Новые подходы к оценке биопленкообразующей активности Staphylococcus spp Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 616.94-022.7:621.384.8

НОВЫЕ ПОДХОДЫ К ОЦЕНКЕ БИОПЛЕНКООБРАЗУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ STAPHYLOCOCCUS SPP.

Степанов А.С. (аспирант кафедры)*, Богомолова К.А. (студент), Лакомова П. А. (студент), Васильева Н.В. (директор НИИ, зав. кафедрой)

Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова: НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина и кафедра медицинской микробиологии, Санкт-Петербург, Россия

© Коллектив авторов, 2018

Представлены результаты оценки вариабельности спектра гемолитической активности и пикового профиля масс-спектра 40 изолятов Staphylococcus spp. в зависимости от наличия или отсутствия биопленкообразования. Выявлена статистически достоверная взаимосвязь роста продукции гемолизина а и снижения продукции гемолизина S Staphylococcus spp. при формировании биопленок. Статистически значимые различия в уровнях продукции пептидов с молекулярной массой 4302, 5302, 5525, 6680, 6886 Da позволяют дифференцировать культуры, выделенные из биопленок от контрольных культур, пассированных через простые питательные среды. Чувствительность и специфичность комбинированного метода для выявления биопленкообразования (культурального метода и MALDI-TOF масс-спектрометрии) составили 70,0 и 81,0% соответственно.

Ключевые слова: Staphylococcus spp., MALDI-TOF-масс-спектрометрия, биопленки, гемолизины, катетер-ассоциированные инфекции

NEW APPROACHES TO THE ASSESSMENT OF BIOFILM-FORMING ACTIVITY OF STAPHYLOCOCCUS SPP.

Stepanov A.S. (postgraduate student), Bogomolova K.A. (student), Lakomova P.A. (student), Vasilyeva N.V. (director of the institute, head of the department)

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov: Kashkin Research Institute of Medical Mycology and Department of Medical Microbiology, St. Petersburg, Russia

© Collective of authors, 2018

There are the results of the hemolytic activity and the mass spectrum peak profile variability estimation of 40 isolates of Staphylococcus spp. accordance with the presence or absence of biofilm formation. A statistically significant correlation was found between the growth of hemolysin production а and the decrease in hemolysin production S Staphylococcus spp. during biofilms formation. Statistically significant differences in the levels of production of peptides with a molecular weight of 4302, 5302, 5525, 6680, 6886 Da allow to differentiate cultures isolated from biofilms from control cultures passed through simple nutrient media. The sensitivity and specificity of the culture method and MALDI-TOF mass spectrometry combination for detection of biofilm formation were 70.0 and 81.0%, respectively.

Key words: Staphylococcus spp., MALDI-TOF- mass spectrometry, biofilms, hemolysins, catheter-associated infections

Контактное лицо: Степанов Александр Сергеевич, e-mail: Aleksandr.Stepanov@szgmu.ru

ВВЕДЕНИЕ

Биопленкообразование - важный этап колонизации абиотических имплантатов и развития кате-тер-ассоциированных инфекций кровотока (КАИК), характерное для Staphylococcus spp. [1]. С целью дифференциальной диагностики КАИК и сепсиса другой локализации, как правило, проводят удаление катетера и его микробиологическое исследование параллельно с посевом крови из периферических сосудов на гемокультуру. Тем не менее, исследование катетера ассоциировано с объективными трудностями: его удаление не всегда возможно в связи с тяжестью состояния больного [2], забор материала связан с высоким риском обсеменения комменсалами кожных покровов, а Staphylococcus spp. являются одними из главных представителей микробиоты кожных покровов. В рутинной практике дифференциация КАИК от контаминации основана на количественном определении уровня обсемененности катетера [3] или обнаружении биопленок в тонких срезах катетера с помощью люминесцентной или электронной микроскопии [4]. Применение этих методов требует удаления катетера, а также использования технических инструментов, которые зачастую недоступны в рядовой микробиологической лаборатории. Также количественный посев катетера требует увеличения числа операций посева, что увеличивает риск контаминации образца [5]. Необходимы альтернативные методы, позволяющие дифференцировать КАИК от сепсиса с другой локализацией без потребности удалять катетер.

