CC BY
67
Сведения об авторах статьи:
Афанасьева Юлия Геннадьевна - к.фарм. наук, доцент кафедры фармакогнозии с курсом ботаники и основ фитотерапии ГБОУ ВПО БГМУ Минздравсоцразвития России. Адрес: 450000, г. Уфа, ул. Ленина З.Тел. (347) 271-22-85. E-mail: ufajulia@mail.ru
Сысоева Татьяна Викторовна - соискатель кафедры фармакогнозии с курсом ботаники и основ фитотерапии БГОУ ВПО БГМУ Минздравсоцразвития России. Адрес: 450000, г. Уфа, ул. Ленина 3.
Кильдияров Фанис Хамидуллович - к.фарм. наук, доцент кафедры фармацевтической технологии ГБОУ ВПО БГМУ Минздравсоцразвития России. Адрес: 450000, г. Уфа, ул. Ленина 3. Тел. (342) 273-61-47.
ЛИТЕРАТУРА
1. А. с. 1507394 А1. Способы количественного определения флавоноидов в растительном сырье / В.В. Беликов, Н.Т. Колесник. -Государственный комитет по изобретениям и открытиям № 4301201; заявл 25.08.87, опубл. 15.09.1989, Бюл. № - 34. - 3 с.
2. Атопический дерматит // Клинические рекомендации. Педиатрия / под ред. А.А. Баранова. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2005. - С. 1735.
3. Дерматовенерология / Е.В. Соколовский, Е.Р. Аравийская, К.Н. Монахов [и др.] / под ред. Е.В. Соколовского. - М.: Академия, 2005. - 528 с.
4. Афанасьева, Ю.Г. Влияние извлечения из ряда лекарственных растений на иммунный ответ в эксперименте / Ю.Г. Афанасьева, Т.В. Пахомова, Н.Ж. Басченко, В.В. Сперанский // Растительные ресурсы. - 2008. - Вып. 3. - С. 118-122.
5. Глушко, Е.В. Эпидемиология аллергических заболеваний у детей Ставропольского края: автореф. дис. ... канд. мед. наук. -Ставрополь 2009. - 22 с.
6. Временные инструкции по проведению работ с целью установления сроков годности лекарственных средств на основе метода «ускоренного старения » при повышенной температуре: Приказ МЗ СССР и ММП № 4301224 от 18 апреля 1983 года.
7. Государственная фармакопея СССР /гл. ред. М.Д. Машковский.-11-е изд. -М.:Медицина, 1989.-Вып.2:Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье. - 397 с.
8. Даутов, Ф.Ф. Аллергическая заболеваемость детского населения города с развитой нефтехимической промышленностью / Ф.Ф. Даутов, Р.Ф. Хакимова, Н.З. Юсупова [и др.] // Гигиена и санитария. - 2009. - № 3. -С.54-57.
9. Мавлянов, И.Р. Аллергические осложнения на лекарства и сезонная характеристика их встречаемости / И.Р. Мавлянов, А.Ш. Касымов, З.И. Мавлянов, Н.М. Каримова [и др.] // Вестник восстановительной медицины. Диагностика. Оздоровление. Реабилитация: орган Ассоциации специалистов восстановительной медицины. - 2010. - № 5. - С. 68-71
10. Патент на изобретение № 2353348 “Мазь для лечения аллергических заболеваний кожи широкого спектра действия”/ Афанасьева Ю.Г., Кильдияров Ф.Х., Хисматуллина З.Р., Сысоева Т.В.
11. Anandan, C. Epidemiology and current status of allergic rhinitis, asthma, and associated allergic diseases in Korea: ARIA Asia-Pacific workshop report / Anandan C. Gupta R. Simpson C.R. Fischbacher C. Sheikh A. // Journal of the Royal Society of Medicine.- 2009. Vol.-102(10). - P. 431-42.
12. Dorner, T. Epidemiology of allergies in Austria. Results of the first Austrian allergy report / Dorner T., Lawrence K., Rieder A., Kunze M., // Wiener Medizinische Wochenschrift. - 2007. Vol.- 157(11-12). - P. 235-42.
13. Epidemiological and immunological evidence for the hygiene hypothesis. Garn H. Renz H. Immunobiology. - 2007. Vol.- 212(6). - P. 441-52.
14. Yoda, S. Epidemiological survey of allergic diseases in first-year junior high school students in Wakayama Prefecture in 2003 / Yoda S., Enomoto T., Dake Y., Ikeda H., Shibano A. // Journal of the Oto-Rhino-Laryngological Society of Japan. - 2006. Vol. 109(10). - P. 742-8.
