CC BY
44
краткие сообщения
УДК: 616-006:577.27
новое моноклональное антитело для детекции опухоль-ассоциированного белка pmepa1
В.В. Волкоморов1,2, Е.С. григорьева1,2, М.С. Карбышев3, И.В. Митрофанова4,
Е.В. Кайгородова1,2, Н.В. Чердынцева1,2
ФГБУ «НИИ онкологии» СО РАМН, г. Томск1 Национальный исследовательский Томский государственный университет, г. Томск2 Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск3 Международный биотехнологический центр «Генериум», Владимирская обл.,
Петушинский р-н, пос. Вольгинский4 634050, г. Томск, пер. Кооперативный, 5, e-mail: grigorieva@oncology.tomsk.ru1
Получено новое моноклональное антитело (мкАТ) к опухоль-ассоциированному белку PMEPA1 (Prostate Transmembrane Protein, Androgen Induced 1), для которого показана дифференциальная экспрессия в ряде опухолей. Для тестирования специфичности нового мкАТ нами получен полноразмерный рекомбинантный белок PMEPA1 в трансфецированной клеточной линии Hек293T. После трансфекции плазмидным вектором pIRES-EGFP, содержащим вставку гена PMEPA1, проводили оценку экспрессии белка PMEPA1 в клетках линии HEK293T с помощью иммуноцитохимического исследования и вестерн-блот анализа. Способность нового мкАТ связывать PMEPA1 в клиническом материале показана с помощью иммуногистохимического исследования на срезах ткани простаты, как положительного контроля. Новое антитело может послужить основой для создания коммерческого антитела для тестирования белка PMEPA1 в биологических образцах человека.
Ключевые слова: PMEPA1, моноклональные антитела, экспрессия, белковые маркеры
NEW MONOCLONAL ANTIBODY FOR TUMOR-ASSOCIATED PROTEIN PMEPA1 DETECTION V.V. Volkomorov12, E.S. Grigoryeva12, M.S. Karbyshev3, I.V. Mitrofanofa4,
E.V Kaigorodova 12, N.V Cherdyntseva1,2 Cancer Research Institute of Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, Tomsk1 National Research Tomsk State University, Tomsk2 Siberian State Medical University, Tomsk3 International Biotechnology Center «Generium», Petushinski district, Volginsky village4 5, Kooperativny Street, 634050-Tomsk, Russia, e-mail: grigorieva@oncology.tomsk.ru1
We obtained a new monoclonal antibody (mAb) against tumor-associated protein PMEPA1 (Prostate Transmembrane Protein, Androgen Induced 1) for which is shown differential expression in some tumors. To test the specificity of obtained mAb we have produced a full-length recombinant PMEPA1 in transfected HEK293T cell line. After transfection of the plasmid vector pIRES-EGFP, containing the insertion coding PMEPA1 gene we evaluated PMEPA1 protein expression in HEK293T cells lines by immunocytochemical study and western-blot analysis. Ability of the new mAb binds PMEPA1 in clinical specimens is shown by immunohistochemistry on histological sections of prostate tissue used as positive control. New antibody may provide a basis for development of commercial antibody test for evaluation of protein expression in human biological samples.
Key words: PMEPA1, monoclonal antibodies, expression, protein markers.
PMEPA1 (Prostate Transmembrane Protein, белком, обратившим на себя внимание исследова-
Androgen Induced 1) является трансмембранным телей в связи с его вовлеченностью в сигнальный
путь трансформирующего фактора роста в (TGF-P) [2, 8]. Сигнальный путь TGF-P играет ключевую роль в процессах клеточного роста, дифференци-ровки, апоптоза, вовлечен в регуляцию иммунного ответа, формирование злокачественных опухолей и их метастазирование. TGF-P функционирует как промотор опухолевой прогрессии путем индукции эпителиально-мезенхимального перехода, в результате которого опухолевые клетки приобретают способность к метастазированию [7]. Механизмы, лежащие в основе рецепторной активации и экспрессии генов, вовлеченных в сигнальные пути гена TGF-[І широко освещены в литературе [12]. Одним из белков, чья экспрессия непосредственно индуцируется в результате активации TGF-P сигнального пути, является РМЕРА1 [2]. Кроме того, известно, что РМЕРА1 может непосредственно связываться с молекулами R-Smad (Smad 2 и 3), которые являются посредниками в передаче сигнала от молекулы рецептора TGF-P в ядро, тем самым блокируя трансдукцию сигнала [14, 15].
