CC BY
39
■ ИМИ!
Новости клеточных технологий
h
Этот эффект, вероятно, обусловлен распознаванием Рс-фрагментов антител экспрессирующими Рс-рецептор иммунными клетками реципиента, что в конечном итоге является фатальным для трансплантированных клеток. Менее выраженное, хотя и значительное, влияние анти-С038 антител наблюдалось при трансплантации ЫСЮ/БСЮ мышам с более выраженными врожденными дефектами 1\1К-клеток, свидетельствуя об их роли в подавлении меченных антителами клеток.
Недооценка роли иммунной системы МСШ/БСЮ мышей в предыдущих исследованиях привела, по-видимому, к ошибочному мнению, что ЛСК при ОМЛ локализуются исключительно в популяции Сй34+С038 клеток. В настоящем исследовании было показано, что ЛСК гораздо более гетерогенны и популяция Сй34+С038+ может иметь более выраженную туморогенную активность. Тем не менее, для окончательного ответа на этот вопрос необходимо проведение после-
довательной серийной трансплантации CD34+CD38+ клеток, что позволит определить их ограниченный или неограниченный потенциал к пролиферации.
Основным достижением исследования является вывод, что метод сортировки клеток на основании паттерна выявляемых антителами структур методом FACS и последующей серийной трансплантации выделенных клеток NOD/SCID мышам не является оптимальным для изучения туморогенного потенциала разных популяций опухолевых клеток. Необходима разработка модификаций метода, в которых, например, использовались бы мыши-реципиенты с более выраженными дефектами иммунной системы или вместо целых антител применялись бы только Р(аЬ)2-фрагменты. В свете новой информации также необходим пересмотр многочисленных данных об опухолевых стволовых клетках при других новообразованиях, которые были получены с использованием аналогичной экспериментальной модели.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Bhatia М., Wang J.C., Карр U., Bonnet D., Dick J.E. Purification of primitive human hematopoietic cells capable of repopulating immune-deficient mice. PNAS 1997; 94: 5320—5.
2. Krause D., Van Etten R. Right on target: eradicating leukemic stem cells. TRENDS in Molecular Medicine 2DD7; 13C11 ]: 470—81.
3. LapidotT., Sirard C., Vormoor J. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature 1994; 367 [64641: 645-8.
4. Shultz L., Schweitzer P., Christianson S. et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. J. Immunol.
1995; 154: 180-91.
5. Tanaka T., Kitamura F., Nagasaka Y. Selective long-term elimination of natural killer cells in vivo by an anti-interleukin 2 receptor beta chain monoclonal antibody in mice. J. Exp. Med. 1993; 178: 1103—7.
6. Bonnet D., Dick J.E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat. Med. 1997; 3: 730-7.
7. Taussig D.C., Pearce D.J., Simpson C. et al. Hematopoietic stem cells express multiple myeloid markers: implications for the origin and targeted therapy of acute myeloid leukemia. Blood 2005; 106: 4086—92.
Подготовил ИЛ. Плакса
По материалам: Taussig D„ Miraki-Moud F„ Anjos-Afonso F. et al. AnthCD38 antibody-mediated clearance of human repopulating cells masks the heterogeneity of leukemia-initiating cells. Blood 2008; 112: 568-575
Новые данные о хромосомных аберрациях, возникающих в эмбриональных стволовых клетках человека в процессе культивирования
При культивировании эмбриональных стволовых клеток (ЗСК) человека необходимо проводить постоянный мониторинг их кариотипа, поскольку в процессе культивирования in vitro в ЗСК нередко возникают хромосомные аберрации [1—3], такие как анеуплоидии — потери или, напротив, приобретения лишних хромосом в диплоидном хромосомном наборе. Логично предположить, что подобные изменения генома клетки могут влиять на ее пролиферацию как в сторону ее усиления, так и подавления, способность к спонтанной дифференциров-ке в том или ином направлении, а также приводить к злокачественной трансформации. По этой причине изменения кариотипа ЗСК снижают воспроизводимость и достоверность результатов научных экспериментов, приводя к многочисленным артефактам, а также являются серьезным препятствием для применения ЗСК в клинической практике [1]. К настоящему времени известно о возникновении таких хромосомных аномалий при культивировании ЗСК, как появление в геноме лишних 12, 17 и X хромосом [2—4].
