена у 91,3 % больных иерсиниозом, серовара 0:9 —у 8,7%.
Вторая реакция, основанная на определении иерсиниозных антител в сыворотке крови больных и использованная в нашем исследовании, была РА с О-Н-диагностикумами (взвесь живых бактерий) в лаборатории Ростовского-на-Дону противочумного института [13]. РА исследовалась у 62 больных спорадическим иерсиниозом. У 8 (3,2 %) пациентов диагноз иерсиниоза подтвержден РА сантигенами 0:2а, 0:2в, 0:5.27, 0:10, 0:Юк,у 36 (58,1 %) — с антигеном 0:3, у 6 (9,7 %) — с антигеном 0:9.
Недостатком РИГА является типоспецифичность реакции, что не позволяет диагностировать заболевание, вызванное другими серовариантами Y. enterocolitica. Кроме того, титры антител достигают диагностически значимых величин в поздние сроки заболевания, т.е. на 3-4 неделе, что снижает эффективность диагностики иерсиниоза в раннем периоде болезни. Недостатком метода РА является также типоспецифичность реакции: для постановки РА необходимы эталонные штаммы Y. enterocolitica наиболее распространенных серовариантов (0:3, 0:9, 0:4.3, 0:5.27 и др.). Крайне редко серологическими методами подтверждается гастроинтестинальная форма иерсиниоза (4,5 %). [10]. Однократность исследования крови серологическими реакциями не позволяет однозначно трактовать полученные результаты, диагностика иерсиниоза осуществляется при исследовании парных сывороток с интервалом 10-14 дней. По мнению некоторых авторов для повышения эффективности диагностики иерсиниоза целесообразно исследовать сыворотку крови больных иерсиниозом несколькими серологическими методами [10].
Патогенность иерсиний зависит от плазмид (нехромосомных генетических факторов) и экспрессии кодируемых на них белков. Эти белки наружной мембраны («Yersinia outer memrane proteins» — Yop) специфичны для иерсиний и не обнаружены у других бактерий. Все заболевания, вызываемые патогенными штаммами Y. enterocolitica, выявляются с помощью идентификации YOP-специфических антител [14-16].
Тест-системы для диагностики методом Вестерн-блота содержат тестовые
стрипы с электрофоретически разделенными факторами вирулентности патогенных штаммов Yersinia enterocolitica. Стрипы инкубируют на первой стадии реакции с образцом разведенной сыворотки или плазмы крови пациента. В случае, если образец положительный, специфические антитела классов IgA или IgG будут связываться с соответствующими антигенами. Для обнаружения связанных антител проводим инкубацию с использованием ферментного конъюгата (антитела к IgA или IgG человека, меченные щелочной фосфатазой), который способен вызывать развитие цветной реакции. IgA, IgG антитела могут быть обнаружены в раннюю фазу после контакта с факторами вирулентности Yersinia enterocolitica. Титры IgA снижаются в течение нескольких месяцев. Антитела класса IgG обычно персистируют существенно дольше и могут выявляться в сыворотке через 12 месяцев и более после начального контакта с антигенами возбудителя. Для острого периода характерны нарастающие или высокие титры IgG антител. При хронических формах заболевания и иммунопатологических осложнениях антитела класса IgG и даже IgA могут обнаруживаться и в течение более длительного периода. Y. enterocolitica может персистировать годы в слизистой кишечника и лимфатической ткани. Персистенция возбудителя может ассоциироваться с персистенцией специфических IgA антител [16]. При скрининговом обследовании методом иммуноблотинга (Вестерн-блот) 104 больных с неуточненными заболеваниями диагноз иерсиниоза, включая хронические формы заболевания, диагностирован в 19,2 % случаев обнаружением AT-IgA к Y. enterocolitica, у 29,8 % больных — АТ-IgG. У 12 пациентов (11,5 %) выявлены AT-IgA и АТ-IgG к Y. enterocolitica. Профиль антител IgA и IgG к антигенам Y. enterocolitica представлен р.46, р.44, р.38, р.36, р.34, р.ЗО, р.25.
Генетическим методом диагностики и типирования иерсиний является ПЦР [17]. К достоинствам ПЦР следует отнести быстроту выполнения анализа (до 6 ч), информативность, высокую чувствительность и специфичность. Однако, являясь высокотехнологичным методом диагностики иерсиниоза (подтвержение в 99 %), ПЦР не нашла широкого практического использования в виду ее высокой стоимости и низкой технической оснащенности клинических лабораторий.
