CC BY
22
УДК 578.282
Новое бисульфитное производное окисленного в-циклодекстрина эффективно ингибирует инфекцию, вызванную вирусом гриппа А in vitro и in vivo
Е. П. Гончарова1*, Я. А. Костыро2, А. В. Иванов2, М. А. Зенкова1
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 630090, Россия, Новосибирск, просп. Академика Лаврентьева, 8
2Иркутский институт химии им. А.Е. Фаворского СО РАН, 664033, Россия, Иркутск, ул.Фаворского,1 *E-mail: egn@niboch.nsc.ru Поступила в редакцию 25.04.2019 Принята к печати 15.07.2019 DOI: 10.32607/20758251-2019-11-3-20-30 РЕФЕРАТ Разработка противогриппозных препаратов представляет актуальную и важную задачу. Ранее проведенные исследования показали, что соединения на основе сульфопроизводных олиго- и полисахаридов обладают высокой противовирусной активностью. Нами изучены перспективы использования нового бисульфитного производного окисленного Р-циклодекстрина (соединение KS-6469) для подавления репликации вируса гриппа A/WSN/33 (H1N1) in vitro и in vivo. Противовирусный потенциал KS-6469 in vitro оценивали в культуре клеток МДСК, инфицированных вирусом. Показано, что инкубация инфицированных клеток в присутствии соединения KS-6469 в течение 48 ч приводит к полному подавлению репродукции вируса. Терапевтическая эффективность KS-6469 проверена на модели гриппозной пневмонии у мышей линии BALB/c. Двукратное интраназальное введение KS-6469 обеспечивало полную защиту животных от заражения вирусом, что сопровождалось значительным снижением титров вируса гриппа в легких инфицированных животных. Таким образом, новое бисульфитное производное Р-циклодекстрина KS-6469 обладает выраженной противовирусной активностью и эффективно подавляет развитие гриппозной инфекции.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА вирус гриппа, противовирусная активность, сульфированное производное Р-цикло-декстрина.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВГ - вирус гриппа; ДМСО - диметилсульфоксид; ИМДМ - среда Искова МДМ; МРЦД - метил-Р-циклодекстрин; МТТ - 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид; MOI -множественность заражения; МЭК - минимально эффективная концентрация; МПК - максимально переносимая концентрация; РГА - реакция гемагглютинации; ФСБ - фосфатно-солевой буфер; ФОЕ - фокус-образующие единицы; ХТИ - химиотерапевтический индекс; HA - гемагглютинин; IC50 - концентрация соединения, приводящая к гибели 50% клеток; CI - клеточный индекс; NA - нейраминидаза.
ВВЕДЕНИЕ
Вирус гриппа (ВГ) вызывает развитие респираторных заболеваний, в результате которых ежегодно умирает до 500 000 человек [1]. Возникновение новых лекарственно устойчивых штаммов вируса гриппа и недостаточная эффективность существующих вакцин делают необходимой разработку новых, более эффективных противовирусных соединений для борьбы с этим вирусом.
Одними из наиболее перспективных противовирусных соединений являются сульфопроизводные
углеводов. Эта группа соединений включает суль-фопроизводные олиго- и полисахаридов, содержащих O-сульфатные и/или N-сульфонатные группы. Противовирусные свойства сульфопроизводных углеводов известны давно. Гинзберг и соавт. исследовали антивирусные свойства капсульного полисахарида Klebsiella pneumoniae и показали, что этот полисахарид эффективно подавляет репликацию вируса эпидемического паротита [2]. Сообщалось, что сульфатированные полисахариды, включая ß-циклодекстрин, обладают противовирусной ак-
тивностью в отношении целого ряда вирусов [3-7]. Имеются данные о том, что сульфопроизводные оли-го- и полисахаридов, содержащих О-сульфатные группы, обладают высокой противовирусной активностью [8-11]. Показано, что синтетические полимеры N-сульфонатных производных эффективно ингибируют вирус гриппа A in vitro и ex vivo, действуя главным образом на поздних стадиях развития инфекции [12]. Примечательно, что йота-карраги-нан - сульфатированный полисахарид, протестирован клинически, разрешен к выпуску и продается в некоторых странах для интраназального применения при гриппозной инфекции [13]. Однако данные об антивирусной активности сульфопроизводных углеводов, содержащих сульфонатные группировки (С-сульфаты), отсутствуют.