Анализ имеющихся в литературе данных о функции белка РМЕРА1 определил его важное значение в процессах пролиферации и дифференци-ровки ряда тканей эпителиального происхождения, что позволило говорить о роли РМЕРА1 в развитии злокачественных новообразований различных локализаций. Существующие разрозненные данные свидетельствуют в пользу весьма неоднозначной роли данного белка в онкогенезе, требующей более детального уточнения. Повышенная экспрессия гена РМЕРА1 в опухолевой ткани отмечается у больных раком почки, легкого, толстой кишки, поджелудочной железы, яичников и молочной железы [2, 3, 7, 10]. При сравнении полнотранскрип-томных профилей инвазивных опухолей простаты с нормальными тканями (или преинвазивными опухолями) было обнаружено, что РМЕРА1 высоко экспрессируется в тканях опухолей, склонных к инвазивному росту. Соответственно, повышение его экспрессии ассоциировано с плохим прогнозом клинического течения заболевания [14]. В то же время другие авторы, исследующие роль РМЕРА1 при раке простаты, приводят данные об увеличении вероятности прогрессии заболевания при снижении экспрессии РМЕРА1 [6]. Вероятно, критическую роль при этом играют изменения рецепторного аппарата к андрогенам, которые наряду с TGF-P напрямую регулируют экспрессию РМЕРА1 в ткани
простаты. Исходя из того, что существуют некоторые органоспецифичные особенности характера экспрессии PMEPA1, необходимо уточнение его роли при каждой отдельной локализации злокачественного процесса.
Согласно нашим данным, PMEPA1 является потенциальным маркером аденокарциномы желудка интестинального типа, что было установлено на основании проведенного биоинформатического поиска генов, обладающих более высокой экспрессией в опухоли по сравнению c неизмененной тканью [4, 5, 13]. Повышенная экспрессия гена PMEPA1 в опухолевой ткани желудка была подтверждена нами на собственной коллекции парных образцов нормальной и опухолевой ткани, полученных от больных с аденокарциномой желудка при операции. Наши данные подтверждают результаты других авторов о повышении генной экспрессии PMEPA1 в аденокарциномах желудка [10].
В имеющейся литературе нам не удалось обнаружить информацию по исследованию белковой экспрессии PMEPA1 в операционном клиническом материале, а соответственно, и о коммерчески доступных антителах, обладающих специфичностью для достоверной детекции PMEPA1 в тканях. В то же время проведенные нами предварительные исследования показали неэффективность использования ряда коммерческих антител для детекции PMEPA1 в экстрактах тканей и на гистологических срезах.
Это обусловило актуальность получения высокоспецифичных антител к PMEPA1, которые бы могли детектировать этот белок в клинических образцах биологического материала.
Цель исследования: получение нового моноклонального антитела к опухоль-ассоциированному белку PMEPA1 и подтверждение его специфичности.
Материал и методы
Получение гибридов мкАТ против PMEPA1. В качестве антигена при иммунизации крыс использовался синтетический пептид 275WSKEKDKQKGHPL287, конъюгированный с бычьим сывороточным альбумином и овальбуми-ном (PSL, Германия). Подкожная и внутрибрю-шинная иммунизация проводилась смесью 50 мкг пептида, 500 мкл фосфатно-солевого буфера и 500 мкл неполного адъюванта Фрейда (НАФ), содержащей 5 nM CpG олигонуклеотода (Tib Mol-biol, Германия). Спустя шесть недель проводилась
У4
повторная иммунизация раствором, не содержащим НАФ. Гибридизация лимфоцитов проводилась по стандартной методике [11]. мкАТ, показывающие специфическую активность против PMEPA1, подвергались дальнейшему анализу с помощью иммуноблота.
Очистка полученных мкАТ. Перед нанесением образца сорбент уравновешивали фосфатносолевым буфером (5 объемов хроматографической колонки), рН 7,2-7,4 до выхода оптической плотности, проводимости и рН на постоянные значения. Культуральную жидкость наносили на сорбент MabSelect Sure со скоростью 0,25 мл/мин. По окончании нанесения сорбент промывали стартовым буфером (5 объемов хроматографической колонки) со скоростью 0,5 мл/мин. Белок элюировали буфером, содержащим 50 мМ CH3COONa и 100 мМ L-Арг, pH 2,8, который подавали на колонку реверсивным током. Фракцию, содержащую целевое мкАТ, собирали в стерильный флакон и доводили рН до 6,5-7,0 раствором 2М Tris.