УДК 616-091.811
© В.В. Плечев, Б.А. Олейник, Р.Ю. Рисбрег, Д.В. Плечева, 2012
В.В. Плечев, Б.А. Олейник, Р.Ю. Рисбрег, Д.В. Плечева НОВЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ СТИМУЛЯЦИИ НЕОАНГИОГЕНЕЗА ПРИ ОСТРОМ ИНФАРКТЕ МИОКАРДА У КРОЛИКОВ
ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России, г. Уфа
В работе рассмотрены новые методы стимуляции неоангиогенеза при остром инфаркте миокарда. Проведена оценка эффективности применения препаратов «Иммурег» и «Аллоплант-стимулятор васкулогенеза» для стимуляции роста новых сосудов. В эксперименте использовались 112 кроликов-самцов породы шиншилла весом 2,0-2,5 кг. У животных воспроизводилась модель инфаркта миокарда путем перевязки передней нисходящей артерии. После этого подопытные животные были выведены из эксперимента. Выполнена оценка экспрессии генов actine, fgf2, hgf, igf-1 и vegfa у разных групп сравнения методом количественной ОТ-ПЦР в реальном времени.
Ключевые слова: экспрессия, ген, инфаркт, кролик, неоангиогенез, реваскуляризация.
V.V. Plechev, B.A. Oleinik, R.Yu. Risbreg, D.V. Plecheva NEW OPPORTUNITIES OF NEOANGIOGENESIS STIMULATION IN ACUTE MYOCARDIAL INFARCTION IN RABBITS
The paper discusses new methods of neoangiogenesis stimulation in acute myocardial infarction. The efficacy of drugs "Im-mureg" and "Alloplant vasculogenesis stimulant" for stimulation of the growth of new blood vessels has been evaluated. The experiment observed 112 male Chinchilla rabbits weighing 2.0-2.5 kg. The left anterior descending artery was ligated to reproduce the model of myocardial infarction in animals. After the test the animals were removed from the experiment. The estimation of gene expression actine, fgf2, hgf, igf-1 and vegfa in different comparison groups by quantitative RT-PCR in real time has been carried out.
Key words: expression, gene, heart attack, rabbit, neoangiogenesis, revascularization.
Ишемическая болезнь сердца остается Высокий уровень летальности при инфаркте
одной из главных причин, определяющих вы- миокарда во многом определяется особенно-
сокий уровень инвалидизации и смертности стями регенерации миокарда. У человека на
работоспособного населения во всём мире. поздних стадиях онтогенеза кардиомиоциты
утрачивают способность к регенерации. В результате этого погибшие в ходе ишемии кар-диомиоциты замещаются соединительной тканью. Необратимое повреждение кардио-миоцитов и сосудистых структур вследствие ишемии миокарда приводит к нарушению функции сердца и в конечном итоге к сердечной недостаточности. Используемые в настоящее время консервативные и оперативные методы лечения ишемии миокарда не всегда эффективны или не могут быть применены по ряду причин. Так, например, у больных с дистальным поражением и диффузными изменениями в коронарных артериях достичь ре-васкуляризации миокарда с помощью методов хирургической коррекции невозможн [1,2,3]. В связи с этим разрабатываются новые способы регенерации пораженного миокарда на основе современных достижений молекулярной и клеточной биологии. Таким новым направлением в кардиологии и кардиохирургии является использование клеток костного мозга. Большое число экспериментальных работ демонстрирует положительное влияние трансплантации этих клеток на регенерацию поврежденного миокарда [4,5,6]. Однако введение данных клеток не лишено недостатков, таких как необходимость иммуносупрессив-ной терапии, риск развития неопластических процессов, а также этические и юридические проблемы.
Все перечисленное диктует необходимость разработки новых подходов к улучшению реваскуляризации миокарда путем стимуляции неоангиогенеза.
Цель исследования:
Изучить влияние препаратов «Имму-рег» и «Аллоплант-стимулятор васкулогене-за» на экспрессию матричной РНК к белкам -стимуляторам ангиогенеза — при экспериментальном инфаркте миокарда.
Материал и методы
Для оценки эффективности применения препаратов «Иммурег» и «Аллоплант-стимулятор васкулогенеза» для стимуляции неоангиогенеза при острой ишемии миокарда нами проведено исследование 112 кроликов-самцов породы шиншилла весом 2,0-2,5 кг. У животных воспроизводилась модель инфаркта миокарда путем перевязки передней нисходящей артерии на границе начальной и средней частей. Наличие инфаркта подтверждалось данными электрокардиографии, анализ проводился по III стандартному отведению.
