CC BY
38
Новое производное оксимов 4-бензоилпиридинов ГИЖ-298, обладающее противосудорожной
активностью
ЖмуренкоЛ.А., Мокров Г.В., Неробкова Л.Н., Литвинова С.А., Гайдуков И.О., Воронина Т.А., Гудашева Т.А.
ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова», г. Москва
Резюме. В настоящей работе осуществлён дизайн и синтез нового производного оксима 4-бензоилпиридина - ГИЖ-298 (оксалат 0-(2-морфолиноэтил)оксима 4-бензоилпиридина). Это соединение обладает противосудорожной активностью, устраняя первично-генерализованные судороги в тестах антагонизма с максимальным электрошоком (МЭШ) и коразолом в дозах 0,5-100 мг/кг у грызунов внутрибрюшинно. ЛД50 при внутрибрюшинном введении для соединения ГИЖ-298 составляет 316 мг/кг (мыши). Таким образом, ГИЖ-298 имеет большую терапевтическую широту.
Ключевые слова: противосудорожные средства, оксимы бензоилпиридинов, тест максимального электрошока, тест антагонизма с коразолом
Novel 4-benzoylpyridine oxime derivative GIZH-298 with aticonvulsant activity
Zhmurenko L.A., Mokrov G.V., Nerobkova L.N., Litvinova S.A., Gaydukov I.O., Voronina T.A., Gudasheva T.A.
Zakusov Research Institute of Pharmacology, Moscow
Resume. Novel derivative of benzoylpyridine oximes - GIZH-298 (4-benzoylpyridine 0-(2-morpholinoethyl) oxime oxalate) was designed and synthesized in this work. This compound has a broad spectrum of anticonvulsant effects, eliminating primary generalized seizures in maximal electroshock (MES) and corazol antagonism tests in rodents in the doses of 0,5-100 mg/kg. LD50 for compound GIZH-298 is 316 mg/kg intraperitoneally (mouse). GIZH-298 has a large therapeutic breadth..
Keywords: anticonvulsant drugs, benzoylpyridine oximes, maximal electroshock test, corazol antagonism test
Автор, ответственный за переписку:
Мокров Григорий Владимирович - к.х.н., заведующий лабораторией тонкого органического синтеза ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова»; 125315, г. Москва, ул. Балтийская, 8; +7 (495)601-22-46; e-mail: g.mokrov@gmail.com
Введение
Распространённость эпилепсии в разных странах, по данным ВОЗ, варьирует в очень широком диапазоне — от 1,5 до 50 случаев на 1 000 населения [1, 2], а в Российской Федерации составляет 2,98 на 1 000 человек населения [3].
Для лечения эпилепсии применяется значительное количество противоэпилептических препаратов (ПЭП), таких как леветирацетам, топирамат, кар-бомазепин, финлепсин, дифенин и другие, однако продолжается их активный поиск и совершенствование, что связано с тем, что современные ПЭП не удовлетворяют в полной мере требованиям клиники. Несмотря на широкий спектр противосудорожных средств около 20—30% больных остаются резистентными к лечению основными противосудорожными препаратами. Кроме того, отмечаются случаи провокации судорожных проявлений на фоне терапии ПЭП, обусловленных многообразием механизмов генерации судорог, что создаёт трудности подбора противосудорожной терапии [4, 5].
Целью настоящей работы явилось создание новых соединений, обладающих противосудорожной активностью.
Дизайн и синтез
Для конструирования новых соединений, обладающих противосудорожной активностью, был использован фармакофорный подход, основанный на структурах известных препаратов, относящихся к классу селективных ингибиторов обратного захвата серотонина. Известно, что основным эффектом данной группы препаратов является антидепрессивное действие, однако у ряда представителей этого класса наблюдается выраженная противосудорожная активность. Так, антиконвульсивным действие обладает зимелидин [6] и флуоксетин [7] (рис. 1).
Анализ структур зимелидина и флуоксетина позволил сделать предположение о фармакофорных элементах, необходимых для наличия противосудорожной активности (рис. 2А). В молекуле должны быть два ароматических фармакофора и аминосо-держащий фармакофор. Указанные группы должны соединяться при помощи линкера, в состав которого должны входить не менее трёх атомов. На основании предложенной фармакофорной модели была сконструирована группа аминосодержащих производных оксимов 4-бензоилпиридина (рис. 2Б).
Аминосодержащая группа
Зимелидин
Линкер
Флуоксетин
Рис. 1. Соединения, обладающие противосудорожной активностью, использовавшиеся для дизайна новых структур
Нами был получен ряд представителей предложенной группы, и в качестве наиболее перспективного соединения было отобрано вещество ГИЖ-298. Это соединение было синтезировано по следующей схеме (рис. 3).