Получение рекомбинантного белка PMEPA1 в культуре клеток линии HEK293T. Полноразмерный ген PMEPA1 амплифицировали с использованием специфических праймеров, в состав которых вводили сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции Nhe1 и EcoR1 и клонировали в плазмиду pIRES-EGFP (Clontech, США). Трансфекция проводилась кальций-фосфатным методом.
Иммуноблотинг. Клеточные лизаты подвергали электрофоретическому разделению по методу Лэммли в градиентном полиакриламидном геле (10-20 %). После разделения белки подвергали электропереносу на поливинил-дифторидную мембрану Immobilon-P Transfer Membrane (Millipore, США), используя Mini Trans-Blot transfer cell (Bio-Rad, США) в соответствии с рекомендациями производителя. При исследовании образцов специфическую реакцию определяли на пленке для выявления хемолюминесценции с помощью ECL Plus Western Blotting Detection System.
Иммуноцитохимическое исследование. Способность полученных мкАТ к связыванию белка PMEPA1 была проанализирована с помощью иммуноцитохимии. Клетки, выращенные на покровных стеклах, промывали фосфатно-солевым буфером. Фиксация и пермеабилизация проводились абсолютным ацетоном при -20°C в течение 5 мин. В качестве вторичных антител использовали
овечьи антитела к IgG кролика, конъюгированные с родамином в разведении 1:300. Визуализация проводилась с помощью флуоресцентного микроскопа Axioimager Z1 с системой для улучшения контрастности ApoTome (Carl Zeiss, Германия). Изображения регистрировали с помощью камеры AxioCam MRm (Carl Zeiss, Германия).
Иммуногистохимическое исследование. В качестве материала для тестирования использовали депарафинизированные срезы тканей рака простаты 2 пациентов. Операционный материал фиксировали 10 % формалином, забуференным фосфатным буфером в течение 24 ч. Связавшиеся антитела выявляли, используя козьи антитела против первичных антител, конъюгированные с пероксидазой хрена, в разведении 1:100, раствор которых наносили на срезы на 30 мин. Для визуализации специфической реакции использовали Liquid DAB (Dako, Дания).
Результаты и обсуждение
Получение мкАТ, обладающих специфичностью к опухоль-ассоциированному белку PMEPA1. Первоначально PMEPA1 был идентифицирован как ген, экспрессия которого находится под контролем стероидных гормонов в ткани предстательной железы [16]. Основной белковый продукт гена PMEPA1 содержит 287 аминокислотных остатков, являясь самой длинной формой, состоит из экстрацеллюлярного домена (40 аминокислот), трансмембранного домена (28 аминокислот) и длинного цитоплазматического «хвоста» (227 аминокислот) (рис. 1).
Для получения специфичных к PMEPA1 мкАТ нами был выполнен поиск участков локализации антигенных детерминант, топологически наиболее доступных для взаимодействия антител с выявленным мембранным белком. В качестве антигена использовался синтетический пептид 275WSKEKDKQKGHPL287, представляющий собой C-концевую цитоплазматическую часть белка PMEPA1 (рис. 1). Полученные мкАT были очищены с помошью сорбента MabSelect (GE Healthcare. США) и протестированы на способность специфически связывать рекомбинантный белок PMEPA1 в лизатах клеток линии Hek293T, транзиентно экпрессирующих PMEPA1 (рис. 2).
