CC BY
150
Эффект одновременной экспрессии различных изоформ фактора роста эндотелия сосудов VEGF и основного фактора роста фибробластов FGF2 на пролиферацию эндотелиальных клеток пупочной вены человека HUVEC
И.И. Салафутдинов 1, А.К. Шафигуллина 2, М.Э. Ялвач 3, Н.В. Кудряшова 1, МА.Лагарькова 4 5, М.В. Шутова4 5, СЛ. Киселев 4, Р.Ф. Масгутов 12 Р.И. Жданов Ь3-Б, А.П. Киясов 2 PP. Исламов 2 А А. Ризванов 1аз
1 Казанский [Приволжский) федеральный университет, Казань
2 Казанский государственный медицинский университет, Казань
3 Университет Едитепе, Стамбул, Турция
4 Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, Москва
5 ООО «Лаборатория клеточных технологий», Москва
6 НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН, Москва
Effect of simultaneous expression of various usoforms of vascular endothelial growth factor VEGF and fibroblast growth factor FGF2 on proliferation of human umbilical cord blood cells HUVEC
I.I. Salafutdinov \ A.K. Shaflgullina 2, ME. Yalvac 3, N.V. Kudryashova \ M.A. Lagarkova 4 S, M.V. Shutova 4 S, S.L. Klselev4, R.F. Masgutov 1-3, R.I. Zhdanov1ае, A.P. Klyasov 2, R.R. Islamov 2, AA. Rizvanov 1-3-3
1 Kazan Federal University, Kazan
2 Kazan State Medical University, Kazan
3 Yedltepe University, Istanbul, Turkey
4 Vavllov Institute of General Genetics RAS, Moscow
5 <(LKT» Ltd., Moscow
6 Institute of general pathology and pathophysiology RAMS, Moscow
Трансплантацию стволовых, прогениторных и дифференцированных клеток активно исследуют как способ коррекции дегенеративных заболеваний. Однако механизм терапевтического действия клеточной терапии остаётся не изученным. В настоящее время все большую популярность приобретает теория стимуляции процессов регенерации за счет секреции трансплантированными клетками различных ростовых и трофических факторов. Генная модификация клеток перед трансплантацией позволяет обеспечить эффективную экспрессию и адресную доставку разных терапевтических факторов. Применение плазмидных экспрессионных векторов считают одним из биологически безопасных и перспективных подходов генной модификации клеток. В ходе нашей работы были созданы генетические конструкции на основе двухкассетной плазми-ды pBudCE4.1, кодирующие комбинации различных изоформ фактора роста эндотелия сосудов (VEGF] и основного фактора роста фибробластов (FGF2) человека. Экспрессия рекомбинан-тных генов подтверждена методами иммуноблотинга и имму-ноцитохимии. Показано, что генная модификация модельной клеточной культуры НЕК293 полученными плазмидами привела к повышенной паракринной стимуляции пролиферации эндотелиальных клеток пупочной вены человека HUVEC in vitro.
Ключевые слова: зкспрессионные плазмиды, фактор роста эндотелия сосудов VEGF, основной фактор роста фибробластов FGF2, ангиогенез, трансфекция, эндотелиальные клетки пупочной вены человека, HUVEC.
Transplantation of stem cells, progenitor and differentiated cells is currently actively investigated as an approach for correcting degenerative diseases. However the mechanisms of therapeutic effect of cell therapy remains poorly understood. Nowadays a theory of paracrine stimulation of regeneration processes by transplanted cells through secretion of trophic and growth factors gains a particular popularity. Genetic modification of cells prior to transplantation allows efficient expression and targeted delivery of various therapeutic factors. The use of plasmid expression vectors are considered to be one of the safest and promising approaches for genetic modification of cells. We report generation of genetic constructs based on expression plasmid pBudCE4.1 (containing two independent expression cassettes) encoding different isoforms of human vascular endothelial growth factor (VEGF) and basic fibroblast growth factor (FGF2). Expression of recombinant proteins was confirmed by immunoblotting and immunochistochemistry. We demonstrated that genetic modification of model cell line HEK293 by our expression plasmids resulted in paracrine stimulation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) proliferation in vitro.
