CC BY
12
УДК 543.544
НОВЫЕ СОРБЕНТЫ ДЛЯ ГИДРОФИЛЬНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ НА ОСНОВЕ СИЛИКАГЕЛЯ, КОВАЛЕНТНО МОДИФИЦИРОВАННОГО ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЕМ
А.С. Попов, Г.С. Максимов, А.Д. Смоленков, О.А. Шпигун, А.В. Чернобровкина*
(Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, химический факультет, кафедра аналитической химии; *e-mail: [email protected])
Получены новые неподвижные фазы на основе аминопропилсиликагеля, ковалент-но модифицированного полиэтиленгликолем с различным массовым соотношением матрицы и полимера. Хроматографические свойства сорбентов изучены с помощью теста Танака для гидрофильных неподвижных фаз (и на примере разделения модельных смесей сахаров, аминокислот и водорастворимых витаминов). Показано, что варьирование толщины слоя полиэтиленгликоля не только влияет на эффективность, но и позволяет управлять селективностью по полярным веществам в режиме гидрофильной хроматографии.
Ключевые слова: гидрофильная хроматография, синтез сорбентов, полиэтиленгликоль, сахара, аминокислоты, водорастворимые витамины.
Метод гидрофильной хроматографии (ГИХ), в настоящее время широко применяющийся для разделения полярных соединений, впервые был предложен в 1990 г. [1]. Как было установлено в том же году [2], выбор неподвижной фазы играет решающую роль в данном методе. В результате синтез новых сорбентов является востребованной и актуальной задачей [3].
Использование полимеров в синтезе новых сорбентов перспективно в целях получения неподвижных фаз для гидрофильной хроматографии, поскольку создание поверхностного полимерного функционального слоя может позволить экранировать матрицу сорбента и таким образом снизить ее влияние на удерживание аналитов. Такой подход даст возможность применять альтернативные традиционному силикагелю матрицы, превосходящие его по химической стабильности, но уступающие по гидрофильности.
Одним из подходящих полимеров для создания гидрофильного функционального слоя является полиэтиленгликоль (ПЭГ) - легко синтезируемый с заданной массой полимер с линейной архитектурой. Наличие в его структуре оксиэтиленовых групп, склонных к ди-поль-дипольным взаимодействиям и образованию водородных связей, а также гидрофобных этиленовых фрагментов обуславливает растворимость ПЭГ в воде и органических растворителях и применение модифицированных ПЭГ
сорбентов в режимах гидрофильной и обращен-но-фазовой (ОФ) ВЭЖХ.
Традиционно сорбенты, модифицированные ПЭГ, применяют в основном для проведения ОФ ВЭЖХ. Однако результаты работы [4], где изучали удерживание фенолокислот путем варьирования доли воды в составе подвижной фазы в диапазоне 0-100 об.% на различных кис-лородосодержащих неподвижных фазах (Discovery HS PEG, LiChrospher 100 DIOL, Luna HILIC и Purospher STAR) показали эффективность сорбентов, содержащих ПЭГ в функциональном слое, к разделению аналитов различной полярности. Рабочие границы режима гидрофильной хроматографии для колонки Discovery HS PEG составили до 20% водной доли в подвижной фазе. Впервые подход к разделению аналитов по их полярности на неподвижной фазе Discovery HS PEG, содержащей ПЭГ, был описан в [5] на примере разделения смеси фармацевтических субстанций (фенилэфрин, хлорфенамин, ацетамино-фен, 4-аминофенол и хлорацетанилид) в режиме ГИХ с использованием 10% 20 мМ фосфатного буферного раствора (pH 7,0) и 90% ацетонитри-ла в качестве подвижной фазы. В дальнейшем это способствовало разработке ряда подходов к определению фармацевтических субстанций на сорбентах, содержащих ПЭГ, в том числе парацетамола [6, 7], кофеина [6, 8], пропифеназона [9, 10], а также токсичного 4-аминофенола [4, 11-13],
встречающегося в виде примеси вследствие частого применения в многостадийном синтезе. Большинство работ посвящено применению колонок Discovery HS PEG в режиме ОФ ВЭЖХ [6-12], где отмечена экспрессность анализа капсул парацетамола [6] и высокая эффективность (85 000 тт/м) при разделении парацетамола, кофеина, пропифеназона и их сопутствующих примесей в составе таблеток Валетола (Valetol) [7]. В работе [13] описано получение монолитного сорбента на основе ПЭГ На колонке длиной всего 5,8 см с данным сорбентом авторы добились разделения 4-аминофе-нола, бензойной кислоты и 3-аминобензойной кислоты в режиме гидрофильной хроматографии при элюировании 10% 20 мМ аммонийно-формиатного буферного раствора (pH 3,08) и 90% ацетонитрила, скорости потока 0,5 мл/мин и масс-селективном детектировании.