Известно, что биопленкообразование у Staphylococcus spp. регулируется комплексом генетических элементов: agr (accessory gene regulator, добавочный ген-регулятор) [6], icaABCD (intercellular adhesin, межклеточный адгезин), pia (peptide intercellular adhesin, белковый межклеточный адгезин) [7]. Ген agr, кодирует белок-регулятор, подавляющий экспрессию генов icaABCD и pia, что ингибирует биопленкообра-зование [8]. Также выявлено, что ген-регулятор agr имеет близкие рамки считывания с комплексом генов, ответственных за синтез низкомолекулярных гемолизинов Staphyloccoccus spp., в частности ген hld (синтез гемолизина 5), а в регуляцию работы генов вовлечены фактор Sigma(B) (фактор оксидативного стресса) и пептид SAR049 (функция до конца неизвестна) [9]. Данные пептиды принимают участие в регуляции синтеза клеточной стенки, а также ответственны за развитие неспецифической резистентности к антимикробным препаратам, действующим на клеточную стенку Staphylococcus spp. [9].

Гемолитическая активность Staphylococcus spp. обусловлена комплексом гемолизинов (а, в, у и 5), которые имеют различное фенотипическое проявление при росте на питательных средах, содержащих эритроциты [10, 11]. Профиль продуцируемых гемолизинов различается в зависимости от условий, в которых находился микроорганизм, и отражает физиологическое состояние изолята в данный момент времени. Способ оценки профиля продуцируемых гемолизинов на сегодняшний день описан, но не внедрен в лабораторную практику.

MALDI-TOF масс-спектрометрия позволяет обнаруживать пики пептидов в диапазоне масс от 2 до 20 kDa при использовании протокола идентификации

ПРОБЛЕМЫ МЕДИЦИНСКОЙ МИКОЛОГИИ, 2018, Т.20, №1

бактерий. Известно, что гемолизин 5, фактор Sigma(B) и пептид SAR049 имеют молекулярные массы 3005, 6888 и 5525 Da соответственно, поэтому могут быть обнаружены при масс-спектрометрии [12-14]. Также фактор Sigma(B) имеет дериват, который имеет молекулярную массу 6680 Da и может быть выявлен с помощью масс-спектрометрии.

Таким образом, выявление низкомолекулярных регуляторных пептидов может быть полезным для дифференциальной диагностики КАИК и сокращения числа ненужных извлечений катетеров, а также способно упростить лабораторную диагностику септических состояний, ускорить диагностику и уменьшить затраты на лечение пациентов [15].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получали биопленки у 40 изолятов Staphylococcus spp. (20 - S. aureus и 20 - S. epidermidis) с помощью культивирования микроорганизмов в 1% сахарном бульоне с погруженным в него стерильным участком по-ливинилхлоридного катетера [16]. Наличие биопленок определяли с помощью люминесцентной микроскопии тонкого поперечного среза катетера, окрашенного аурамин-родамином. После инкубации в течение двух суток катетер извлекали, промывали в физиологическом растворе с использованием шейкера (3000 об/ мин, 1 минута). Полученную взвесь клеток осаждали центрифугированием (6000 об/мин, 1 минута), производили высев на колумбийский агар с эритроцитами барана для оценки гемолитической активности. Параллельно проводили пассирование культур этих изолятов через простые питательные среды (мясо-пептонный агар) и определяли у них гемолитическую активность. Спектр гемолизинов оценивали культу-ральным методом у свежих культур микроорганизмов, а также после образования биопленок. Фенотипиче-скими проявлениями продукции гемолизина считали наличие полного гемолиза (гемолизин а), поверхностного гемолиза (гемолизин в), положительного «теста бабочки» (CAMP) с контрольным штаммом S. aureus ATCC®25923 (гемолизин 5) ().

А

Рис. 1. Выявление гемолизинов Staphylococcus spp. культуральным методом: А - результат тестирования контрольных культур; В - результат тестирования культур из биопленок. 1 - продуцент альфа-гемолизина, 2 - продуцент бета-гемолизина, 3 - продуцент дельта-гемолизина.