Keywords: expression plasmids, vascular endothelial growth factor VEGF, fibroblast growth factor FGF2, angiogenesis, transfection, human umbilical cord blood cells HUVEC.
Формирование, рост и ветвление кровеносных сосудов — сложный скоординированный в пространстве и во времени процесс васкулогенеза в пренатальном и ангиогенеза в постнатальном периоде развития. Наи-
e-mail: rizvanov@gmail.com
более активно формирование сосудов происходит в период эмбрионального развития, а во взрослом организме ангиогенез ограничен компенсаторными и ре-генерационными процессами. Кроме того, ангиогенез
+
играет важную роль в патогенезе злокачественных новообразований.
В процесс образования функциональных сосудов вовлечено большое число факторов, многие из которых в настоящее время подробно исследованы [1 ]. Во всех патологических или физиологических процессах основным индуктором ангиогенеза служит кислородное голодание ткани (гипоксия), в результате которого происходит секреция HIF-1 (hypoxia-inducible factor-1; индуцируемый гипоксией фактор-1) [2, 3].
В свою очередь HIF-1 стимулирует экспрессию целого ряда факторов, обеспечивающих адаптацию клеток к гипоксии [4], однако ключевой транскрипционной мишенью для него выступает фактор роста эндотелия сосудов (vascular endothelial growth factor, VEGF) и его рецепторы [5]. VEGF был первоначально описан как сосудистый фактор проницаемости (vascular permeability factor, VPF) [6], который, как было показано впоследствии, проявляет специфическую митогенную активность в отношении эндотелиальных клеток [7]. Семейство VEGF включает VEGF-A (ранее просто VEGF), VEGF-B, VEGF-С, VEGF-D, VEGF-E и плацентарный фактор роста (placental growth factor, PIGF) [8]. VEGF-A, главным образом, участвует в ангиогенезе. VEGF-C и VEGF-D вовлечены в процесс формирования лимфатических сосудов. Ангиогенное действие VEGF происходит через эндотелиальную форму синтазы оксида азота (nitric oxide, NO). VEGF стимулирует активность этого фермента и, следовательно, образование оксида азота. Ген VEGF-A человека расположен в хромосомном локусе 6р21.3. Кодирующая область охватывает около 14 т.п.н. и включает в себя 8 экзонов [9,10]. Альтернативный сплайсинг экзонов 6 и 7 общей пре-мРНК может давать начало 11 изоформам (VEGF121 121Ь 145 148 1В2 1В2Ь
185, 185Ь. 183, 189 И 208} ■ 8 Т0 ВР6МЯ КЗК ВСе ТрЭНСКрИПТЫ
гена vegf содержат экзоны 1—5 и 8 [10]. Вышеперечисленные изоформы отличаются по внеклеточной локализации и биологическим свойствам [11]. Большинство клеток, продуцирующих VEGF-A, предпочтительно экспрессируют изоформы VEGF121, VEGF1BS и VEGF18g. VEGF121 — это слабокислый белок, который в результате отсутствия гепарин связывающих доменов и низкого сродства к внеклеточному матриксу значительно легче диффундирует в межклеточном пространстве, в сравнении с другими изоформами [12]. VEGF1BS — изо-форма, преобладающая в большинстве тканей; она представляет собой более основной белок, чем VEGF121. Белок VEGF1BS способен связывать гепарин, однако большая его часть свободно секретируется в межклеточный матрикс. VEGF18g — выраженный основной белок; после секреции он остается ассоциированным с клеткой, легко связывается с внеклеточным матриксом и гепарином, может выделяться в растворимой форме (VEGF110) с гепарином, гепариназой или плазмином [13].