Оксим 4-бензоилпиридина, который получают в соответствии с методикой [8], вводят во взаимодействие с хлорэтилморфолином в ДМФА в присутствии гидрида натрия. Основание 0-(2-морфолиноэтил) оксима 4-бензоилпиридина превращают в оксалат действием щавелевой кислоты в этаноле. Выход конечного соединения составляет 75%. Т.пл. 154—155°С (из этанола). Спектр ЯМР (ДМСО^6, 8, м.д.): 2,83 (4Н, м, -СН2^-СН2- (морфолина)); 3,10 (2Н, т, СИ2^; 3,67 (4Н, м, -СН2-О-СН2- (морфолина)); 4,39 (2Н, т, СН2О); 5,10 уср. (ТОО и (СООЦЪ); 7,35 (2И, м, 3- и 5-Н Ру); 7,37-7,51 (5И, м, ЛгИ), 8,71(2И, м, 2- и 6-И Ру). Данные элементного анализа соответствуют расчётной брутто формуле С18И2^3О2И2С2О4.
Рис. 2. Фармакофорная модель строения бис-ариль-ных соединений, обладающих противосудорожной активностью (на примере зимелидина) (А) и соответствие предложенных соединений этой фармакофорной модели (Б)
Материалы и методы Животные
Экспериментальных животных получали из питомника «Столбовая» ГУ НЦБМТ (Московская область). Содержание животных соответствовало правилам лабораторной практики (GLP) и нормативным документам «Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию вивариев», утверждённым Главным Государственным санитарным врачом 06.04.1973 г. №1045-73 и Приказом МЗ и социального развития РФ от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении Правил лабораторной практики».
CI-
-J \
\. UM i, DMF
\_/ 2 [COOHfc, EtOH
Рис. 3. Схема синтеза соединения ГИЖ-298
(OQOHt
Изучение противосудорожного действия ГИЖ-298 на модели первично-генерализованных судорог, вызванных максимальным электрошоком
Эксперименты проводили на белых беспородных мышах-самцах, массой 20—26 г. Каждая доза соединения исследовалась на 8—10 животных. Методика максимального электрошока (МЭШ) моделирует первично-генерализованные судороги — так называемые «большие» (Grant mal) судорожные припадки и является базисным тестом при оценке действия веществ с противосудорожной активностью [9—11].
Максимальный электросудорожный припадок (МЭШ) создавали с использованием сертифицированной установки «Rodent Shocker RS», type 221 (Harvard Apparatus, GmbH, Германия). Животные получали через специальные корнеальные электроды электрические стимулы (режим 500/300 V/mA: 144 mA, длительностью 0,3 с). Регистрировали следующие показатели: тоническую экстензию задних и передних конечностей, а затем, клонические судороги и гибель животных. Противосудорожный эффект заявляемых соединений оценивали по способности предупреждать развитие тонической экстензии и гибель животных Соединения вводили внутрибрюшинно за 40 мин до проведения МЭШ. Для определения ЭД50 (эффективной дозы вещества, оказывающей противосудорожный эффект у 50% животных) использовался метод пробит-анализа (метод Финни) с помощью программного пакета StatplusV5 рассчитывали ЭД^, ЭД50, ЭД84 — дозы, при введении которых противосудорожный эффект наблюдался, соответственно, у 16, 50 и 84% животных.
Изучение противосудорожного действия ГИЖ-298 на модели первично-генерализованных судорог, вызванных коразолом
Эксперименты проводили на белых беспородных мышах-самцах, массой 20—26 г. Каждая доза соединения исследовалась на 8—10 животных. Тест антагонизма с коразолом (пентилентетразол, Sigma-Aldrich, США) — антагонистом ГАМК-А рецепторов, также
как и тест максимального электрошока, является базисной методикой при оценке действия веществ с противосудорожной активностью [9, 11]. В этой методике судороги вызываются химическим воздействием и моделируют первично-генерализованные судороги при так называемых «малых» (Petit mal) судорожных припадках.
Опытным группам внутрибрюшинно вводили соединение ГИЖ-298, растворённое в физиологическом растворе в дозах 1,0 и 50,0 мг/кг за 40 мин до коразола. Контрольным животным внутрибрюшинно вводили физиологический раствор в эквивалентном объёме. Для получения судорожного припадка животным подкожно в область шейного отдела спины вводился коразол в дозе 95,0 мг/кг, вызывающей судороги у 97% мышей. Животные наблюдались в течение 30—60 мин после инъекции коразола. Регистрировали: латентный период первого генерализованного приступа с потерей рефлекса переворачивания (ЛП), время гибели и число погибших животных.