Оценку активности продукции гемолизинов осуществляли полуколичественным методом (Таблица 1). Результаты записывали в числовом формате, сравнивали средние в полученных группах.

Таблица 1

Оценка активности продукции гемолизинов Staphylococcus spp. в процессе эксперимента

Результат оценки активности Фенотипическое проявление

-(0) Отсутствие гемолизина

+ (1) Ширина зоны гемолиза равна диаметру колонии

++(2) Ширина зоны гемолизавыступаетдо 1/Здиаметра колоний

+++(3) Ширина зоны гемолиза от 2/3 до 1,5 диаметров колонии

++++(4) Ширина зоны гемолиза более чем в 2 раза превышает диаметр колонии

Проводили МАЬ01-Т0Б масс-спектрометрию свежих чистых культур, а также культур, полученных из биопленок, выращенных на мясо-пептонном агаре в течение 24 часов. Экстракцию белков выполняли на мишени с помощью 40% муравьиной кислоты (1,5 мкл). Мишень высушивали на воздухе, добавляли а-циано-4-гидроксикоричную кислоту и просушивали на воздухе. Масс-спектры собирали с использованием линейного протокола в режиме ТОБ с частотой лазера 20 И и оценкой в диапазоне масс от 2000 до 20000 Ба. Вольтаж на ускорении составил 20 кУ, вольтаж 182

- 18,6 kV. Для каждого суммарного спектра собирали данные 200 отдельных спектров, собранных со всей площади мишени [17].

Использовали статистический пакет

«MaldiQuantForeigh» программы R.3.3.2 для извлечения значений интенсивности пиков масс-спектров. Осуществили перевод файлов *.mzXML в формат *.txt для дальнейшей статистической обработки [18]. Применяли протокол Savitzky-Golay для сглаживания, пики определяли с помощью статистически-зависимого нелинейного перекрестного алгоритма выявления пиков (Statistics-sensitive Non-linear Iterative Peak clipping algorithm, SNIP) [19], удаление линии основания масс-спектра не проводили. Шумы исключали методом «Friedman's Super Smoother», включенного в пакет R 3.3.2 «MaldiQuantForeign».

Статистический анализ осуществляли с помощью программы R 3.3.2. Различия в продукции гемолизинов культурами Staphylococcus spp. оценили в различном функциональном состоянии методом Хи-квадрат. Проведена группировка изолятов по спектру гемолитической активности. Оценена чувствительность и специфичность дифференцировки по фенотипиче-ским признакам культур микроорганизмов, выделенных непосредственно из биопленок, и культур, пассированных через неселективные питательные среды. Попарное сравнение масс-спектров, полученных из культур микроорганизмов, выполняли в стадии био-пленкообразования и после пассажа на простых питательных средах. Сравнивали масс-спектры и отбирали пики с наибольшими различиями в интенсивности между сравниваемыми группами. Выбранные пики включали в модель иерархического кластерного анализа. Формирование модели осуществляли с последовательным исключением пиков до получения наиболее простого и эффективного подхода к дифференциров-ке. Оценили чувствительность и специфичность кластеризации по выявленным различиям в масс-спектре для дифференцировки культур на биопленкообразующие и небиопленкообразующие.

Применяли иерархический кластерный анализ методом Уорда с подсчетом Евклидового расстояния: относительную независимость деления на группы рассчитывали с помощью метода интенсивного использования ЭВМ (программный пакет «pvclust» программы R 3.3.2, количество повторов 1000, альфа более 0,95) [20].

РЕЗУЛЬТАТЫ

Среди 40 исследованных изолятов Staphylococcus spp., пассированных через простые питательные среды, выявлено 13 изолятов, синтезирующих гемолизин а, 12 изолятов - продуцентов гемолизина в, 19 изолятов, синтезировавших гемолизин 5. После образования биопленок культурами этих микроорганизмов количество продуцентов а, в и 5 гемолизинов изменилось: 24, 15 и 1 соответственно.