Фактор роста фибробластов 2 (FGF2) — представитель большого семейства полипептидных факторов роста. У позвоночных молекулярная масса 22 членов FGF семейства варьирует в диапазоне от 17 до 34 kDa при 13—71% гомологии аминокислотных последовательностей. Впервые FGF2 был обнаружен в гипофи-зарных экстрактах и описан Н. Armelin в 1973 г. [14]. Представители семейства FGF демонстрируют высокое сродство к гепарин сульфат протеогликанам и необходимы гепаран сульфатам для активации одного из четырех FGF рецепторов в клеточной мембране. Во время эмбрионального развития FGF участвуют в регуляции пролиферации, миграции и дифференцировки
разных клеточных типов [15]. Во взрослом организме служит гомеостатическим фактором и участвует в тканевой регенерации и ангиогенезе, выполняя роль митогена, стимулирующего пролиферацию эндотелиальных клеток, и неспецифического стимулятора формирования сосудов [16].
Описаны 5 изоформ №¥2 с молекулярными массами 18, 22, 22.5, 24, и 34 кЛа, получаемыми в результате альтернативного сплайсинга общего предшественника мРНК [17]. Для высокомолекулярных изоформ (22, 22.5, 24, и 34 кОа) характерно наличие специфических аминокислотных последовательностей, отвечающих за транслокацию в ядро клетки, в то время как низкомолекулярная изоформа лишена секреторной последовательности. Механизм секреции низкомолекулярной изоформы №¥2 во внеклеточное пространство на данный момент исследован недостаточно [18].
В настоящее время молекулы УЕОР и РОР активно применяют для индукции ангиогенеза в терапевтических целях [19, 20]. Стратегия терапевтического ангиогенеза предполагает применение рекомбинантных белков факторов роста или их генов для улучшения реваскуляризации ишемизированных тканей. В тоже время известно, что стимулирование одиночными ан-гиогеными молекулами недостаточно для развития функциональных сосудов [21]. Вследствие этого, применение комбинированной экспрессии рекомбинантных и №¥2 представляет собой более эффективный подход для стимулирования развития сосудистого русла за счет выраженного синергетического эффекта между и на эндотелиальные клетки, при-
водящего к формированию сосудов, демонстрирующих высокую морфофункциональную целостность и не регрессирующих после прекращения стимуляции [22, 23]
К настоящему времени рассматривается стратегия, основанная на применении различных клеточных дериватов для доставки терапевтических проангиогенных, нейротрофических, антиапоптотических генов в очаги дегенерации. Наиболее перспективными в этом отношении могут выступать мультипатентные мезенхималь-ные стволовые клетки (ММСК), которые способны давать начало специализированным клеткам разных тканей. Генетически модифицированные ММСК, полученные из различных источников (костный мозг, клетки пуповинной крови, жировая ткань, и ряд других), трансдуцированные /трансформированные плазмидны-ми или вирусными конструкциями способны повышать уровень экспрессии терапевтических генов в десятки раз, тем самым значительно усилить терапевтический эффект трансплантированных клеток и регенераторный потенциал органа-мишени. Так, например, трансплантация клеток пуповинной крови, трансфецирован-ных человеческим геном активирует ангиогенез
в тканях при моделировании хронической ишемии конечностей у крыс [24] и инфаркта миокарда у мышей [25]. Аналогичные результаты получены при использовании модифицированных стволовых клеток, полученных из жировой ткани [26].
Материал и методы
Создание экспрессионных плазмидных
векторов
Специфические праймеры для ПЦР амплификации полных открытых рамок считывания генов I/ед/7 и fgf2 созданы на основе нуклеотидных последовательностей, полученных из базы данных бепВапк [27] (табл.).
5- и 3'- концы праймеров содержат адаптерные участки с уникальными сайтами рестрикции для Крп\ и Xho\, по которым проводили клонирование генов в экспрес-сионный плазмидный вектор pcDNA 3.1 + (Invitrogen). Клонирование изоформ vegf121 и vegf189 проводили с помощью ОТ-ПЦР амплификации. В качестве матрицы использовали РНК, выделенную из клеток Raja (клетки линии африканской лимфомы Бёркитта) коммерческого приготовления (Applied Biosystems). Матрицей для ПЦР-амплификации генов vegf165, fgf2 и egfp служили плазмиды pCMV-VEGF165, pBK-CMV-FGF2 и pEGFP-N2. В результате клонирования в плаз-миду pcDNA 3.1 + стали доступны дополнительные
уникальные сайты рестрикции Hind III и Xba\, фланкирующие вставочные фрагменты.