Отдельную проблему может представлять стабильность получаемых неподвижных фаз. В работе [14] получен сорбент, содержащий ПЭГ, который позволил осуществить чувствительное определение йода в морской воде, предел количественного определения в присутствии посторонних анионов составил 30 мкг/л. Однако из-за адсорбционного модифицирования полиэтилен-гликолем срок эксплуатации такого сорбента не превышал двух недель. Переход к ковалентному модифицированию силикагеля полиэтиленглико-лем позволил увеличить срок службы сорбента до 2 месяцев [15], при этом порядок элюирования анионов сохранялся с незначительным увеличением предела определения до 43 мкг/л.
Целью работы являлось получение новых сорбентов путем ковалентного закрепления ПЭГ на поверхности 3-аминопропилсиликагеля с различным массовым соотношением матрицы и полимера, установление их хроматографиче-ских характеристик в режиме гидрофильной хроматографии, а также оценка влияния толщины функционального слоя полиэтиленгликоля на их хроматографические свойства на примере объектов теста Танака для гидрофильных неподвижных фаз и полярных веществ различных классов: сахаров, аминокислот и водорастворимых витаминов.
Экспериментальная часть
Приборы и материалы. В работе использовали .0-(+)-рибозу, .0-(+)-глюкозу, .0-(+)-фрукгозу, .0-(+)-лактозы моногидрат, .0-(+)-мальтозы моногидрат, .0-(+)-сахарозу, .0-(+)-ксилозу, рибофлавин, пиридоксина гидрохлорид, цианокобаламин, аскорбиновую кислоту, тиамин, аденозин, ура-
цил, теобромин, теофиллин, уридин, видараби-на моногидрат, 5-метилуридин, 2'-деоксиури-дин, ^^^триметилфенил-аммония хлорид, тозилат натрия (>98,0%, «TCI», Япония); D,L-фенилаланин, D^-пролин, AL-серин, L-изо-лейцин, L-лейцин, L-метионин, L-аспарагиновую кислоту, L-глутаминовую кислоту, L-гистидин, L-лизин, L-аргинин («х.ч.», «Serva», Германия); L-аспарагин, ß-аланин, глицин («х.ч.», «Merck», Германия); L-глутамин, L-валин («х.ч.», «Reanal», Венгрия); никотинамид, кислоту никотиновую (>99%, «Sigma-Aldrich», США); толуол («х.ч.», «Компонент-Реактив», Россия), ацето-нитрил («HPLCgradientgrade», «Panreac», Германия); кислоту уксусную ледяную (99,5%), кислоту ортофосфорную (85%), «х.ч.», хлорид калия, «ч.д.а.» («Panreac», Испания); этанол, «ч.д.а.», ацетат аммония, «ч.» («Лабтех», Россия); ацетон, «ч.д.а.», «ХимМед», Россия; 1,4-диоксан, «ч.д.а.», «Компонент-Реактив», Россия.
Для синтеза сорбентов использовали сили-кагель с привитыми аминопропильными радикалами Диасфер-110-Амин («БиоХиммак СТ», Россия) со сферическими частицами диаметром 5 мкм, N = 1,52; диглицидиловый эфир по-лиэтиленгликоля, средняя молекулярная масса 500 г/моль («Sigma-Aldrich», США).
Эксперименты проводили с помощью системы ВЭЖХ, состоящей из хроматографа «Dionex 3000» с двухканальным градиентным насосом, автоматической системой ввода пробы, термостатом колонки и спектрофотометрическим детектором. Для регистрации хроматограмм использовали персональный компьютер и программный пакет Chromeleon 7 («Thermo Fisher Scientific», США). Для определения сахаров применяли систему ВЭЖХ, состоящую из изократическо-го ВЭЖХ-насоса, шестиходового крана-дозатора и рефрактометрического детектора («Agilent Technologies», США). Регистрацию хромато-грамм осуществляли с помощью персонального компьютера и программного пакета ChemStation («Agilent Technologies», США).
Для проведения синтеза использовали следующее оборудование: термостат («Memmert», Германия), вакуумный насос серии «Laboport» («KNF Neuberger», Германия), механическую мешалку «Eurostar» («IKA-Werke», Германия). В работе использовали стальные колонки размером 100^3, заполнение которых осуществляли с помощью пневмонасоса «Knauer K-1900» («Knauer», Германия).