При сравнении фенотипа культур, находящихся в разном функциональном состоянии, установили, что при образовании биопленок продукция гемолизина а статистически значимо возрастала (Хи-квадрат, p=0,002), продукция гемолизина в культурой также возрастала (Хи-квадрат, p=0,003), в то время как продукция гемолизина 5 в статистически значимо сни-

жалась (Хи-квадрат, p<0,0001). Средние значения экспрессии и стандартное отклонение показателей в группах изолятов приведены ниже (табл. 2).

Таблица 2

Активность продукции различных типов гемолизинов Staphylococcus spp. в зависимости от функционального состояния культуры, оцененная полуколичественным методом (среднее ± стандартное отклонение)

Биопленка Гемолизин а Гемолизин р Гемолизин 5

Нет 0,83±1,43 0,80+1,34 1,50+1,77

Да 1,75+1,53 1,10+1,55 0,03+0,16

С помощью иерархического кластерного анализа выявили статистически достоверное деление культур Staphylococcus spp. на семь достоверно различных групп: значение альфа относительной независимости более 0,95 (рис. 2).

Оцененная чувствительность метода обнаружения культур, полученных из биопленок, составила 97,5%, в то время как специфичность - 47,5%.

На основании сравнения масс-спектров отмечали, что наибольшие изменения интенсивностей, в зависимости от условий культивирования, для S. aureus выявлены для пиков: 3005, 3240, 3782, 4305, 5031, 5302, 5525, 5662, 6840, 6886, 7565 Da (интенсивность выше при биопленкообразовании); 3339, 4290, 5112, 5250, 5338, 6393, 6680 Da (интенсивность выше при культивировании на простых средах). Для S. epidermidis мы выявили изменения пиков 2762, 3005, 3232, 3875, 3957, 4305, 4689, 4784, 4917, 5525, 5662, 5821, 5839, 6469, 6894, 7565, 7939, 8342, 9716 Da (интенсивность выше при биопленкообразовании); 2650, 3339, 5112, 5302, 5338, 6574, 6680, 6923 Da (интенсивность выше при культивировании на простых средах).

Использовали общий набор пиков для проведения иерархического кластерного анализа, статистически достоверно разделили S. aureus и S. epidermidis на два биотипа (Рис. 3). Деление биопленкообразующих культур и контрольных образцов, пассированных на простых питательных средах, было статистически достоверным (Хи-квадрат, p<0,001). Чувствительность метода выявления культур, полученных из биопленок, составила 67,5%, специфичность 75,0%.

СП

м

Расстояние

100

200

300

400

500

600

О с (л

о.

ГО 3 О.

о

(С

ш 3

>

с

¡3

-о

<

ш с ГО (Л

л> ь л>

тз О от

Расстояние 10

л>

¥ э-

X

о о о

о

тз тз

о ь о

оГ л> ь -1 о- тз

рг

чо ГО УЭ ш ^ ш го

тз о -е-

п о

§ о

о

100

>

с го ■о

Для дифференцировки биопленкообразующих изолятов от контрольных образцов применяли сочетание культурального метода и MALDI-TOF-масс-спектрометрии. Исследуемые изоляты Staphylococcus spp. вначале разделили по спектру гемолитической активности. Оценили масс-спектры изолятов Staphylococcus spp., не обладавших экспрессией гемолизина 5, для их дифференцировки. Разделили полученную выборку на две группы, статистически достоверно различающиеся по своей структуре (Хи-квадрат, p<0,001). Чувствительность комбинированного метода составила 70,0%, специфичность - 81,0% (табл. 3).

Таблица 3.

Структура кластеров Staphylococcus spp. при использовании комбинированного метода выявления биопленок (фенотипический метод и MALDI-TOF масс-спектрометрия)

Изоляты из Изоляты из культур, пассированных

биопленок in vitro

Группа 1 28 8

Группа 2 12 32

ОБСУЖДЕНИЕ

Использование MALDI-TOF масс-спектрометрии выявляло культуры, полученные из биопленок, с большей специфичностью, нежели применение фенотипи-ческого теста для выявления 5-токсина, но обладало меньшей чувствительностью.