Для определения границ инфаркта миокарда использовался следующий способ: в краевую вену уха вводили болюсно раствор
тетрациклина из расчета 100 мг на 1 кг тела животного (тетрациклин обладает способностью к флуоресценции в лучах ультрафиолетового света). После этого при освещении сердца лампой Вуда в темном помещении определяется яркая желто-зеленая флюоресценция сердца с дефектом перфузии в области кровоснабжения передней нисходящей артерии.
Интраоперационно после создания модели инфаркта миокарда и определения очага некроза все животные были разделены на 4 группы в зависимости от приводимого лечебного воздействия.
1-я группа (25 животных) - контрольная. Животным этой группы по границе очага инфаркта миокарда эндомиокардиально из нескольких вколов вводился «Плацебо» - физиологический раствор. Лечение «Иммуре-гом» после операции не проводилось.
2-я группа (29 животных) - группа «Ал-лоплант». Животным этой группы по границе очага инфаркта миокарда эндомиокардиально из нескольких вколов вводили препарат «Ал-лоплант - стимулятор васкулогенеза», лечение «Иммурегом» после операции не проводилось.
3-я группа (28 животных) - группа «Иммурег». По границе очага инфаркта миокарда эндомиокардиально из нескольких вколов животным вводился «Плацебо» - физиологический раствор. Животные также получали препарат «Иммурег» перорально в дозе 25 мг на 1 кг живого веса 3 раза в течение суток до оперативного вмешательства.
4-я группа (30 животных) - группа сочетанного применения «Аллопланта» и «Им-мурега». Этой группе животных по границе очага инфаркта миокарда эндомиокардиально из нескольких вколов вводили прерарат «Ал-лоплант - стимулятор васкулогенеза». Дополнительно животные получали «Иммурег» по вышеуказанной схеме.
Все животные находились в одинаковых условиях содержания и получали стандартный корм.
Животные из эксперимента выводились путем передозировки ардуана на 7, 14, 30, 45 и 60-е сутки.
Суммарная РНК выделялась из сердечной ткани с использованием Trizol reagent (Invitrogen) и RNeasy Mini kit (Qiagen). кДНК получали из 3-5 мкг суммарной РНК реакцией обратной транскрипции с использованием праймера oligo(dT)12-18 (Invitrogen, США) и обратной транскриптазы (MBI Fermentas, США). Оценку экспрессии генов actine, fgf2,
hgf, igf-1 и vegfa в группах проводили методом количественной ОТ-ПЦР в реальном времени на приборе iCycler iQTM Real-Time PCR Detection System (BIO-RAD, США). Результаты и обсуждение Результаты анализа экспрессии генов факторов роста в кардиомиоцитах кроликов после локального введения препаратов «Им-мурег» и «Аллоплант-стимулятор васкулоге-неза» в условиях экспериментальной модели ишемии сердца представлены в нижеследующей таблице.
Таблица
Анализ экспрессии генов факторов роста после локального и перорального введений препаратов «Иммурег» и «Аллоплант-стимулятор васкулогенеза» в условиях экспериментальной
модели ишемии сердца
Группа Ген Эффективность Экспрессия
Ишемия actine REF 0,96 1,00
FGF2 TRG 0,97 1,01
HGF TRG 1,00 3,45
IGF-1 TRG 0,96 2,37
VEGF TRG 0,95 2,14
Иммурег actine REF 0,96 1,00
FGF2 TRG 0,97 1,27
HGF TRG 1,0 5,51
IGF-1 TRG 0,96 2,70
VEGF TRG 0,95 4,95
Аллоплант- стимулятор васкулогенеза actine REF 0,96 1,00
FGF2 TRG 0,97 1,31
HGF TRG 1,0 6,17
IGF-1 TRG 0,96 4,60
VEGF TRG 0,95 2,95
Иммурег + Аллоплант-стимулятор васкулогенеза actine REF 0,96 1,00
FGF2 TRG 0,97 1,98
HGF TRG 1,0 6,05
IGF-1 TRG 0,96 4,35
VEGF TRG 0,95 4,83
Контроль - уровень мРНК генов роста fgf2, vegf, hgf и igf кардиомиоцитов условно-здоровых кроликов.