Нами изучены противовирусные свойства суль-фонированного (C-сульфат) олигосахарида - би-сульфитного производного окисленного Р-цикло-декстрина KS-6469 в отношении вируса гриппа A/WSN/33 (H1N1) (ВГ) in vitro и in vivo. Показано, что KS-6469 эффективно ингибирует репликацию ВГ в клетках МДСК, действуя на поздних стадиях инфекции, и обладает вирулицидными свойствами. Результаты лечения гриппозной пневмонии у мышей подтвердили высокий антивирусный потенциал этого соединения.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Синтез соединения KS-6469
Соединение KS-6469 было разработано и синтезировано в Иркутском институте химии им. А.Е. Фаворского СО РАН (патент РФ 2635765, 2017) на основе коммерчески доступного Р-циклодекстрина (KLEPTOSE®, Бельгия). Подробное описание процедуры синтеза и физико-химических свойств KS-6469 будет опубликовано отдельно. Коммерчески доступный осельтамивир (Тамифлю®, Швейцария) готовили в виде раствора в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) для перорального введения.
Цитотоксическое действие KS-6469 в культуре клеток МДСК
МТТ-анализ. Цитотоксичность KS-6469 оценивали с использованием теста 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ-тест) как описано ранее [14]. Клетки МДСК получены из коллекции клеточных культур Института цитологии (Санкт-Петербург, Россия). Клетки культивировали в среде Искова МДМ (ИМДМ) (Sigma, США) с добавлением 5% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (Sigma, США), 100 Ед/мл пеницил-
лина, 100 мг/мл стрептомицина и 0.25 мг/мл амфо-терицина (антибиотик-антимикотический раствор, Sigma, США) при 37°C в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO2 (стандартные условия). Клетки МДСК высевали в 96-луночные планшеты и инкубировали в стандартных условиях до формирования полного монослоя. Затем питательную среду заменяли свежей средой, содержащей KS-6469 в различных концентрациях, и клетки инкубировали в течение 24 ч в стандартных условиях. Аликвоты раствора МТТ добавляли в каждую лунку, инкубировали в течение 3 ч, затем кристаллы формазана солюбилизировали диметилсульфоксидом (ДМСО) и измеряли оптическую плотность при 570 нм с использованием ридера MultiskanTM FC (Thermo LabSystems, Финляндия). Концентрацию соединения, приводящую к гибели 50% клеток (IC50), определяли как концентрацию, необходимую для снижения значения оптической плотности до 50% от контроля (только ДМСО).
Анализ цитотоксичности KS-6469 в реальном времени. Цитотоксическое действие KS-6469 на клетки МДСК измеряли с помощью технологии микроэлектронного биосенсора на приборе xCELLigence Real-Time (ACEA Biosciences Inc., США). Клеточный индекс (CI) рассчитывается автоматически на основании изменения параметров сопротивления при взаимодействии обработанных и необработанных клеток с электродами на микроэлектронных планшетах (E-планшеты). Клетки высевали в E-планшеты (ACEA Bioscience Inc., США) в среде ИМДМ и инкубировали в течение ночи (20 ч) в стандартных условиях. Затем питательную среду удаляли, клетки промывали ФСБ и в каждую лунку добавляли 150 мкл среды ИМДМ, содержащей различные концентрации KS-6469 или среду (контроль). Клетки инкубировали в стандартных условиях в течение 65 ч, а жизнеспособность клеток контролировали каждые 15 мин с использованием анализатора xCELLigence RealTime. Эксперименты повторяли 2 раза, а концентрацию соединения, приводящую к гибели 50% клеток (IC50), рассчитывали с использованием программного обеспечения xCELLigence Real-Time Cell Analyzer. Максимальную концентрацию соединения, при которой график изменения CI совпадал с графиком CI для необработанных клеток, т.е. не оказывающую на клетки токсичного действия, принимали за максимально переносимую концентрацию (МПК).