Тестирование специфичности полученных мкАТ против белка PMEPA1. Клетки линии Hek293T трансфецировали экспрессионным векто-
МИРЬМСУМЭТ АААААСОРМУ ЗСТСМСКРБЬ Р05МЕ1ТЕ1.Е FVQIIІIVW ММ\/М\ЛЛ/1ТС
Щ^НУКиЗАР ЗПЭРНЗСЮП RREDALSSEG СЬ^РЭЕЗТУЗ С^РЕРСЛ/У APPRPTDRLA
УРРРАОКЕКР НИРОРТУРУ!. ОНЕЮЬРРП Э1.50СЕЕРРР УОСРСТЮН* 0РЕСЮ1.Е1.№
Е5УРАРР1МРТ 1РС)501М05А RLGGPCPPSS МЗаЭАТСУС БССРМЕСРРР ТУЗЕУЮНУР
ОЗЗРОНСШЭ ОРРБЬЬЕСТР ШНТН1АР1_Е БАА^КЕКР КОКСНРЬ
Рис. 1. Аминокислотная последовательность канонической формы РМЕРА1, синтезированный фрагмент выделен жирным шрифтом
А сг1$п
Рис. 2. Схема строения экспрессионной плазмиды pIRES-EGFP-PMEPA1
Рис. 3. Результат вестерн-блот анализа лизата трансфецированных клеток линии Нек293Т различным количеством экспрессионного вектора
ром pIRES-EGFP, содержащим вставку, кодирующую полноразмерный белок РМЕРА1, после чего лизировали RIPA буфером. Методом вестерн-блот
анализа проводили детекцию целевого белка с использованием полученных мкАТ. На рис. 3 видно, что мкАТ, помимо связывания с двумя изоформами
У6
Рис. 4. Иммуногистохимическое исследование экспрессии белка РМЕРА1 в ткани простаты с использованием полученных мкАТ, х200
РМЕРА1, специфически связывают белок, молекулярная масса которого приблизительно равна 65 кЛа. Вероятно, этот бэнд соответствует димерной форме белка РМЕРА1. В литературе нет достоверных сведений о функциональной димеризации РМЕРА1, однако известно, что другие мембранные белки, имеющие сходную структуру, обладают такой способностью [1].
Способность полученных антител распознавать целевой белок в клетках линии НЕК293Т оценивали с помощью метода иммуноцитохимии. Визуализацию проводили с помощью антивидовых конъюгатов, меченных родамином. Трансфецированные клетки, содержащие генетическую конструкцию pIRES-EGFP-PMEPA1, характеризовались более высоким уровнем флуоресценции, по сравнению с нетрансфецированными контрольными клетками. В иммуноцитохимическом исследовании мкАТ выявляют цитоплазматическую локализацию белка РМЕРА1.
Для оценки специфичности и пригодности применения полученных мкАТ для детекции РМЕРА1 в клинических образцах нами был использован иммуногистохимический анализ срезов ткани из парафиновых срезов (рис. 4). В качестве положительного контроля, то есть ткани, имеющей стабильно высокую экспрессию белка РМЕРА1, была выбрана нормальная ткань простаты [16]. Из рис. 4 видно, что наблюдается выраженная ядерноцитоплазматическая экспрессия РМЕРА1. Локализация белка РМЕРА1 в непосредственной близости от аппарата Гольджи, которая визуализируется как ядерно-цитоплазматическое окрашивание, отмечалась и в исследованиях экспрессии РМЕРА1 в других типах тканей [9].
Заключение
Нами получено новое моноклональное антитело против опухоле-ассоциированного белка РМЕРА1, вовлеченного в TGF-P сигнальный путь, играющего важную роль в процессе эпителиально-
мезенхимального перехода. Полученные мкАТ обладают достаточной чувствительностью для детекции PMEPA1 в клиническом материале и выявления особенностей его экспрессии в различных тканях. Новое антитело может послужить основой для создания коммерческого антитела для тестирования белка PMEPA1 в биологических образцах человека.
ЛИТЕРАТУРА
1. BrennanPJ., Kumagai T., BerezovA.,MuraliR., GreeneM. HER2/ Neu: mechanisms of dimerization/oligomerization // Oncogene. 2002. Vol. 21 (2). P. З28. doi: 10.1038/sj/onc/1205119.
2. Brunschwig E.B., Wilson K., Mack D., Dawson D., Lawrence E., Willson J.K., Lu S., Nosrati A., Rerko R.M., Swinler S., BeardL., Lutter-baugh J.D., Willis J., Platzer P., Markowitz S. PMEPA1, a transforming growth factor-beta-induced marker of terminal colonocyte differentiation whose expression is maintained in primary and metastatic colon cancer // Cancer Res. Vol. бЗ (7). P. 15б8-1575.
3. Giannini G., AmbrosiniM.I., DiMarcotullioL., CerignoliF, ZaniM., MacKay A.R., Screpanti I., Frati L., Gulino A. EGF- and cell-cycle-regulated STAG1/PMEPA1/ERG1.2 belongs to a conserved gene family and is overexpressed and amplified in breast and ovarian cancer // Mol. Carcinog. 200З. Vol. З8 (4). P. 188-200. doi: 10.1002/mc.10162
4. Grigor'evaE.S., Bukurova Iu.A., Krasnov G.S., Afanas'evS.G., Cher-dyntsevaN.V, Tuzikov S.A., Chomzonov E.L., Karpov VL., Lisitsyn N.A., Beresten' S.F. Identification of proteins overexpressed in malignant gastric tumors: comparison of the results of 2-De and bioinformatics search // Mol. Biol. (Mosk). 2011. Vol. 45 (4). P. 7З8-74З. DOL^m/ 8002б89ЗЗ110З0058.