Синтез сорбентов и заполнение хромато-графических колонок. Навеску 1,2 г аминопро-пилсиликагеля помещали в круглодонную колбу
объемом 100 мл, добавляли 0,72 г диглицидило-вый эфир полиэтиленгликоля, растворенного в 20 мл деионизованной воды (для получения сорбента С-0,6ПЭГ с массовым соотношением матрицы и полимера, равным 1,0:0,6) или 0,12 г ПЭГ для получения сорбента С-0,1ПЭГ (обозначение соответствует массовому соотношению матрицы и полимера, равному 1,0:0,1). Суспензию непрерывно перемешивали в течение 60 мин механической мешалкой при температуре 60 °С. Продукт отфильтровывали на стеклянном фильтре и промывали 100 мл воды, а затем сушили на воздухе. Хроматографические колонки заполняли суспензионным способом при давлении 250 бар, используя в качестве подвижной фазы ацетонитрил.
Схема синтеза представлена на рис. 1. Вторая концевая эпоксидная группа диглицидилового эфира с большой вероятностью также закрепляется на поверхностных аминогруппах силикагеля, таким образом полимерные молекулы оборачивают сферические частицы аминопропилсиликагеля.
Результаты и их обсуждение
В настоящей работе получены две неподвижные фазы, синтезированные с различным массовым отношением матрицы и полимера, на основе 3-аминопропилсиликагеля, ковалентно модифицированного диглицидиловым эфиром ПЭГ. Количество ПЭГ варьировали в целях формирования оптимального функционального слоя на поверхности силикагеля, обеспечивающего изменение его селективности и высокую эффективность полученного сорбента. Изучение хроматографических характеристик новых сорбентов проводили с помощью теста Танака для гидрофильных неподвижных фаз [16, 17] и на примере разделения модельных смесей сахаров, аминокислот и водорастворимых витаминов в режиме гидрофильной хроматографии.
Результаты теста Танака. С целью создать систему, позволяющую выбирать наиболее подходящий материал колонки для определения конкретных аналитов, проводят хроматографическое описание химических свойств колонок разного типа, в ходе которого определяют селективность материала колонки к тем или иным функциональным группам, ионным взаимодействиям, структурным особенностям. Наиболее информационно емкой процедурой является тест Танака для гидрофильных фаз [16] как способ характеристики сорбентов с позиции их применимости для разделения различных групп веществ, позволяющий количественно определить их склонность к участию во взаимодействиях той или иной природы.
В рамках теста Танака количественно оцениваются следующие параметры: £(И) - фактор удерживания уридина, характеризует гидрофильность поверхности сорбента, а(СН2) - селективность по отношению к метиленовой группе, а(ОН) -селективность по отношению к гидроксильной группе, а(У/Л) - способность к разделению пространственных изомеров, а(ЛХ) - анионообмен-ные свойства, а(СХ) - катионообменные свойства, а(ТЬ/Тр) - кислотно-основные свойства. Результаты теста Танака для синтезированных неподвижных фаз приведены в табл. 1.
Из приведенных в табл. 1 данных видно, что в результате ковалентного модифицирования по-лиэтиленгликолем гидрофильность полученных сорбентов, оцениваемая фактором удерживания уридина £(И), увеличивается по сравнению с аминопропилсиликагелем, что свидетельствует об успешном модифицировании матрицы. Уменьшение параметра £(И) при увеличении количества ПЭГ на поверхности матрицы может быть вызвано экранированием заряженных атомов азота у поверхности матрицы большим количеством привитого ПЭГ. Таким образом, толщина слоя
Рис. 1. Схема синтеза и предполагаемые структуры сорбентов С-ПЭГ
Т а б л и ц а 1
Результаты теста Танака
Селективность Параметр Сорбент
Матрица С-0,1ПЭГ С-0,6ПЭГ
ад 1,94 2,88 2,44
a(CH2) 1,27 1,32 1,29
a(OH) 1,94 1,87 1,87
a(V/A) 1,23 1,37 1,39
a(AX) 2,98 20,23 18,09
a(CX) 1,12 0 0
a(Tb/Tp) 0,82 0,64 0,60
П р и м е ч а н и е. Элюент - 10% 20 мМ ацетатно-аммонийный буферный раствор (pH 4,7) / 90% ацетонитрил, скорость потока 0,5 мл/мин; УФ-детектирование, 254 нм.
модификатора может влиять на механизм удерживания и вклад различных типов взаимодействий, реализующихся на полученных сорбентах с разным соотношением матрицы и ПЭГ.
Для сорбентов и матрицы получены идентичные значения селективностей по отношению к метиленовым (а(СН2)) и гидроксильным группам (а(ОН)), отличные от единицы, прогнозирующие хорошую селективность по отношению к гомологам гидрофильной природы и не зависящие от толщины функционального слоя ПЭГ на поверхности неподвижной фазы. Стереоселективные свойства а(У/Л) полученных сорбентов также не зависят от количества ПЭГ и выражены лучше, чем в случае немодифицированной матрицы.