Изоляты, первично синтезировавшие гемолизин 5, обладали hld геном, который входит в состав agr-комплекса, ответственного за кворум-сен-синг и репрессию синтеза факторов вирулентности Staphylococcus spp. [8]. В процессе образования биопленок мы выявили модификационную изменчивость, присущую этим изолятам: образовавшие биопленки изоляты не проявляли активности в продукции гемолизина 5 (Хи-квадрат, p=0,03). Только один из 40 исследованных изолятов характеризовался секрецией гемолизина 5 при образовании биопленки, хотя изначально не было выявлено секреции данного гемолизина у пассированной через простые питательные среды культуры. Мы не установили статистически значимых различий в уровне продукции гемолизинов а и р. Поэтому гемолизины а и в они не могут быть использованы в качестве основы модели для выявления биопленкообразования культуральными методами. Изменения синтеза гемолизина 5 носят более пред-

сказуемый характер, поэтому их можно применять в качестве маркеров биопленкообразования. Вследствие того, что до 50% изолятов Staphylococcus spp. не обладают agr-комплексом, совмещенным с hld-геном [14], метод выявления биопленкообразующих изолятов по культуральным признакам является низкоспецифичным, но высокочувствительным.

MALDI-TOF-масс-спектрометрия позволяет выявлять биопленкообразующие изоляты, но чувствительность метода оказалась ниже по сравнению с культу-ральным. Это объясняется высокой вариативностью пиков масс-спектра в диапазоне от 2000 до 4000 Da из-за избытка низкомолекулярных соединений, в особенности компонентов биопленок. Вследствие этого пик 3005 Da, характерный для гемолизина 5, мог не определяться. Наибольшим значением для выявления культур, полученных из биопленок, методом MALDI-TOF масс-спектрометрии обладали пики 5525, 6680, 6886 Da, отражавшие степень продукции фактора Sigma(B) и SAR049. Описанные пики характерны для Staphylococcus spp., поэтому дифференциация может быть проведена только на основании сравнения их интенсивностей. Конститутивность этих пиков повышает чувствительность метода, но требует строгого соблюдения протоколов экстракции белка и условий проведения масс-спектрометрии.

Таким образом, наличие экспрессии гена agr может быть определено фенотипически и с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии. Определение активности данного комплекса генов позволит обнаруживать биопленкообразующие изоляты при исследовании выделенной из периферической крови планктонной фазы. Культуральный метод выявления спектра гемолитической активности может быть рекомендован для скрининга биопленкообразующей активности Staphylococus spp. ввиду высокой специфичности, а метод MALDI-TOF масс-спектрометрии - в качестве подтверждающего теста в комбинации с культураль-ным. Предложенный подход оценки способности к биопленкообразованию у Staphylococcus spp. совместно с высокоэффективным культивированием позволит сократить дополнительные (избыточные) изъятия катетеров, улучшит дифференциальную диагностику септических состояний.

Работа выполнена при поддержке Гранта РФФИ № 16-54-53109.

ЛИТЕРАТУРА

1. Квашнина Д.В., Ковалишена О.В. Комплексная клинико-этиологическая и эпидемиологическая характеристика кате-тер-ассоциированных инфекций кровотока. Медицинский Альманах. 2017; 4(49): 41-45. [Kvashnina D.V., Kovalishena O.V. Kompleksnaya kliniko-etiologicheskaya i epidemiologicheskaya harakteristika kateter-assotsiirovannyih infektsiy krovotoka. Meditsinskiy Almanah. 2017; 4 (49): 41-45 (In Russ)].

2. Parienti J.-J., Mongardon N., Megarbane B., et al. Intravascular complications of central venous catheterization by insertion site. New England Journal of Medicine. 2015; 373 (13): 1220-1229.

3. Самойлова Л.М., Ильина В.Н., Горбатых Ю.Н. и др. Колонизация катетеров - фактор риска инфекционных осложнений у детей раннего возраста c врожденными пороками сердца. Патология кровообращения и кардиохирургия. 2006; 4: 3-8. [Samojlova L.M., Il'ina V.N., Gorbatyh YU.N. i dr. Kolonizaciya kateterov - faktor riska infekcionnyh oslozhnenij u detej rannego vozrasta c vrozhdennymi porokami serdca. Patologiya krovoobrashcheniya i kardiohirurgiya. 2006; 4: 3-8 (In Russ)].