5. Grigoryeva E.S., Cherdyntseva N.V, KarbyshevM.S., Volkomorov V.V, Stepanov I.V, Zavyalova M.V, Perelmuter V.M., Buldakov M.A., Afanasjev S.G., Tuzikov S.A., Bukurova Y.A., Lisitsyn N.A., Beresten S.F Expression of Cyclophilin A in Gastric Adenocarcinoma Patients and Its Inverse Association with Local Relapses and Distant Metastasis // Pathol. Oncol. Res. 201З. [Epub ahead of print]. doi:10.1007/s12253-00-9718-x.
6. Hirokawa Y.S., Takagi A., Uchida K., Kozuka Y., Yoneda M., Wa-tanabe M., Shiraishi T. High level expression of STAG1/PMEPA1 in an androgen-independent prostate cancer PC3 subclone // Cell Mol. Biol. Lett.
2007. Vol. 12 (З). P. З70-З77. doi: 10.2478/s11658-007-0009-y.
7. Hu Y., He K., Wang D., Yuan X., Liu Y., Ji H., Song J. TMEPAI regulates EMT in lung cancer cells by modulating the ROS and IRS-1 signaling pathways // Carcinogenesis. 201З Vol. З4 (8). P 17б4-1772. doi: 10.1093/carcin/bgt132.
8. Itoh S., Itoh F. Inhibitory machinery for the TGF-p family signaling pathway // Growth Factors. 2011. Vol. 29 (5). P. 1бЗ-17З. doi: 10.З109/08977194.2011.б142Зб.
9. Moul J., Srvastava S., XuL. Patent US 200400924б9 A1. Androgen-regulated PMEPA1 gene and polypeptides. 1З.05.2004.
10. RaeF.K., Hooper J.D., NicolD.L., Clements J.A. Characterization of a novel gene, STAG1/PMEPA1, upregulated in renal cell carcinoma and other solid tumors // Mol. Carcinog. 2001. Vol. З2 (1). P. 44-5З. doi: 10.1002/mc.1063.
11. Rottach A., Kremmer E., Nowak D., Boisguerin P., Volkmer R., CardosoM.C., LeonhardtH., Rothbauer U. Generation and characterization of a rat monoclonal antibody specific for PCNA // Hybridoma (Larchmt).
2008. Vol. 27 (2). P. 91-98. doi:10.1089/hyb.2008.0031.
12. Shi Y., Massagu J. Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus // Cell. 200З. Vol. 11З (6). P. 685-700. doi: http:// dx.doi.org/10.1016/S0092-8674(03)00432-X.
13. Volkomorov V, Grigoryeva E., Krasnov G., Litviakov N., Tsyganov M., Karbyshev M., Zavyalova M., Afa^a^^e"v S., Cherdyn-
tsevaN., LisitsynN., Beresten S. Search for potential gastric cancer markers using miRNA databases and gene expression analysis // Exp Oncol. 2013. Vol. 35 (1). P. 2-7.
14. Vo Nguyen T.T., Watanabe Y., Shiba A., Noguchi M., Itoh S., Kato M. TMEPAI/PMEPA1 enhances tumorigenic activities in lung cancer cells // Cancer Sci. 2014. Vol. 105 (3). P. 334-341. doi: 10.1111/ cas.12355.
15. Watanabe Y., Itoh S., Goto T., Ohnishi E., Inamitsu M., Itoh F, Satoh K., Wiercinska E., Yang W., Shi L., Tanaka A., Nakano N., Mommaas A.M., Shibuya H., Ten Dijke P., Kato M. TMEPAI, a transmembrane TGF-beta-inducible protein, sequesters Smad proteins from active participation in TGF-beta signaling // Mol. Cell. 2010. Vol. З7 (1). P 12З-1З4. doi: 10.1016/j.molcel.2009.10.028.
16. Xu L.L., Shanmugam N., Segawa T., Sesterhenn I.A., McLeodD.G., Moul J.W., Srivastava S. A novel androgen-regulated gene, PMEPA1, located on chromosome 20q0 exhibits high level expression in prostate // Genomics. 2000. Vol. 66 (З). P 257-26З. doi: 10.1006/geno.2000.6214
Поступила 17.04.14