В декабре 2008 года в журнале Nature Biotechnology появилось сразу две работы независимых групп исследователей, где было показано, что набор хромосомных аберраций, происходящих в ЗСК человека при культивировании, несколько шире уже известного. При этом исследователи не стали ограничиваться общепринятой окраской препаратов метафазных пластинок по Гимза, применяющейся для учета хромосомных аберраций, поскольку этот метод не обладает достаточной точностью. Помимо стандартного метода был использован анализ единичных нуклеотидных полиморфизмов (т.н. SNP-анализ от single nucleotide polymorphysm), основанный на микрочиповой технологии [3], и проведена сравнительная геномная гибридизация, также результаты были подтверждены флуоресцентной гибридизацией in situ (FISH) и оценено влияние хромосомных аберраций на экспрессию генома с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени (qRT-PCR).
Научная группа С. Spits охарактеризовала семнадцать линий ЗСК человека, полученных в собственной
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, № 1, 2009
■ ИМИ!
Новости клеточных технологий
лаборатории по известной методике [5] и культивированных различное число пассажей. Наименьшее число пассажей, на котором был произведен анализ — 5, наибольшее — 276. По какой причине авторы построили свой эксперимент именно таким образом, в работе не указано, хотя, казалось бы, гораздо логичнее было проводить анализ кариотипа и генома клеточных линий на определенных пассажах.
В культивировавшихся линиях было выявлено три типа хромосомных аномалий: трисомии либо моносо-мии по хромосомам 22, 18 и 17 (только в одной линии) ; субмикроскопические дупликации (дупликации участков хромосом, не выявляемые окраской по Гимза); появление в клетках гибридной хромосомы, включающей короткое плечо хромосомы 18, ее центромерный участок и длинное плечо хромосомы 5 либо 7.
Наиболее часто среди встретившихся субмикроско-пических дупликаций, выявившихся в пяти линиях ЭСК после длительного культивирования (более чем 100 пассажей), была дупликация локуса 20q11.21. Эта аномалия уже была описана прежде для двух линий ЭСК — Н7 и HSF1, однако ей не придавали большого значения, считая характерной только для конкретных клеточных линий [3, 6]. Группа С. Spits показала, что данная мутация имеет в разных случаях разную протяженность и может затрагивать ген dnmt3b, продукт которого участвует в пролиферации клеток и защищает ЭСК от апоп-тоза. Увеличение количества белка DNMT3B в клетках с произошедшей дупликацией приводило к тому, что клетки начинали активнее пролиферировать, а также были в меньшей степени склонны к спонтанной диффе-ренцировке, обычно наблюдающейся по краям колоний ЭСК. Другими генами, которые могли подвергаться дупликации, были известный регулятор самообновления ЭСК sox-2 и протоонкоген с-тус.
Исследователи под руководством A.L. Perrier (работа N. Lefort), статья которых была опубликована одновременно со статьей С. Spits и соват., сосредоточились на изучении дупликации локуса 20q11.21, включающей до 23 генов и микро-РНК hsa-miR-1825, проанализировав пять линий ЭСК человека. При этом кариотип клеток оценивался на каждом пассаже до пассажа, на котором впервые определялась данная аномалия. Для линий ЭСК, выбранных французскими учеными, ранее был показан нормальный диплоидный кариотип (по данным регистра эмбриональных стволовых клеток NIH [7]). Дупликации были обнаружены в четырех линиях из пяти на пассажах от 50 до 105. То, что в одной линии аномалия так и не выявилась, исключает влияние на появление дупликации условий культивирования, принятых в данной лаборатории. В остальных четырех линиях ЭСК дупликации были обнаружены на соответствующих пассажах
в от 24% до 57% клеток. При этом клетки с дупликацией, как подчеркивают авторы работы, не отличались от нормальных скоростью пролиферации и экспрессией характерных для ЭСК маркерных генов.
Известно, что амплификация локуса 20q11.21 наблюдается при карциномах молочной железы [8], раке легкого [9], гепатоцеллюлярной карциноме [10], раке мочевого пузыря [11 ], на ранних стадиях рака шейки матки [12], а также при меланоме [13]. По-видимому, эта область генома содержит гены, регулирующие пролиферацию клеток, хотя группа N. Lefort и не обнаружила в ЭСК с ее дупликацией повышения пролиферативной активности. Также следует обратить особенное внимание на содержащуюся в регионе 20q11.21 микро-РНК, поскольку в настоящее время известно, что микро-РНК являются ключевыми регуляторами активности жизненно важных генов и задействованы в канцерогенезе [14].