REF - ген «домашнего хозяйства»
TRG - «гены-мишени»
В графе «экспрессия» представлены результаты относительного уровня мРНК генов, отражающего отношение к уровням мРНК в контрольной группе, принятого за единицу. В графе «эффективность» представлена эффективность ПЦР в режиме реального времени. Следует отметить, что эффективность ПЦР является необходимым критерием при количественной оценке экспрессии генов, выражающей процент совпадения наблюдаемого накопления амплификата с теоретическим, и рассчитывается с помощью построения стандартной кривой по логарифмам начальных концентраций и полученным пороговым циклам. В данном исследовании исключались праймеры, эффективность которых отличалась от контрольных более чем на 5% (95100%). Разница в эффективности ПЦР между
исследуемым геном и геном “домашнего хозяйства” может быть вызвана влиянием ингибиторов обратно-транскрипционной реакции и ингибиторов ПЦР, различиями в ходе выделения РНК, неспецифическим отжигом, контаминацией, плохо подобранными условиями ПЦР и рядом других факторов. Результаты ПЦР в режиме реального времени, где эффективность ПЦР исследуемого гена была выше, чем эффективность ПЦР гена “домашнего хозяйства”, из дальнейшего исследования были исключены.
Как видно из приведенной таблицы, в условиях индуцированной ишемии максимальный уровень экспрессии по сравнению с контролем (актин) наблюдается в генах HGF (3,45), ЮР-1 (2,37) и VEGF (2,14), в то время как для FGF2 была выявлена слабая индукция, сравнимая с контролем. В случае использования «Иммурега», «Аллопланта-стимулятора васкулогенеза» и их комбинации активация транскрипции гена FGF2 также имеет наиболее низкие значения по сравнению с остальными генами. Например, комбинация двух препаратов показала экспрессию FGF2, превышающую контрольный уровень (ишемия) на 96%, что существенно меньше, чем аналогичные показатели для других факторов. Сравнительные данные, показывающие относительное усиление экспрессии изучаемых генов по сравнению с контролем (ишемия), представлены на рисунке.
2 40 S | 2.20 H % E 2.00 S = 1 80 2
i ■ _ A
1
Z S 1.40 | « 1.20 -
I
♦
FGF2 HGF IGF-1 VEGF
А иммурег + аллоплант ■ аллоплант + иммурег
Рис. Сравнительные данные по индуцированной экспрессии факторов роста
Как видно из представленного рисунка, наибольшим эффектом, более чем в два раза превышающим контроль, обладают «Имму-рег» и его комбинация с «Аллоплантом-стимулятором васкулогенеза» по отношению к экспрессии VEGF. В условиях монотерапии с применением «Аллопланта-стимулятора васкулогенеза» этот показатель составил 1,38, что сравнимо с контрольным образцом. Таким образом, можно предположить, что высокая экспрессия VEGF обусловлена исключительно антиоксидантной активностью «Иммуре-га» с учетом того, что лекарственная комби-
нация показала близкое к нему значение усиления — 2,31 раза для «Иммурега» и в 2,26 раза для смеси. Уровень экспрессии гена VEGF, индуцируемый «Иммурегом», превысил контрольный на 131%.
Полярная картина наблюдается в случае экспрессии гена IGF-1. Так, «Аллоплант-стимулятор васкулогенеза» и его комбинация с «Иммурегом» показали близкие значения усиления, почти в два раза превышающие контрольные показания — 1,94 для «Алло-планта-стимулятора васкулогенеза» и 1,84 для смеси. В условиях монотерапии с применением «Иммурега» этот показатель составил всего 1,14, что статистически не превосходит контрольные показания. Как и в предыдущем случае можно предположить, что усиление экспрессии гена IGF-1 в первую очередь связано с активностью именно «Аллопланта-стимулятора васкулогенеза».
В случае экспрессии ростового фактора HGF высокую активность показали оба препарата, а также их смесь. Для «Аллопланта-стимулятора васкулогенеза» было выявлено усиление экспрессии, более чем в полтора раза превышающее контрольные показания (1,79). Для «Иммурега» и лекарственной комбинации были получены близкие результаты — 1,60 и 1,75 соответственно. На основании полученных данных трудно судить об относительном вкладе отдельных препаратов в общий терапевтический эффект, поскольку для всех субстанций были получены близкие значения активности.