Оба сорбента продемонстрировали высокую избирательность к анионообменным взаимодействиям а(ЛХ) - на порядок выше таковой для матрицы, что является результатом доступности для анионного обмена замещенных атомов азота аминопропилсиликагеля, положительно заряженных в условиях эксплуатации. В то же время органический катион Н,Н,Н-триметилфениламмония (ТМФА), удерживаемый матрицей (а(СХ) = 1,12), элюируется на новых сорбентах с мертвым объемом (а(СХ) = 0). Полученные величины обоих параметров могут быть обусловлены кватерни-зацией атомов азота при модифицировании и полной пространственной недоступностью диссоциированных силанольных групп матрицы ввиду экранирования ПЭГ. Таким образом, отсутствие катионообменной селективности полученных сорбентов свидетельствует об эффективном экранировании матрицы силикагеля ПЭГ, что позволяет трактовать увеличение количества ПЭГ как увели-
чение толщины его функционального слоя на поверхности сорбента. Величины показателя кислотно-основных свойств полученных сорбентов a(Tb/ Tp) < 1 и их снижение по сравнению с матрицей подтверждают увеличение степени замещения атомов азота аминопропилсиликагеля и основного характера фаз при модифицировании ПЭГ
Для сорбента С-0,1ПЭГ отмечена более высокая эффективность по тестовым аналитам и лучшая симметрия пиков (табл. 2) по сравнению с сорбентом С-0,6ПЭГ, что согласуется с кинетической теорией Ван-Деемтера и свидетельствует о меньшем сопротивлении массопереносу в тонком функциональном слое сорбента.
Углеводы. Углеводы представляют собой класс полярных нейтральных веществ и являются удобными модельными аналитами для изучения свойств и возможностей гидрофильных сорбентов с использованием рефрактометрического или испарительного детектора светорассеяния. В литературе часто описывают удерживание сахаров по распределительному механизму, т.е. их распределение в приповерхностном слое воды, адсорбированном на полярной неподвижной фазе. Однако адсорбционный механизм и образование водородных связей с ОН-группами тоже вносит существенный вклад. Авторы работы [18] показали, что образование водородных связей между молекулами сахаров и неподвижной фазой Click Maltose играет большую роль в удерживании веществ данного класса. Для определения углеводов в гидрофильном режиме используют подвижные фазы, состоящие из ацетонитрила и деионизованной воды (10-35 об.%) [19, 20]. Неудовлетворительная форма пиков восстанавли-
Рис. 2. Шкалы селективности относительно рибозы и диаграммы эффективности по сахарам (1 - рибоза, 2 - фруктоза, 3 - ксилоза, 4 - глюкоза, 5 - сахароза, 6 - мальтоза, 7 - лактоза). Подвижная фаза - деионизованная вода : ацетонитрил (15:85 об.%), скорость потока 1 мл/мин, рефрактометрическое детектирование
вающих сахаров может наблюдаться из-за разрешения их аномерных форм вследствие малой скорости мутаротации [21, 22].
Селективность и эффективность по сахарам для сорбентов с разным количеством ПЭГ представлены на рис. 2. Факторы удерживания углеводов в гидрофильном режиме коррелируют с числом гидроксильных групп в структуре аналита (к' (гексоз) > к' (пентоз)) и увеличиваются с уменьшением его параметра гидрофоб-ности Ханша (log P): рибоза (-2,66, Epiweb 4.1) < ксилоза (-2,21) < фруктоза (-1,78) < глюкоза (-3,12) < сахароза (-4,50) < мальтоза (-5,26) ~ лактоза (-5,26). В случае сорбентов, модифицированных ПЭГ, наблюдали обращенный порядок удерживания для пары ксилоза / фруктоза (к' (Xyl) > к' (Fru)), который соответствует увеличению гидрофильности (но не числа ОН-групп), что может свидетельствовать о большем вкладе распределительного механизма в удерживание сахаров на сорбентах с ПЭГ в функциональном слое. Отсутствие зависимости факторов удерживания, селективности и эффективности по сахарам от толщины полимерного слоя ПЭГ также свидетельствует о
реализации распределения низкомолекулярных углеводов в приповерхностном водном слое неподвижной фазы.
Разделение шести сахаров на сорбенте С-0,1ПЭГ можно осуществить за 18 мин с использованием подвижной фазы состава вода : ацето-нитрил при соотношении 12:88 об.% (рис. 3). При этом обеспечиваются полное разрешение пиков и эффективность до 15 000 тт/м.