Ко-экспрессирующие векторы собраны на основе pBudCE4.1 (Invitrogen) субклонированием генов egfp или fgf2 под контролем промотора CMV по сайтам рестрикции Hind\\\ и XbaI и изоформы vegf121, vegf165, vegf189 или egfp под контролем промотора EF-1— по сайтам рестрикции Крп\ и Xho\. Конечное подтверждение получения экспрессионных плазмид pBud-VEGF-FGF2 провели методом ДНК-секвенирования с помощью стандартных вектор-специфических праймеров на автоматическом секвенаторе ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
Нуклеотидные последовательности праймеров для ПЦР амплификации генов
Название праймера Нуклеотидная последовательность
EGFP-F-Kpnl TCGgtACCATGGTGAGCAAGGGCGAG
EGFP-R-Stop-Xhol GTctcgaGttaTTGTACAGCTCGTCCATGCC
FGF2-F- Kpnl GCGGtAccaTGGTGGGTGTCGGG
FGF2-R-Stop-Xhol CAcTcgAGTCAGCTCTTAGCAGACATTGGAAG
VEGF16S-F- Kpnl CCGgtACCATGAACTTTCTGCTGTCTTGGG
VEGF16S- R-Stop-Xhol TGCtCGAGTCACCGCCTCGGCTTGTC
VEGF16SF1 GGGCCGGGGAGGAAGAGTAGC
VEGF16SR1 GTGGTGGCGGCAGCGTGGTT
Культивирование эукариотических клеток
Клетки линии НЕК293Т культивировали на среде DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Invitrogen) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки FBS (ПанЭко, Москва), 100 ЕД/мл пенициллина — 100 мкг/мл стрептомицина (ПанЗко, Москва). Первичную культуру эндотелиальных клеток пупочной вены человека (Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC) поддерживали на среде DMEM/F12 (HyClone) с добавлением 15% фетальной телячьей сыворотки (HyClone), 1% смесь аминокислот (Invitrogen) пенициллин/стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл), рекомбинантный bFGF (5 нг/мл) (Chemicon), EGF (20 нг/мл) (Chemicon), VEGF от 10 нг/мл (Chemicon), IGF (10 нг/мл) (Chemicon), гидрокортизон 1мкМ, гепарин 5 ед/мл. Клетки инкубировали в инкубаторе при 37°С, во влажной атмосфере, содержащей 5% С02. Пассирование клеток и замену питательной среды проводили согласно стандартным протоколам.
Трансфекцию клеток НЕК293Т плазмидной ДНК проводили с помощью реагента TurboFect согласно рекомендациям фирмы-производителя (Fermentas). Эффективность трансфекции определяли по количеству EGFP позитивных клеток методом флуоресцентной микроскопии. Культуральную среду клеток, трансфецированных экспрессионными плазмидами, собирали через 24, 48 и 72 ч после трансфекции, объединяли и очищали от остаточного клеточного материала центрифугированием и фильтрованием через 0,45 мкм фильтр.
Иммуноцитохимический анализ
Клетки НЕК293Т высевали на 24-луночные культу-ральные планшеты и трансфецировали согласно описанной выше методике. Трансфецированные культуры фиксировали в 4% растворе параформальдегида и
блокировали 5% бычьим альбумином (Sigma). Клетки инкубировали с первичными гуманизированными анти-VEGF антителами (авастин) в разведении 1:50 и вторичными анти-lgG человека антителами, конъюги-рованными с флуоресцентной меткой Alexa-488 в разведении 1:1000 (Invitrogen). Анализ окрашенных препаратов проводили на инвертированном флуоресцентном микроскопе Axiovert 200 с компьютерной системой фотодокументации (Carl Zeiss).