4. H0iby N., Bjarnsholt T., Moser C., et al. ESCMID* guideline for the diagnosis and treatment of biofilm infections 2014. Clinical Microbiology and Infection. 2015; 21: S1-S25.

5. Zakhour R., Chaftari A.-M., Raad I.I., Zakhour R. Catheter-related infections in patients with haematological malignancies: novel preventive and therapeutic strategies. The Lancet Infectious Diseases. 2016; 16 (11): e241-e250.

6. Brackman G., Coenye T. Quorum sensing inhibitors as anti-biofilm agents. Current Pharmaceutical Design. 2015; 21 (1): 5-11.

7. Otto M. Staphylococcal biofilms. Curr Top Microbiol Immunol. 2008; 322: 207-228.

8. Gonzalez D.J., Corriden R., Akong-Moore K., et al. N-Terminal ArgD peptides from the classical Staphylococcus aureus Agr

ПРОБЛЕМЫ МЕДИЦИНСКОЙ МИКОЛОГИИ, 2018, Т.20, №1

system have cytotoxic and proinflammatory activities. Chemistry & Biology. 2014; 21 (11): 1457-1462.

9. Lauderdale K.J., Boles B.R., Cheung A.L., et al. Interconnections between Sigma B, agr, and Proteolytic Activity in Staphylococcus aureus biofilm maturation. Infect. Immun. 2009; 77 (4): 1623-1635.

10. Huseby M., Shi K., Brown C.K., et al. Structure and biological activities of beta toxin from Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 2007; 189 (23): 8719-8726.

11. Becker K., Heilmann C., Peters G. Coagulase-negative staphylococci. Clin. Microbiol. Rev. 2014; 27 (4): 870-926.

12. Bittar F., Ouchenane Z., Smati F., et al. MALDI-TOF-MS for rapid detection of staphylococcal Panton-Valentine leucocidin. International Journal of Antimicrobial Agents. 2009; 34 (5): 467-470.

13. Gagnaire J., Dauwalder O., Boisset S., et al. Detection of Staphylococcus aureus delta-toxin production by whole-cell MALDI-TOF mass spectrometry. PLOS ONE. 2012; 7 (7): e40660.

14. Harris L.G., Dudley E., Rohde H., et al. Limitations in the use of PSMy, agr, RNAIII, and biofilm formation as biomarkers to define invasive Staphylococcus epidermidis from chronic biomedical device-associated infections. International Journal of Medical Microbiology. 2017; 307 (7): 382-387.

15. Багирова Н.С. Инфекции, связанные с внутрисосудистыми устройствами: терминология, диагностика, профилактика и терапия. Злокачественные Опухоли. 2014; 3 (10): 164-171. [Bagirova N.S. Infekcii, svyazannye s vnutrisosudistymi ustrojstvami: terminologiya, diagnostika, profilaktika i terapiya. Zlokachestvennye Opuholi. 2014; 3 (10): 164-171 (In Russ)].

16. Waters E.M. Rapid quantitative and qualitative analysis of biofilm production by Staphylococcus epidermidis under static growth conditions methods in molecular biology. Humana Press, Totowa, NJ. 2014: 157-166.

17. Wolters M., Rohde H., Maier T., et al. MALDI-TOF MS fingerprinting allows for discrimination of major methicillin-resistant Staphylococcus aureus lineages. International Journal of Medical Microbiology. 2011; 301(1): 64-68.

18. Gibb S., Strimmer K. MALDIquant: a versatile R package for the analysis of mass spectrometry data. Bioinformatics. 2012; 28 (17): 2270-2271.

19. Ryan C.G., Clayton E., Griffin W.L., et al. SNIP, a statistics-sensitive background treatment for the quantitative analysis of PIXE spectra in geoscience applications. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B. 1988; 34: 396-402p.

20. Suzuki R., Shimodaira H. pvclust: Hierarchical clustering with p-values via multiscale bootstrap resampling. 2015.

Поступила в редакцию журнала 29.01.2018

Рецензент: А.Е. Тараскина