Выводы: Таким образом, в арсенале практического врача в настоящее время имеется достаточное количество методов лабораторной диагностики иерсиниоза, которые должны использоваться комплексно в соответствии с клиническими формами и периодами заболевания. Не исключая значимость традиционных методов исследования (бактериологический, серологический), необходимо помнить, что современнные тесты, такие как РНИФ, иммуноблотинг, ПЦР являются более совершенными и информативными способами подтверждения диагноза в разные периоды болезни, включая иммунопатологические осложнения
и хронические формы иерсиниоза. REFERENCES
1. Ценевой Г.Я. Иерсинии и иерсиниозы. - СПб., 2016.- С. 168170.
2.Домашенко О.М. Характеристика водного спалаху ерсинюзу в Донецькш область / О.М. Домашенко, Т.С. Самойленко, I.I. Сошенко, В.Я. Верещагша // Вестник гигиены и эпидемиологии. - 2012. - Т.б, № 2. - С.223-226.
3.Головчак Г.С. Епщемюлопчна характеристика iep- CHHio3iB в умовах урбашзованих територш та удосконалення системи епщемюлопчного нагляду: Автореф. дне... канд. мед. наук: спец. 14.01.13 «инфекцшш хвороби» / Г.С. Головчак. - К., 2010. - 19 с.
4. Ющук Н.Д., Ценева Г.Я., Кареткина Г.Н., Бродов Л.Е. Иерсиниозы. - М., 2013. -С.265-268.
5.Шестакова И. В. Иерсиниоз: диагностические ошибки/И.В. Шестакова, Н.Д. Ющук, Т.И. Попова // Врач. - 2017.-№ 7.-С. 71-74.
6.Ценева Г.Я. Биологические свойства иерсиний и лабораторная диагностика псевдотуберкулеза и иерсиниоза: пособие для врачей/ Г.Я. Ценева, Е.А. Воскресенская, Ю.Ю. Солодовникова. - СПб., 2011. - 60 с.
7. Филатов Н.Я., Салова В.П., Голованова Т.И., Шестеперова //В кн.: Инфекции, обусловленные иерсиниями (иерсиниоз, псевдотуберкулез], и другие актуальные инфекции. - СПб, 2000.-С. 59-60.
8.Шестакова И. В. Хронический иерсиниоз как терапевтическая проблема/ И.В. Шестакова, Н.Д.Ющук // Тер. архив. -2010, т. 82. -№ 3. - С. 71-77.
9. Климанова Е.М, Белая О.Ф., Лаврова К.В. Использование реакции коагглютинации в диагностике иерсиниозов у детей. // Педиатрия. -2003. - №.4. -С. 48-49.
10.Ющук Н.Д. Проблемы лабораторной диагностики иерсиниозов и пути их решения/ Н.Д. Ющук И.В. Шестакова // ЖМЭИ. - 2007. - № 3. - 61-66.
11.Александер С.К. Приготовление IgG диагностикума на основе окрашенных полиакролеиновых латексов для применения в реакции латексной агглютинации/ С.К. Александер , Ю.В. Лукин, Л.М. Фидлер // ЖМЭИ. - 1990. - № 6. - С. 84-88.
12.Малов И.В., Рубцов И.В., Ющенко Г.В., Леоненко В.В. Способ иммуноферментной диагностики иерсиниозов // Патент SU 1767435 А 1 от 1992. 10.07.
13.Королюк А.М. Серологическая диагностика кишечного иерсиниоза. Конструирование стабильного эритроцитарного препарата для реакции непрямой гемагглютинации / А.М. Королюк, С.Н. Головачева, М.В. Дулатова // ЖМЭИ. -1990. - №3. - С. 30-34.
SCIENTIFIC PROGRESS VOLUME 2 I ISSUE 4 I 2021
ISSN: 2181-1601
14.Кокорина Г.И. Генотипы штаммов Yersinia pseudotuberculosis и их клиническое и диагностическое значение: дне. на соискание науч. степени кан. мед. наук : 03.02.03 «Микробиология» / Г.И. Кокорина. - СПб, 2013. - 133 с.
15.Смирнов И.В. Возбудитель иерсиниоза и близкие к нему микроорганизмы/И.В. Смирнов // Клин, микробиол., антимикроб, химиотерапия. - 2014, Т. 6. - № 1.-С. 10-21.
16.Кокорина Г.И. Применение иммуноблота в диагностике затяжных форм иерсиниозов и изучение вопросов патогенеза (обзор литературы] / Г.И. Кокорина, О.А. Шендерович, Г.Я. Ценева // Клин, лабор. диагн. - 2006. - № 4. - С. 40-44.
17.Малышева Е.Б. Значение метода ПЦР в диагностике иерсиниоза: новые технологии в оценке эффективности лечения и прогноза/ Е.Б. Малышева, Е.Д. Московкина, О.М. Волнова [и др.] // Генодиагностика в современной медицине: тез. докл. 3-й Всеросс. научи. - практ.конф. - Москва, 2010. - С. 169.