Вестерн блоттинг
Клетки НЕК293Т, трансфецированные экспрессионными плазмидами, ресуспензировали в буфере для нанесения проб, наносили на 15% полиакриламидный SDS-PAGE гель и проводили электрофорез по методу Лаэмли [28]. Белки переносили на PVDF мембрану (BioRad) и блокировали 5% раствором обезжиренного молока в фосфатно-солевом буфере с добавлением детергента Tween 20. Мембрану инкубировали 1 ч с первичными моноклональными an™-FGF2 антителами (Sigma) в разведении 1:2000 и вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена в разведении 1:5000 (Sigma). Анализ проводили с помощью набора DAB Substrate Kit (Vector).
Анализ пролиферации эндотелиальных клеток
in vitro
Культуральную среду после инкубации с трансфеци-рованными клетками НЕК293Т наносили на клетки HUVEC в различных разведениях (30, 3, 0,3% конечная концентрация) со средой DMEM с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки FBS и пенстрепа без факторов роста. Пролиферативный потенциал оценивали с помощью МТТ теста согласно протоколу фирмы-производителя (Promega).
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, 1У< 2, 2010
11111
Оригинальные исследовани
Результаты и обсуждение
В результате ПЦР амплификации и последующих этапов клонирования получены следующие двухкассетные экспрессионные плазмидные вектора: рВис1-\ZEGF1 21-ЕСРР, рВис1-\/ЕСР1 65-ЕСРР, рВис1-УЕСР1 89-ЕСРР, рВис1-УЕСР121-РСР2, рВис1-УЕСР165-РСР2 [рис. 1), рВисП/ЕСР189-РСР2, рВис1-ЕСРР-РСР2, рВис1-ЕСРР.
рис оп
ВСН
VS Н^
рВиЬСЕ4.1 5.0 кЬ
VEGF„
РйР 2
туе Н¡sS
SV40 рА
Рис. 1. Схема двухкассетного плазмидного вектора, одновременно и независимо экспрессирующего молекулы основного фактора роста фибробластов [ЯЗЯ 2] и фактор роста эндотелия сосудов (\ZEGF,}
Правильность получения рекомбинантных плазмид подтверждена рестрикционным анализом и автоматическим секвенированием (информация не приведена). Преимущество обусловлено его способностью одновременно и независимо экспрессировать рекомбинантные гены под контролем двух сильных конституционно активных промоторов СМ\/ и ЕР-1 —. Это позволяет повысить эффективность доставки, гарантировать одновременную экспрессию в кпетках-мишенях двух рекомбинантных генов.
Для подтверждения экспрессии рекомбинантных генов полученными двухкассетными плазмидами мы провели трансфекцию клеток НЕК293Т с помощью коммерчески доступного препарата ТгапэРаэ^ Экспрессию репотёрного белка ЕСРР оценивали с помощью флуоресцентной микроскопии. Трансфекция всех генетических конструкций, содержащих ген egfp, приводила к зелёной флуоресценции генетически модифицированных клеток (информация не приведена). Экспрессию изоформ \ZEGF подтвердили иммуноцитохимическим анализом. Показано, что клетки НЕК293Т, трансфеци-рованные двухкассетными плазмидами, содержащими гены различных изоформ уед^ специфично реагируют с анти-\/ЕСР антителами (рис. 2). Экспрессию рекомбинантного РСР2 подтвердили методом иммуно-блотинга. Анализ лизатов клеток НЕК293Т, трансфеци-рованных двухкассетными плазмидами, содержащими рекомбинантный ген fgf2, показал наличие специфичной белковой полосы на мембране с приблизительной молекулярной массой 18кОа, что соответствует ожидаемому размеру рекомбинантного РСР2 (см. рис. 3). Таким образом, с применением микроскопии и иммунологических методов показано, что все созданные двухкассетные плазмидные векторы экспрессируют соответствующие рекомбинантные гены.