Аминокислоты. В настоящее время определение аминокислот методом ГИХ обрело большую популярность благодаря возможности их селективного разделения без предварительной дерива-тизации даже при анализе объектов со сложной матрицей. Использование масс-селективного детектирования позволяет определять большое число аминокислот, в частности с помощью градиентного элюирования, например, 36 аминокислот в образце плазмы крови на колонке Ac-quinity BEH Amide column [23], 16 аминокислот в экстракте почвы с использованием колонки ZIC-HILIC [24], 23 аминокислоты в экстракте растений на колонке Poroshell 120 HILIC-Z [25]. В этих и подобных работах в качестве подвижной фазы используют ацетонитрил и 10-15 об.% фор-
Рис. 3. Хроматограммма модельной смеси углеводов на сорбенте С-0,1ПЭГ (1 - рибоза, 2 - фруктоза, 3 - ксилоза, 4 - глюкоза, 5 - сахароза, 6 - лактоза). Подвижная фаза - де-ионизованная вода : ацетонитрил (15:85 об.%), скорость потока 1 мл/мин, рефрактометрическое детектирование
миатного буферного раствора. Однако, если высокая чувствительность не требуется, то можно использовать УФ-детектирование при длине волны 200 нм для ряда задач, например для анализа БАД на содержание аминокислот [26]. В качестве
подвижной фазы при УФ-детектировании следует использовать смесь ацетонитрила и фосфатного буферного раствора, рН которого выбирают в соответствии с зарядом неподвижной фазы, с небольшой концентрацией, обеспечивающей его
Т а б л и ц а 2
Хроматографические параметры определения аналитов теста Танака
Аналит теста Танака С-0,1ПЭГ С-0,6ПЭГ
к N, тт/м As к N, тт/м As
Уридин 2,88 25000 1,20 2,44 20000 1,58
5-Метилуридин 2,18 23000 1,24 1,90 18000 1,57
2 '-Деоксиуридин 1,54 21000 1,29 1,31 16000 1,57
Теобромин 0,49 16000 1,47 0,44 12000 1,59
Теофиллин 0,76 14000 1,47 0,73 12000 1,54
ТМФА 0 6000 1,12 0 7000 1,34
Урацил 1,08 15000 1,37 0,98 12000 1,63
Толуол 0 3000 2,02 0 2000 2,06
Аденозин 2,49 23000 1,21 2,44 17000 1,52
Видарабин 3,42 25000 1,17 3,38 18000 1,56
НПТС 21,89 2000 0,59 17,64 2000 0,66
П р и м е ч а н и е. Элюент - 10% 20 мМ ацетатно-аммонийного буферного раствора (рН 4,7) и 90% ацетонитрила; скорость потока 0,5 мл/мин; УФ-детектирование, 254 нм; НПТС - натрий и-толуолсульфонат.
Рис. 4. Шкалы селективности относительно фенилаланина и диаграммы эффективности по аминокислотам (1 - фенилаланин, 2 - метионин, 3 - тирозин, 4 - пролин, 5 - аспарагин, 6 - гистидин, 7 - глицин, 8 - аланин, 9 - серин, 10 - изолейцин, 11 - валин, 12 - лейцин). Подвижная фаза - 5 мМ фосфатный буферный раствор (pH 6,5) : ацетонитрил (15:85 об.%); скорость потока 1 мл/мин,
УФ-детектирование, 210 нм
Рис. 5. Хроматограмммы модельных смесей аминокислот (1 - фенилаланин, 2 -метионин, 3 - валин, 4 - тирозин, 5 - аспарагин, 6 - аланин, 7 - серин). Подвижная фаза - 5 мМ фосфатный буферный раствор (pH 6,5) : ацетонитрил (15:85 об.%); скорость потока 1 мл/мин, УФ-детектирование, 254 нм
растворимость в водно-органическом элюенте. В работе [26] для разделения аминокислот на силикагеле использовали 12,5 мМ фосфатный буферный раствор (рН 2,8) с ацетонитрилом в соотношении 15:85 об.%.
Аминокислоты представляют собой класс полярных цвиттер-ионных соединений и служат хорошими модельными объектами для изучения свойств гидрофильных неподвижных фаз. В данной работе они использованы в качестве модельных объектов для установления характеристик полученных сорбентов и оценки влияния количества ПЭГ на разделение веществ цвиттер-ионного характера. В качестве подвижной фазы для разделения аминокислот использовали смесь ацетонитрила и фосфатного буферного раствора (85:15 об.%), не поглощающего электромагнитного излучения при длине волны 210 нм, при которой проводили детектирование аминокислот. Использование буферного раствора с рН 6,5 обеспечивает суммарно нулевой заряд аминокислот, изоэлектрические точки которых находятся в интервале 5,5-6,5. В данных условиях наблюдаются большие факторы удерживания аминокислот и лучшая селективность по сравнению с таковыми при меньших значениях рН элюента, когда положительно заряженные аминокислоты могут
отталкиваться от положительно заряженных ани-онообменных центров - атомов азота в структуре синтезированных сорбентов. Хроматографические параметры разделения аминокислот приведены на рис. 4.