Ученые из научной группы С. Spits предположили, что появление описанных субмикроскопических дупликаций, а также фрагмента хромосомы 18, соединенного с фрагментом 5 либо 7 хромосомы, обусловлено нарушением механизмов репарации ДНК. В хромосоме 18 часто возникает двунитевой разрыв в определенной области (т. н. fragile site, участок разрыва) и происходит потеря длинного плеча вместе с теломерным участком. Затем потерянный участок хромосомы восстанавливается, однако в качестве основы по какой-то причине используются хромосомы 5 либо 7 [15]. Такие нарушения, как было недавно показано, могут быть индуцированы определенными условиями культивирования, например заменой фетальной бычьей сыворотки на искусственные аналоги сыворотки [16]. Причина, по-видимому, кроется в том, что в искусственной сыворотке отсутствуют некоторые необходимые рибонуклеотиды, что приводит к нарушениям механизмов репарации ДНК. Относительно субмикроскопических дупликаций авторы свое предположение никак не поясняют.
Таким образом, впервые было показано, что помимо уже описанных изменений кариотипа для ЭСК человека характерно возникновение хромосомных аномалий, затрагивающих одновременно хромосомы 18, 5 и 7, а также дупликации области 20q11.21, включающей гены, продукты которых участвуют в регуляции самообновления и дифференцировки ЭСК. Эти данные указывают на необходимость более тщательного контроля характеристик ЭСК в культурах и применения более чувствительных методов, нежели использующиеся сегодня. В то же время полученные результаты — исключительно феноменологические и не дают ответов на вопросы о причинах и механизмах возникновения хромосомных аберраций в ЭСК, которые, несомненно, требуют дальнейшего изучения.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Josephson R. Molecular cytogenetics: making it safe for human embryonic stem cells to enter the clinic. Expert. Rev. Mol. Diagn. 2007; 7 [41: 395-406.
2. Baker D.E., Harrison N.J., Maltby E. et al. Adaptation to culture of human embryonic stem cells and oncogenesis in vivo. Nat. Biotechnol. 2DD7; 25(21: 207-15.
3. Maitra A., Arking D.E., Shivapurkar N. et al. Genomic alterations in cultured human embryonic stem cells. Nature Genetics 2DD5; 37: 1099-103.
4. Josephson R., Sykes G., Liu Y. et al. A molecular scheme for improved characterization of human embryonic stem cell lines. BMC Biology 2006, 4: 28.
5. Mateizel I., De Temmerman N.. Ullmann U. et al. Derivation of human embryonic stem cell lines from embryos obtained after IVF and after PGD for monogenic disorders. Human Reproduction 2006; 21: 503—11.
6. Wua H., Kima K.J., Mehtac K. et al. Copy Number Variant Analysis of Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells 2008; 26C6): 1484—89.
7. http://stemcells.nih.gov/research/registry
8. Tanner M.M., Tirkkonen M., Kallioniemi A. at al. Independent amplification and frequent co-amplification of three nonsyntenic regions on the long arm of chromosome 20 in human breast cancer. Cancer Res. 1996; 56t15]: 3441-5.
9. Tonon G., Wong K.K., Maulik G. et al. High-resolution genomic profiles of human lung cancer. PNAS 2005; 102(271: 9625—30.
10. Midorikawa Y., Yamamoto S., Ishikawa S. et al. Molecular karyotyping of human hepatocellular carcinoma using single-nucleotide polymorphism arrays. Oncogene 2006; 25(401: 5581—90.
11. Hurst C.D., Fiegler H., Carr P. et al. High-resolution analysis of genomic copy number alterations in bladder cancer by microarray-based comparative genomic hybridization. Oncogene 2004; 23C12): 2250—63.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, hl< 1, 2009
■ И I II II
■тп
Новости клеточных технологий
12. Scotto L., Narayan G., Nandula S.V. et al. Identification of copy number gain and overexpressed genes on chromosome arm 20q by an integrative genomic approach in cervical cancer: potential role in progression. Genes Chromosomes Cancer 2DD8; 47C9): 755—65.
13. Koynova D.K., Jordanova E.S., Milev A.D. et al. Gene-specific fluorescence in-situ hybridization analysis on tissue microarray to refine the region of chromosome 20q amplification in melanoma. Melanoma Res. 2007; 17 [11: 37-41.
14. Calin G.A., Sevignani C., Dumitru C.D. et al. Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers. PNAS 2004; 101 [91: 2999-3004.
15. Pfeiffer P., Goedecke W., Obe G. Mechanisms of DIMA doublestrand break repair and their potential to induce chromosomal aberrations. Mutagenesis 2000; 15C4]: 289—302.
16. LukusaT., Fryns J.P. Human chromosome fragility. Biochim. Biophys. Acta. 2008; 1779C1]: 3-16.
Подготовила А.С. Григорян
По материалам: Spits С., Mateizei I., Geens M. et al. Recurrent chromosomal abnormalities in human embryonic stem cells.