Рис, 2. Иммуноцитохимический анализ экспрессии изоформ \ZEGF в клетках НЕК293Т, трансфецированных двухкассетными плазмидами на основе pBudCE4.1i панель А - pBud^VEGF121^FGF2; Б - pBud^VEGF165^FGF2; В — рВис1-\/ЕВР189-РвР2; Г — контроль, не трансфецированные клетки. Ув. хЮО
Рис. 3. Вестерн блоттинг анализ экспрессии ЯЗР2 в лизатах клеток НЕК293Т, трансфецированных двухкассетными плазмидами на основе pBudCE4.1i 1 - pBud^VEGF121^FGF2; 2 - pBud^VEGF165^FGF2; 3 - pBud^VEGF189^FGF2; 4 - pBud^EGFP^FGF2; 5 - контроль, pBud^EGFP
В настоящее время особое внимание уделяют применению комбинированной генно-клеточной терапии для лечения различных заболеваний человека. Подобный подход основан на применении клеток, генетически модифицированных для экспрессии терапевтических факторов. Трансплантированные клетки, в первую очередь стволовые, полученные из различных источников, способны мигрировать в очаги дегенерации и участвовать в процессах регенерации [29, 30]. Несмотря на то, что показано участие трансплантированных клеток в замещении гибнущих клеток организма реципиента [31], большую популярность приобретает теория па-ракринной стимуляции выживаемости клеток и процессов регенерации под действием трансплантируемых стволовых клеток, секретирующих ростовые и трофические факторы [32, 33].
Более того, способность стволовых клеток мигрировать в области дегенерации делает их привлекательными «биологическими реакторами» для адресной доставки терапевтических факторов. Таким образом, генетическая модификация стволовых клеток терапевтическими генами позволит существенно повысить эффективность лечения дегенеративных заболеваний.
Для исследования эффективности паракринной стимуляции ангиогенеза с помощью клеток, генетически модифицированных двухкассетными плазмидами, экспрессирующими разные изоформы VEGF и FGF2, мы применили in vitro модель пролиферации эндоте-лиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC). Для этого мы нанесли культуральную среду клеток НЕК293Т, трансфецированных полученными двухкассетными плазмидами, на клетки HUVEC. При этом скорость пролиферации клеток HUVEC отражала стимулирующее действие растворимых факторов, попавших в среду в результате нормальной жизнедеятельности клеток, а также в результате экспрессии секретируе-мых рекомбинантных белков. Показано, что генетическая модификация двумя терапевтическими генами (различные изоформы VEGF и FGF2) значительно повышает пролиферацию HUVEC по сравнению с экспрессией одиночных ангиогенных факторов (рис. 4). Специфичность биологического эффекта культуральной среды трансфецированных клеток НЕК293Т на пролиферацию HUVEC подтверждена экспериментом по серийному разведению среды. Показано, что уменьшение доли культуральной среды НЕК293Т приводило к снижению пролиферации клеток HUVEC (рис. 5).
Таким образом, в ходе выполнения работы получены экспрессионные плазмидные векторы на основе плазмиды pBudCE4.1, кодирующие комбинации различных изоформ VEGF и FGF2 человека. Показано, что трансфекция культуры клеток НЕК293 полученными плазмидами приводит к секреции рекомбинантных белков в культуральную среду, которая усиливает пролиферацию клеток HUVEC по сравнению с культуральной средой клеток, трансфецированных плазмидами, не содержащими ангиогенные гены, или содержащими лишь один из генов.