На представленных шкалах селективности показано, что изменение толщины полимерного слоя не влияет на порядок элюирования аминокислот, который согласуется с увеличением гидрофиль-ности аналитов. В целом для неподвижной фазы с меньшим количеством ПЭГ наблюдается лучшее удерживание, что подтверждается результатами теста Танака, согласно которым сорбент С-0,1ПЭГ обладает большей гидрофильностью. Несколько худшая селективность для пар метио-нин / тирозин и гистидин / глицин в сравнении с С-0,6ПЭГ может быть скомпенсирована более высокой эффективностью, а большие значения времени удерживания позволяют потенциально улучшить разрешение путем варьирования состава подвижной фазы. Большая эффективность для сорбента с меньшей толщиной полимерного слоя согласуется с кинетической теорией хроматографии, согласно которой размывание увеличивается с ростом толщины функционального слоя за счет сопротивления массопереносу. Представленные на рис. 5 хроматограммы по-
Рис. 6. Шкалы селективности относительно никотинамида и диаграммы эффективности по витаминам (1 - никотинамид (никотинамид), 2 - пиридоксин (В6), 3 - тиамин (В1), 4 - рибофлавин (В2), 5 - никотиновая кислота (В3), 6 - аскорбиновая кислота (С), 7 - цианокобаламин (В12)). Подвижная фаза - 100 мМ аммонийно-ацетатный буферный раствор (рН 5,8) : ацетони-трил (10:90 об.%); скорость потока 1 мл/мин, УФ-детектирование, 270 нм
Рис. 7. Хроматограммы модельных смесей витаминов (1 - никотинамид, 2 - пи-ридоксин, 3 - тиамин, 4 - рибофлавин, 5 - никотиновая кислота, 6 - аскорбиновая кислота, 7 - цианокобаламин). Подвижная фаза - 100 мМ аммонийно-ацетатный буферный раствор (рН 5,8) : ацетонитрил; градиентный режим для С-0,6ПЭГ: 0-4 мин 8% буферного раствора, 4-5 мин 8-20% буферного раствора, 5-18 мин 20% буферного раствора; градиентный режим для С-0,1ПЭГ: 0-5 мин 8% буферного раствора, 5-6 мин 8-20% буферного раствора, 6-18 мин 20% буферного раствора; скорость потока 1 мл/мин, УФ-детектирование, 270 нм
казывают возможность определения аминокислот на полученных сорбентах. Разделение семи аминокислот достигается за 40 мин с эффективностью до 40 000 тт/м.
Водорастворимые витамины. Водорастворимые витамины обладают разнообразными физико-химическими свойствами и различаются по гидрофильности, что делает их удобными модельными аналитами для изучения свойств неподвижных фаз в режиме гидрофильной хроматографии. Их разделение успешно реализуется на сорбентах различной природы - диоль-ных, аминированных и цвиттер-ионных [27-30]. Чаще всего в качестве подвижной фазы используют ацетатно-аммонийный буферный раствор с ацетонитрилом в градиентном режиме элюи-рования. Выбор буферного раствора обусловлен высокой растворимостью ацетата аммония в присутствии ацетонитрила.
Разделение семи водорастворимых витаминов на сорбентах, ковалентно модифицированных ПЭГ, проводили с использованием подвижной фазы следующего состава: 100 мМ аммонийно-ацетатный буферный раствор (рН 5,8) и ацето-
нитрил (10:90 об.%). УФ-детектирование осуществляли при длине волны 270 нм.
Порядок элюирования витаминов (рис. 6) отличается от такового для силикагеля, в том числе из-за наличия в структуре сорбентов С-ПЭГ доступных анионообменных центров - положительно заряженных атомов азота, что подтверждают результаты теста Танака. Поэтому положительно заряженный тиамин имеет невысокие факторы удерживания, а никотиновая и аскорбиновая кислоты, имеющие диссоциировавшие в условиях определения карбоксильные группы, сильно удерживаются на сорбентах С-ПЭГ и элюируют-ся только в градиентном режиме.