Изучение острой токсичности ГИЖ-298
Эксперименты проводили на белых беспородных мышах-самцах, массой 22—26 г. Соединения вводили однократно, внутрибрюшинно. Регистрацию гибели животных проводили через 24 часа и 14 дней после введения. Методом пробит-анализа (метод Финни) с помощью программного пакета Statplus V5 рассчитывали ЛД16, ЛД50, ЛД84 — доз, при введении которых погибало 16, 50 и 84% животных, соответственно.
Результаты и их обсуждение
Противосудорожное действие ГИЖ-298 на модели первично-генерализованных судорог,
вызванных максимальным электрошоком
Установлено, что проведение МЭШ вызывало тоническую экстензию и гибель 88—100% мышей. Соединение ГИЖ-298 в диапазоне доз от 0,5 до 10,0 мг/кг уменьшало (на уровне тенденции) число животных с тонической экстензией и увеличивало количество выживших животных по сравнению с контролем.
Таблица 1
Противосудорожная активность соединения ГИЖ-298 тесте максимального электрошока на мышах
Группа Доза, мг/кг Число выживших животных без судорог/ число животных в группе Число выживших животных без судорог, %
Контроль, МЭШ — 1/8 12,5
ГИЖ-298 + МЭШ 0,5 2/8 25
Контроль, МЭШ — 1/10 10
ГИЖ-298 + МЭШ 1 5/10 50
Контроль, МЭШ — 1/8 12,5
ГИЖ-298 + МЭШ 5,0 3/7 43
Контроль, МЭШ — 1/8 12,5
ГИЖ-298 + МЭШ 10,0 4/8 50
Контроль, МЭШ — 0/9 0
ГИЖ-298 + МЭШ 20,0 6/9* 66,7*
40,0 6/9* 66,7*
Контроль, МЭШ — 1/8 12,5
ГИЖ-298 + МЭШ 60,0 8/8* 100*
80,0 8/8* 100*
Контроль, МЭШ — 0/8 0
ГИЖ-298 + МЭШ 100,0 8/8* 100*
Примечание: "значимость отличий от контрольной группы, прир < 0,05 (точный критерий Фи
Таблица 2
Влияние ГИЖ-298 на судороги, вызванные коразолом
Группа Доза, мг/кг Число выживших мышей/ число животных в группе, а.е. Число выживших мышей, % ЛП 1-го приступа, с Время гибели, с
Коразол 95,0 0/8 0 32,8±7,2 361,0±129,3
ГИЖ-298 + коразол 20,0 1/8 12,5 180,3±37,4* 735,4±224,9
Коразол 95,0 2/10 20,0 53,7±12,5 355,5±105,2
ГИЖ-298 + коразол 60,0 2/10 20,0 91,4±10,1* 457,3±126,5
Соединение ГИЖ-298 в дозах от 20,0 до 150,0 мг/кг статистически достоверно уменьшало число животных с тонической экстензией и увеличивало количество выживших животных по сравнению с контролем. Так, в дозе 20 мг/кг устранение судорог и увеличение выживаемости наблюдалось у 67% животных, а в дозах 60,0; 80,0; 100,0 и 150 мг/кг — у 100% мышей (табл. 1).
Противосудорожное действие ГИЖ-298 на модели первично-генерализованных судорог, вызванных коразолом
Установлено, что у контрольных животных после введения коразола в дозе 95,0 мг/кг судорожные проявления развивались в следующей последовательности.
1. Одно или более миоклонических подергиваний всего тела — 100% мышей.
2. Повторяющиеся клонические судороги передних и/или задних конечностей длительностью более чем 3 с без потери рефлекса переворачивания — 100% мышей.
3. Генерализованные клонические судороги передних и задних конечностей с утратой рефлекса переворачивания — 90% мышей.
4. Гибель животных — 80—100% мышей.
Установлено, что соединение ГИЖ-298 в дозах 20,0
и 60,0 мг/кг статистически достоверно увеличивает латентный период первого приступа (ЛП) на 148 и 59 с, соответственно, по сравнению с контрольной группой животных, но не предотвращает развитие вызванных коразолом судорог и гибель животных (табл. 2). Кроме того, было обнаружено, что ГИЖ-298 меняет картину судорожных проявлений, устраняя как тоническую экстензию задних конечностей, так и клонические судороги передних конечностей.