Изучение противовирусной активности KS-6469 в культуре клеток МДСК
Штамм вируса гриппа A/WSN/33 (H1N1) был получен в Институте вирусологии им. Д.И. Ивановского.
Клетки МДСК выращивали в стандартных условиях в 24-луночных планшетах до формирования полного монослоя. Затем клетки инфицировали ВГ при множественности заражения (MOI) 0.1 в среде ИМДМ, содержащей KS-6469 (70-600 мкг/мл), и инкубировали при 37°C в течение 24 или 48 ч в стандартных условиях. Через 24 или 48 ч клетки подвергали одному циклу замораживания/оттаивания (-20/20°C), а затем определяли титр вируса с использованием метода оценки титра вируса по количеству фокус-образующих единиц (ФОЕ/мл), описанному ранее [15]. Основными критериями оценки эффективности препаратов in vitro были следующие показатели: коэффициент ингибирования (Ки, %) и химиотера-певтический индекс (ХТИ). Снижение уровня накопления вируса под влиянием соединения определяли по формуле:
Ки = (Тк - То)/Тк х 100%,
где Тк - уровень накопления вируса при культивировании без внесения в среду изучаемого соединения (ФОЕ/мл); То - уровень накопления вируса при культивировании с внесением в питательную среду изучаемого соединения (ФОЕ/мл) [16]. За величину ХТИ препарата принимали соотношение ХТИ = МПК/МЭК, где МЭК - минимально эффективная концентрация соединения, снижающая титр вируса не менее чем на 2 lg ФОЕ/мл [17].
Метод Time-of-addition
Для более точной оценки влияния KS-6469 на различные стадии жизненного цикла ВГ клетки МДСК выращивали до формирования полного монослоя в 24-луночных планшетах в стандартных условиях и инфицировали ВГ (MOI 0.1) в течение 1 ч. После каждого периода инкубации с ВГ клетки промывали ФСБ и добавляли соединение KS-6469 в концентрации 5 мг/мл в разные промежутки времени до или после инфицирования клеток ВГ. Через 48 ч клетки подвергали одному циклу замораживания/ оттаивания и определяли титр вируса.
Анализ активности нейраминидазы ВГ
Активность нейраминидазы ВГ (NA) измеряли с использованием набора для анализа функциональной активности нейраминидазы гриппа NA-Fluor™ (Applied Biosystems, США) в соответствии с протоколом производителя. Анализ основан на измерении активности NA, расщепляющей субстрат 2'-(4-метилумбеллиферил)-а-D-N-ацетилнейраминовой кислоты (MUNANA) с высвобождением флуоресцентного продукта 4-метилумбеллиферона. Флуоресцентный сигнал
измеряли с использованием флуоресцентного ри-дера CLARIOstar® (BMG LABTECH, Германия). Эксперименты выполняли в трех повторах.
Анализ гемагглютинирующей активности вируса
Противовирусную активность соединения KS-6469 исследовали по ингибированию инфекционного титра вируса в реакции гемагглютинации (РГА). Результаты оценивали, сравнивая значения титра вируса после инкубации ВГ с KS-6469 в различных концентрациях. В РГА использовали 0.5% взвесь эритроцитов цыпленка. За титр вируса принимали величину, противоположную значению наибольшего разведения вируса, способного вызвать положительную РГА.
Анализ содержания холестерина
Концентрацию холестерина в вирусных оболочках определяли с использованием набора Amplex Red Cholesterol (Molecular Probes, США) в соответствии с инструкциями производителя. ВГ инкубировали с KS-6469 в различных концентрациях в течение 6 ч при 37°С, затем осаждали и ресуспен-дировали в реакционном буфере Amplex Red. Mетил-ß-циклодекстрин (MßЦД) использовали в качестве положительного контроля. Затем уровень флуоресценции анализировали на ридере CLARIOstar®, используя длину волны возбуждения 550 нм и длину волны излучения 590 нм. Эксперименты были выполнены в трех повторах.