На приведенных шкалах селективности (рис. 6) показано, что синтезированные сорбенты демонстрируют одинаковый порядок элюи-рования и схожее время удерживания витаминов при 10% буферного раствора в подвижной фазе, за исключением тиамина В1. Вероятно, уменьшение гидрофильности при увеличении толщины слоя ПЭГ сорбента С-0,6ПЭГ оказывает наибольшее влияние на удерживание более гидрофильного среди рассмотренных
витаминов тиамина (log P = -4,8), что согласуется с ранее описанными данными теста Танака. При этом селективность для пары тиамин / рибофлавин уменьшается. Факторы удерживания всех витаминов на сорбенте С-0,1ПЭГ выше, чем на С-0,6ПЭГ, что согласуется с большей гидрофиль-ностью сорбента с меньшим количеством ПЭГ
Хроматографические параметры удерживания легко элюируемых водорастворимых витаминов (никотинамид, В1, В2 и В6) для сорбентов, модифицированных ПЭГ, имеют схожий отклик на изменение состава подвижной фазы вне зависимости от толщины слоя модификатора. При увеличении доли буферного раствора в составе элюента от 8 до 10% для обеих неподвижных фаз факторы удерживания слабоудержи-ваемых витаминов уменьшаются в среднем на 30-35% (например, с 6,79 до 4,23 для В2). Таким образом, варьирование состава элюента с шагом в 1-2% позволяет существенно изменять удерживание ряда витаминов на полученных сорбентах с сохранением эффективности. Для неподвижной фазы с меньшим количеством полимера в функциональном слое отмечены несколько лучшая эффективность (до 35 000 тт/м) и симметрия пиков водорастворимых витаминов (коэффициенты асимметрии 1,0-1,5 и 1,1-2,0 для С-0,1ПЭГ и С-0,6ПЭГ соответственно). При этом селективность С-0,6ПЭГ несколько выше, чем С-0,1ПЭГ. Таким образом, увеличение количества ПЭГ в функциональном слое может улучшить селек-
тивность по полярным, в том числе заряженным, аналитам, а для обеспечения высокой эффективности и симметрии пиков следует снижать относительное количество ПЭГ в процессе модифицирования.
Хроматограммы модельных смесей витаминов в выбранных оптимальных условиях градиентного элюирования представлены на рис. 7. Время разделения семи витаминов в обоих случаях составляет 16 мин, однако более высокая эффективность и лучшая симметрия пиков позволяют выделить сорбент С-0,1ПЭГ как наиболее перспективный для анализа витаминосодержащих объектов.
Таким образом, изучение синтезированных в работе неподвижных фаз на основе силикагеля, ковалентно модифицированного различным количеством ПЭГ, показало отсутствие различий хроматографических параметров при определении полярных нейтральных аналитов (сахаров) от количества ПЭГ в функциональном слое. Показано, что сорбент с меньшим количеством полимера в функциональном слое С-0,1ПЭГ обладает лучшими характеристиками при разделении цвиттер-ионных аналитов - аминокислот, а также водорастворимых витаминов - веществ, удерживающихся по адсорбционному механизму в режиме гидрофильной хроматографии.
Работа выполнена при поддержке Российского
научного фонда (проект № 20-13-00140).
Конфликта интересов нет.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Alpert A.J. // J. Chromatogr. A. 1990. Vol. 499. P. 177.
2. Huber J.F.K., PawlowskaM., MarklP. // J. Chromatogr. A. 1990. Vol. 500. P. 280.
3. Чернобровкина А. В., Смоленков А .Д., Шпигун О.А. // Лаборатория и производство. 2018. № 4. C. 76.
4. Jandera P., Hájek T. // J. Sep. Sci. 2009. Vol. 32. P. 3619.
5. Garcia A., Rupérez F.J., Marin A., De la Maza A., Barbas C. // J. Chromatogr. B. 2003. Vol. 785. P. 237.
6. Marín A., Barbas C. // J. Pharm. Biomed. Anal. 2006. Vol. 40. P. 262.
7. Satínsky D., Brabcová I., Marousková A., Chocholous P., Solich P. // Anal. Bioanal. Chem. 2013. Vol. 405. P. 6105.
8. West C., Lesellier E. // J. Chromatogr. A. 2006. Vol. 1110. P. 200.
9. Pragst F. // Handbook of Analytical Separations. 2008. Vol. 6. P. 447.
10. Mansour F.R., Zhou L., Danielson N.D. // Chromato-graphia. 2015. Vol. 78. P. 1427.
11. Wyszecka-Kaszuba E., Warowna-Grzeskiewicz M.,
Fijaiek Z. // J. Pharm. Biomed. Anal. 2003. Vol. 32. P. 1081.