Nature Biotechnology 2008; 26(12): 1361 -3. Lefort N„ Feyeux M„ Bas C. et al. Human embryonic stem cells reveal recurrent genomic instability at 20q11.21. Nature Biotechnology 2008; 26(12): 1364-6
Ниша гемопоэтических стволовых клеток in vivo: «увидеть своими глазами»
Функциональное состояние гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) регулируется совокупностью внешних сигналов от специфического микроокружения, называемого «нишей» стволовых клеток [1]. Полагают, что терапевтические манипуляции на уровне ниши ГСК могли бы стать весомой альтернативой трансплантационным подходам в клинике. Однако до сих пор нет единого мнения о том, какова молекулярная природа регуляторных сигналов в нише и какие клетки отвечают за их продукцию. В последние годы был обнаружен ряд молекул (ангиопоэтин, тромбопоэтин, хемокин CXCL12, остео-понтин и др.), нарушение экспрессии которых существенно сказывается на взаимодействии ГСК со своей микросредой. Иммуногистохимические исследования, в свою очередь, показали, что ГСК локализуются вблизи эндоста — гетерогенного слоя клеток, выстилающего костномозговую полость (так наз. «эндостальная» ниша ГСК). Эндостальная выстилка образована остеобластами, остеогенными клетками-предшественниками (часто обозначаемыми как «клетки костной выстилки» — bone-lining cells) и остеокластами; при этом остеобласты рассматриваются как главный клеточный компонент эндоста, отвечающий за регуляцию ГСК [2, 3].
В дополнение, исследовательская группа S.J. Morrison обнаружила в образцах костного мозга и селезенки мышей устойчивые ассоциации CD150+ ГСК с эндотелием сосудов, что указало на возможное существование еще одной, «сосудистой» ниши ГСК [4]. Действительно, через сосудистый эндотелий поступают эндокринные сигналы от циркулирующих гормонов, цитокинов и факторов роста, поэтому контакт стволовых клеток с эндотелием позволяет ускорить их функциональный ответ на внешний стимул. Например, как уже обсуждалось [5], нейральные стволовые клетки своими отростками тесно контактируют с эндотелием сосудов в специфических зонах, где повышена проницаемость ге-матоэнцефалического барьера. Более того, взаимодействие ГСК с клетками сосудов представляется особо важным в очагах экстрамедуллярного гемопоэза (печень, селезенка), где нет костной ткани [1].
С другой стороны, разделение микроокружения ГСК на «эндостальную» и «сосудистую» нишу весьма условно по следующим причинам [1]. Во-первых, эндост
характеризуется высокой степенью васкуляризации и поэтому ГСК, взаимодействующие с эндостом, так или иначе, оказываются в непосредственной близости от сосудов. Во-вторых, контакт ГСК с окружающими клетками может служить для их закрепления в костном мозге, и регуляция функциональной активности ГСК тогда осуществляется за счет продукции растворимых факторов. В этом случае локализация ГСК в костном мозге утрачивает свое первостепенное значение. В-третьих, данные анализа фиксированных иммуногистохимичес-ких препаратов не позволяют отличить устойчивые, функционально значимые ассоциации ГСК с окружающими клетками от кратковременных и случайных и поэтому не могут в полной мере отразить естественное распределение ГСК in vivo. Таким образом, информация, полученная путем текущего наблюдения за стволовыми клетками в их естественном окружении, позволила бы ответить на вопрос о действительном распределении ГСК в костном мозге и о том, где на самом деле происходит их самообновление.
В декабре на сайте журнала Nature появились две публикации, посвященные структуре и формированию ниши ГСК во взрослом организме мышей. Так, Y. Xie с соавт. (совместное исследование групп Ricardo A. Feldman и Linheng Li) и С. Lo Celso с соавт. (группа D.T. Scadden) удалось в реальном времени проследить за поведением трансплантированных ГСК в костном мозге животных.
Отсутствие уникального маркера создает существенное препятствие для визуализации живых ГСК in vivo или ex vivo. Действительно, в случае изучения стволовых клеток с комплексным фенотипом не подходят трансгенные животные, несущие ген-репортер под контролем промотора специфического маркерного гена. Поэтому одним из решений может быть трансплантация предварительно обогащенной и отсортированной популяции меченых клеток. Y. Xie с соавт. выделяли популяцию клеток с фенотипом Flk2~/Lin~/Sca-1 +/c-Kit+ (Flk2— LSK) у трансгенных мышей с GFP-репортером, контролируемым промотором повсеместно экспрессируемого гена актина. С. Lo Celso с соавт. использовали в работе ГСК с различными, частично перекрывающимися фенотипами (LSK CD34~/Flk2~, LSK CD150+/CD48, LSK Flk2~/CD48~), при этом сортированные клетки
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, 1У< 1, 2009