0,025
0,02
0,015
0,01
0,005
г<Г О'
«N
4 о* ^ ,/
Рис. 4. Пролиферация клеток HUVEC in vitro при добавлении культуральной среды, собранной с клеток НЕК293Т, трансфецированных различными плазмидами, с помощью МТТ-теста. Среду добавляли в 30% разведении [п=3]. В качестве отрицательного контроля применяли культуральную среду нетрансфицированных клеток НЕК293Т [NTC}. Оптическую плотность определяли при длине волы 570 нм
3D % среды НЕК293Т
3 % среды НЕК293Т
D.3 % среды НЕК293Т
VEGF121-FGF2 VEGF16S-FGF2 VEGF189-FGF2
Рис. 5. Дозазависимое влияние культуральной среды, собранной с клеток НЕК293Т, трансфецированных различными плазмидами, на пролиферацию клеток HUVEC in vitro с помощью МТТ-теста. Среду добавляли в 30,3 и 0,3% разведении [п = 3). В качестве отрицательного контроля применяли культуральную среду нетрансфецированных клеток НЕК293Т [NTC}. Оптическую плотность определяли при длине волы 570 нм
Благодарности
Работа частично финансировалась грантами Российского Фонда Фундаментальных Исследований, государственным контрактом ФЦП Федерального Агентства по Науке и Инновациям 02.740.11.0302, и Дополнительным заказ-нарядом (ДЗН) Министерства образования и науки РФ. Работа A.A. Ризванова также финансировалась реинтеграционным грантом НАТО NR.RIG.983007. Работа частично выполнена на оборудовании Регионального центра коллективного пользования физико-химических исследований веществ и материалов (РЦКП ФХИ) Казанского государственного университета.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Folkman J. Tumour angiogenesis: therapeutic implications. N. Engl. J. Med. 1971; 285: 1182-6.
2. Gradin K., McGuire J., Wenger R.H. et al. Functional interference between hypoxia and dioxin signal transduction pathways: competition for recruitment of the ARNT transcription factor. Mol. Cell. Biol. 1996; 16: 5221-31.
3. Huang L.E., Arany Z., Livingston D.M. et al. Activation of hypoxia-inducible transcription factor depends primarily upon redox-sensitive stabilization of its -subunit. J. Biol. Chem. 1996; 271: 32253-59.
4. Kuwabara K., Ogawa S., Matsumoto M. Hypoxia mediated induction of acidic basic fibroblast growth factor and platlet-derived growth factor in mono nuclear phagocytes stimulates growth of hypoxic endothelial cells. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1995; 92: 4606-10.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, hl< 2, 2010
5. Forsythe J.A., Jiang B.H., Iyer N.V. et al. Activation of vascular endothelial growth factor gene transcription by hypoxia-inducible factor 1. Mol. Cell. Biology. 1996; 16: 4604-13.
6. Dvorak H.F., Dvorak A.M., Manseau E.J. et al. Fibrin gel investment associated with line 1 and 1D solid tumor growth, angiogenesis, and fibroplasia in guinea pigs. Role of cellular immunity, myofibroblasts, microvascular damage, and infarction in line 1 tumor regression. J. Natl. Cancer Inst. 1979; 62: 1459-72.
7. Ferrara N., Houck K., Jakeman L. et al. Molecular and biological properties of the vascular endothelial growth factor family of proteins. Endocr. Rev. 1992; 13: 18-32.
8. Ferrara N., Gerber H.P, LeCouter J. The biology of VEGF and its receptors. Nature Medicine 2DD3; 6: 669-76.
9. Robinson J.C. The splice variants of vascular endothelial growth factor [VEGF] and their receptors. J. of Cell Science 2DD1; 5: 853—65.
10. Yamazaki Y. Molecular and functional diversity of vascular endothelial growth factors. Mol. Div. 2DD6; 10: 515-27.
11. Yoo P.S. Post-transcriptional regulation of vascular endothelial growth factor: Implications for tumor angiogenesis. World J. Gastroenterol. 2DD6; 12: 4937-42.
12. Bogaert E. Vascular endothelial growth factor in amyotrophic lateral sclerosis and other neurodegenerative diseases. Muscle S. Nerve 2006; 34: 391-405.
13. Whittle C. Heterogeneous vascular endothelial growth factor [VEGF] isoform mRNA and receptor mRNA expression in human glomeruli, and the identification of VEGF148 mRNA, a novel truncated splice variant. Clinical Science 1999; 97: 303-12.