12. Marin A., Barbas C. // J. Pharm. Biomed. Anal. 2004. Vol. 35. P. 1035.
13. Dewoolkar V.C., Jeong L.N., Cook D.W., Ashraf K.M., Rutan S.C., Collinson M.M. // Anal. Chem. 2016. Vol. 88. P. 5941.
14. RongL., Takeuchi T. // J. Chromatogr. A. 2004. Vol. 1042. P. 131.
15. Rong L., Wah Leem L., Takeuchi T. // J. Chromatogr. A. 2006. Vol. 1128. P. 68.
16. Kawachi Y., Ikegami T., Takubo H., Ikegami Y., Miyamoto M., Tanaka N. // J. Chromatogr. A. 2011. Vol. 1218. P. 5903.
17. Dolci M. Thermo Fisher Scientific, Runcorn, Cheshire, UK. Chromatographic Characterization of Stationary Phases for Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography.
18. Fu Q., Guo Z., Liang T., Zhang X., Xua Q., Liang X // Anal. Methods. 2010. Vol. 2. P. 217.
19. Padivitage N. L. T., Armstrong D.W. // J. Sep. Sci. 2011. Vol. 34. P. 1636.
20. Fu Q, Liang T, Li Z., Xu X., Ke Y, Jin Y., Liang X. // Carbohydr. Res. 2013. Vol. 379. P. 13.
21. Jenkins K. // J. Chromat. Today. 2015. Vol. 8. P. 14.
22. Kotoni D., D^Acquarica I., Ciogli A., Villani C., Capitani D., Gasparrini F. // J. Chromatogr. A. 2012. Vol. 1232. P. 196.
23. Prinsen H. C.M.T., Schiebergen-Bronkhorst B. G.M., Roeleveld M.W., Jans J.J.M., de Sain-van der Velden M.G.M., Visser G. van Hasselt P.M., Verhoeven-Duif N.M. // J. Inherit. Metab. Dis. 2016. Vol. 39. P. 651.
24. Dell'mour M., Jaitz L., Oburger E., Puschenreiter M., Koellensperger G., Hann S. // J. Sep. Sci. 2010. Vol. 33. P. 911.
25. https://www.agilent.com/cs/library/ applications/ 59918922EN_Plant_Amino_Acids_Quant_Poro-shell_120_HILICZ_Application.pdf
26. Themelis T., Gotti R., Gatti R. // J. Pharmaceut. Biomed. Anal. 2017. Vol. 145. P. 751.
27. Langer S., Lodge J.K. // J. Chromatogr. B. 2014. Vol. 960. P. 73.
28. Jandera P., Hajek T., Skerikova V., Soukup J. // J. Sep. Sci. 2010. Vol. 33. P. 841.
29. http://www.ymc.co.jp/data/appli/F121012A. pdf
30. Karatapanis A.E., Fiamegos Y.C., Stalikas C.D. // J. Sep. Sci. 2009. Vol. 32. P. 909.
Поступила в редакцию 10.10.2020 Получена после доработки 12.10.2020 Принята к публикации 20.11.2020
NOVEL STATIONARY PHASES FOR HYDROPHILIC INTERACTION LIQUID CHROMATOGRAPHY BASED ON SILICA COVALENTLY MODIFIED WITH POLYETHYLENE GLYCOL
A.S. Popov, G.S. Maksimov, A.D. Smolenkov, O.A. Shpigun, A.V. Chernobrovkina*
(Lomonosov Moscow State University, Chemistry Department, analytical chemistry chair; *e-mail: [email protected])
Novel stationary phases based on aminopropyl silica covalently modified with polyethylene glycol with different matrix to polymer mass ratio were obtained. Chromatographic properties of the prepared adsorbents were studied using Tanaka test procedure for hydrophilic stationary phases and on the example of separating model mixtures of sugars, amino acids, and water-soluble vitamins. It was shown that polyethylene glycol layer thickness variation not only affects efficiency, but allows one to tailor selectivity toward the polar analytes in hydrophilic interaction liquid chromatography mode.
Key words: HILIC, stationary phase synthesis, polyethylene glycol, sugars, amino acids, water-soluble vitamins.
Сведения об авторах: Попов Александр Сергеевич - аспирант кафедры аналитической химии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (aspopov.anchem.msu@ mail.ru); Максимов Григорий Сергеевич - студент химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова ([email protected]); Смоленков Александр Дмитриевич - вед. науч. сотр. кафедры аналитической химии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, докт. хим. наук, доцент ([email protected]); Шпигун Олег Алексеевич - профессор кафедры аналитической химии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, член-корр. РАН, докт. хим. наук ([email protected]. msu.ru); Чернобровкина Алла Валерьевна - доцент кафедры аналитической химии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, канд. хим. наук (chernobrovkina@ analyt.chem.msu.ru).