Иные результаты были получены для FGF2. Так, наибольшую активность показал именно комбинированный препарат, способный почти в два раза усиливать экспрессию целевого гена, в то время как в условиях монотерапии «Иммурег» и «Аллоплант-стимулятор васкулогенеза» показали более низкие значения — 1,26 и 1,30 соответственно. Эти результаты свидетельствуют о синергическом эффекте именно смесевой композиции, по сравнению с отдельным компонентом как в случае VEGF и IGF-1.
На основании полученных данных
можно предположить, что использование комбинированного препарата синергического действия эффективно исключительно в случае экспрессии гена FGF2. При экспрессии VEGF и IGF-1 усиление индукции связано, скорее всего, с отдельным соединением, в то время как установить вклад исследуемых препаратов на экспрессию HGF невозможно. Несмотря на это, целесообразно применение именно комбинации «Аллопланта-стимулятора васку-логенеза» и «Иммурега», поскольку интегральный эффект на экспрессию указанных факторов в этом случае наиболее высокий, средний показатель по всем белкам составил 1,95, что на 22% больше, чем для «Аллоплан-та-стимулятора васкулогенеза» и «Иммурега» по отдельности. Также на основании полученных данных можно предположить субстратную специфичность «Аллопланта-стимулятора васкулогенеза» по отношению к факторам роста, наибольшим сродством обладают HGF и IGF-1, что может быть объяснено различной аффинностью GAGs в составе «Аллоплант-стимулятор васкулогенеза» к исследуемым белкам.
Выводы
1. Препарат «Иммурег» на фоне необратимой ишемии миокарда в эксперименте способствует достоверному увеличению уровня экспрессии гена fgf2 на 26%, гена hgf на 60%, гена vegfa на 131%.
2. 24-часовое действие «Аллопланта» на фоне экспериментальной модели ишемии сердца вызывает почти двукратное увеличение экспрессии генов hgf и igf-1 (p=0,002 и p=0,001), а также небольшое увеличение в уровне экспрессии генов fgf2 и vegfa в кар-диомиоцитах по сравнению с уровнем экспрессии этих генов в условиях моделирования ишемии сердца без препарата.
3. Совместное 24часовое администрирование «Иммурега» и «Аллопланта-стимулятора васкулогенеза» на фоне экспериментальной модели ишемии сердца индуцирует экспрессию гена hgf на 505% (р=0,001), гена igf-1rn 336% (р<0,001), гена vegfa на 383% (р=0,001).
Сведения об авторах статьи:
Плечев Владимир Вячеславович - д.м.н., профессор, зав. кафедрой госпитальной хирургии ГБОУ ВПО БГМУ Мин-здравсоцразвития России. Адрес: 450000, г. Уфа, Ленина, 3.
Олейник Богдан Александрович - к.м.н., доцент кафедры госпитальной хирургии ГБОУ ВПО БГМУ Минздравсоцразви-тия России. Адрес: 450000, г. Уфа, Ленина, 3.
Рисберг Роман Юрьевич - аспирант кафедры госпитальной хирургии ГБОУ ВПО БГМУ Минздравсоцразвития России. Адрес: 450000, г. Уфа, Ленина, 3.
Плечева Дина Владимировна - к.м.н, доцент кафедры госпитальной хирургии ГБОУ ВПО БГМУ Минздравсоцразвития России. Адрес: 450000, г. Уфа, Ленина, 3.
ЛИТЕРАТУРА
1. Потапов, И.В. Клеточная кардиомиопластика (аналитический обзор) / И.В. Потапов, H.A. Онищенко, М.Е. Крашенинников // Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2001. - №2. - С. 46-53.
2. Репин, B.C. Трансплантация клеток: новые реальности в медицине. // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 1998. - Т. 126 (прилож. 1). -С.14-28.
3. Шевченко, Ю.Л. Медико-биологические и физиологические основы клеточных технологий в сердечно-сосудистой хирургии. -СПб.: «Наука», 2006. - 288с.
4. Aceves J.L., Archundia A., Diaz G. et al. Stem cell perspectives in myocardial infarctions // Rev Invest Clin. 2005. - Vol.57, №2. - P.156-162.
5. Krausgrill B., Schwinger R.H., Muller-Ehmsen J. Mesenchymal stem cells for cardiac regeneration // Med Klin (Munich). 2006. - Vol. 101, №>22 (Suppl 1). -P.202-206.
6. Piao H., Youn T.J., Kwon J.S. et al. Effects of bone marrow derived mesenchymal stem cells transplantation in acutely infarcting myocardium // Eur J Heart Fail. 2005. - №7. - P.730-738.