14. Armelin H.A. Pituitary Extracts and Steroid Hormones in the Control of 3T3 Cell Growth. PNAS 1973; 70: 2702-6.
15. Ornitz, D. M. and Itoh, N. Fibroblast growth factors. Genome Biology 2001; 2[3): 3001-12.
16. Schweigerer L., Neufeld G., Friedman J. Capillary endothelial cells express basic fibroblast growth factor, a mitogen that promotes their own growth. Nature 1987; 325: 257-259.
17. Van den Berghe L., Laurell H., Isabelle H. et al. FIF [Fibroblast Growth Factor-2 [FGF-21-lnteracting-Factor], a Nuclear Putatively Antiapoptotic Factor, interacts specifically with FGF. Mol. Endocrinol. 2000; 14 [111: 1709-24.
18. Bugler В., Amalric F., Prats H. Alternative initiation of translation determines cytoplasmic or nuclear localization of basic fibroblast growth factor. Mol. Cell. Biol. 1991; 11: 573-7.
19. Парфенова E.B., Ткачук В.А. Перспективы генной терапии сердечно-сосудистых заболеваний. Вопр. мед. хим. 2000; 46: 293-310.
20. Sabti H. Therapeutic angiogenesis in cardiovascular disease. J. of Cardiothoracic Surg. 2007; 2: 49-56.
21. Kano M.R., Morishita Y., Iwata C. et al. VEGF-A and FGF-2 synergistically promote neoangiogenesis through enhancement of endogenous PDGF-B- PDGFR beta signaling. J. Cell Sci. 2005; 118: 3759-68.
22. Ley C., Olsen M., Lund E. et al. Angiogenic synergy of bFGF and VEGF is antagonized by angiopoietin-2 in a modified in vivo Matrigel assay. Microvasc. Res. 2004; 68: 161-8.
23. Pepper M.S., Ferrarab N., Orcib L. et al. Potent synergism between vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor in the induction of angiogenesis in vitro. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992; 189[21: 824-31.
24. Ikeda Y., Fukuda N., Wada M. et al. Development of Angiogenic Cell and Gene Therapy by Transplantation of Umbilical Cord Blood with Vascular Endothelial Growth Factor Gene. Hypertens. Res. 2004; 27 [21: 119-128.
25. Chen H.K., Hung H.F., Shyu K.G. et al. Combined cord blood stem cells and gene therapy enhances angiogenesis and improves cardiac performance in mouse after acute myocardial infarction. Eur. J. Clin. Invest. 2005; 35: 677-86.
26. Lu F., Li J., Gao J. et al. Improvement of the Survival of Human Autologous Fat Transplantation by Using VEGF-Transfected Adipose-Derived Stem Cells Plastic and Reconstructive Surgery 2009; 124[5): 1437-46.
27. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank
28. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970; 227[52591: 680-5.
29. Onda T., Honmou 0., Harada K. et al. Therapeutic benefits by human mesenchymal stem cells [hMSCs] and Ang-1 gene-modified hMSCs after cerebral ischemia J. Cereb. Blood Flow Metab. 2008; 28[2): 329-40.
30. Rizvanov A.A., Kiyasov A.P., Gaziziov I.M., et al. Human umbilical cord blood cells transfected with VEGF, L1 CAM do not differentiate into neurons but transform into vascular endothelial cells and secrete neurotrophic factors to support neuro-genesis — a novel approach in stem cell therapy. Neurochemistry International. 2008; 53: 389—94.
31. Smadja D.M., Cornet A., Emmerich J. et al. Endothelial progenitor cells: characterization, in vitro expansion, and prospects for autologous cell therapy. Cell Biol. Toxicol. 2007; 23t41: 223-39.
32. Chen X., Li Y., Wang L. et al. Ischemic rat brain extracts induce human marrow stromal cell growth factor production. Neuropathology 2002; 22: 275-9.
33. Rophael J.A., Craf R.O., Palmer J.A. et al. Angiogenic Growth Factor Synergism in a Murine Tissue Engineering Model of Angiogenesis and Adipogenes. Am. J. Pathol. 2007; 171 [61: 2048-57.
Поступила 30.04.2010
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 2, 2010