Острая токсичность ГИЖ-298
Установлено, что соединение ГИЖ-298 при введении в дозе 220 мг/кг через 24 ч вызывало гибель одного животного из десяти (10%). В течение последующих 14 дней после однократного введения соединения ГИЖ-298 гибели животных не зарегистрировано.
При введении соединения ГИЖ-298 в дозе 300,0 мг/кг наблюдалась гибель 40% животных (4 из 10) через 24 ч после введения; изменения показателя выживаемости через последующие две недели не наблюдалось. После введения соединения ГИЖ-298 в дозе 350,0 мг/кг через 24 ч погибло 50% животных (5 из 10), а в дозе 400,0 мг/кг — 90% животных (9 из 10); через 14 дней после введения соединения ГИЖ-298 дополнительной гибели крыс не наблюдалось. Расчётное значение ЛД50 для соединения ГИЖ-298 составило 316 мг/кг.
Выводы
Таким образом, производное оксима 4-бензо-илпиридина ГИЖ-298 обладает широким спектром противосудорожных эффектов, устраняя первично-генерализованные судороги в тестах антагонизма с максимальным электрошоком (МЭШ) и коразолом. Противосудорожный эффект соединения ГИЖ-298 наблюдается в широком диапазоне доз (от 20 до
Литература
1. Сидоренко К.В., Даренская Е.Ю. Распространенность эпилепсии в мире. Успехи современного естествознания. 201; 6.
2. Hauser W.A. Epidemiology of epilepsy. X Всероссийский съезд неврологов с международным участием: материалы съезда. Нижний Новгород, 2012; 313-314.
3. Гехт В.А., Хаузер Л.Е. Мильчакова и др. X Всероссийский съезд неврологов 125с международным участием: материалы съезда. Нижний Новгород. 2012; 277.
4. Портер Р.Дж., Мелдрум Б.С. Противоэлептические средства / В кн. Б.Г. Катцунг. Базисная и клиническая фармакология: В 2 т. Т. 1. / Пер. с англ. 2-е изд., перераб. и доп. М.; СПб.: Изд-во Бином, Изд-во «Диалект», 2007; 464-491.
5. Карлов В.А. Эпилепсия у детей и взрослых женщин и мужчин: руководство для врачей. М.: Медицина, 2010; 717.
6. D. Pericic, Strac D.S., Vlainic J. Zimelidine decreases seizure susceptibility in stressed mice. Journal of Neural Transmission. 113; 12: 1863-1871.
100 мг/кг), не вызывающих побочных эффектов. В тесте максимального электрошока соединение ГИЖ-298 (60—100 мг/кг) предупреждает судороги и гибель 100% животных (ЭД50 — составляет 15 мг/кг), а на модели антагонизма с коразолом статистически достоверно увеличивает латентный период развития первого приступа и меняет картину судорожных проявлений, устраняя как тоническую экстензию задних конечностей, так и клонические судороги передних конечностей.
ЛД50 для соединения ГИЖ-298 составляет 316 мг/кг. Рассчитанный по соотношению ЛД50 к ЭД50 терапевтический индекс составляет для соединения ГИЖ-298 21, что свидетельствует о том, что оксалат 0-(2-морфо-линоэтил)оксима 4-бензоилпиридина (соединение ГИЖ-298) имеет большую терапевтическую широту и относится к классу нетоксичных веществ. Полученные данные позволяют сделать вывод, что соединение ГИЖ298 перспективно для дальнейших исследований с целью создания инновационного противосудорож-ного средства.
7. Favale E., Rubino V., Mainardi P., Lunardi G. and Albano C. Anticonvulsant effect of fluoxetine in humans, Neurology October. 1995; 45: 10: 1926-1927
8. KochharM.M., Brown R.G., Delgado J.N. Anticholinergic heterocyclic ketoximino-ethers and —esters. J. Pharm. Sci. 1965; 54: 393-398.
9. Воронина Т.А., Неробкова Л.Н. Методические указания по изучению противосудорожной активности фармакологических веществ. «Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств» Часть.1. ФГБУ «НЦЭМСП». М.: Изд-во Гриф и К, 2012; 14: 235—250.
10. Loscher et al. The role of technical, biological and pharmacological factors in the laboratory evaluation of anticonvulsant drugs. II. Maximal electroshock seizure models, Epilepsy Res. 1991; 8: 79—94.
11. Swinyard E.A. Laboratory evaluation of antiepileptic drugs. Review of laboratory methods, Epilepsia. 1969; 10: 107—119.
12. Loscher et al. The role of technical, biological and pharmacological factors in the laboratory evaluation of anticonvulsant drugs. III. Pentylenetetrazol seizure models. Epilepsy Res. 1991; 8: 171 — 189.