Изучение вирулицидной активности KS-6469
ВГ инкубировали с равным объемом среды, содержащей различные концентрации KS-6469, в течение 3 или 6 ч при 4, 20 или 37°С. В качестве контроля ВГ инкубировали с равным объемом среды, не содержащей KS-6469. Титр вируса оценивали методом ФОЕ. Эксперименты выполняли в трех повторах
Иммуноферментный анализ
Иммуноферментный анализ проводили с использованием коммерчески доступных моноклональных антител, связывающихся с гемагглютинином ВГ (H1N1) [IVC102], [1.B.408] и [B219M] (Abcam), как описано ранее [18].
Изучение эффективности применения KS-6469 на модели гриппозной пневмонии мышей
Лабораторные животные. Самки мышей BALB/c в возрасте от 4 до 6 недель приобретены в Государственном научно-исследовательском центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» (Кольцово, Российская Федерация). Животных со-
держали в виварии Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН с режимом естественного освещения на стандартном рационе для лабораторных животных (ГОСТ Р 5025892) в соответствии с международными рекомендациями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях [19], а также правилами лабораторной практики при проведении доклинических исследований в российских государственных стандартах (Р 51000.3-96 и 51000.4-96). Протоколы экспериментов утверждены Межведомственной комиссией по биоэтике СО РАН (22.11 от 30.05.2014 г.).
Токсичность KS-6469 для мышей. Токсичность KS-6469 для мышей оценивали при внутрибрю-шинном и интраназальном введении соединения. Каждая из экспериментальных групп содержала шесть мышей BALB/c. Две группы мышей получали KS-6469 внутрибрюшинно однократно в дозе 250 или 500 мг/кг в 0.2 мл ФСБ. Две другие группы животных получали KS-6469 интраназально, однократно или двукратно с интервалом в 1 день, в дозе 250 мг/кг в объеме 40 мкл. Мыши контрольных групп получали ФСБ по аналогичной схеме. После инъекции или интраназального введения признаки интоксикации, такие, как общее состояние, вес и депрессия центральной нервной системы, оценивали ежедневно в течение 14 дней.
Протективная активность соединения KS-6469. Протективное действие соединения KS-6469 оценивали по динамике падения массы тела, выживаемости мышей после заражения и репродукции вируса в легких. Мыши BALB/c были разделены на группы по шесть животных. Мышей анестезировали путем внутрибрюшинной инъекции три-бромэтанола (Avertm®). Мышей инфицировали интраназально вирусом в дозе 3 ЛД50, эквивалентной 1.2 Х104 ± 0.7 х 104 ФОЕ (р < 0.05), в объеме 30 мкл сразу после интраназального введения KS-6469 в дозе 250 мг/кг в объеме 30 мкл. На следующий день мыши получали интраназально такую же дозу KS-6469. В качестве положительного контроля группа мышей получала перорально осельтамивир ежедневно (7.5 мг/кг) в течение 5 дней после заражения. Мыши из контрольной группы без лечения получали ФСБ по аналогичной схеме (отрицательный контроль). Животных осматривали и взвешивали ежедневно в течение 14 дней после заражения. Для оценки репродукция ВГ в легких мышам BALB/c (п = 6) интраназально вводили KS-6469 в различных дозах и инфицировали дозой вируса 3 ЛД50. На следующий день мыши получали такую же
дозу KS-6469 интраназально. Мыши из контрольной группы получали ФСБ по аналогичной схеме. Мышей в каждой группе подвергали эвтаназии через 72 ч после заражения и извлекали легкие. Легкие гомогенизировали с использованием ультразвукового гомогенизатора Sonopuls HD 2070 (Bandelin, Германия). Титр вируса в гомогенатах легких определяли методом ФОЕ.
Статистический анализ
Данные выражали как среднее значение ± стандартное отклонение. Статистический анализ проводили с использованием непарного {-критерия Стьюдента. Значения р менее 0.05 считали статистически значимыми.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Характеристика KS-6469
KS-6469 представляет собой бисульфитное производное окисленного олигосахарида (Р-циклодекстрина), имеющее в своем составе сульфонатные группировки, связанные непосредственно с атомом углерода (С-сульфаты), общей формулой [(Ших)7-Сх]-^О^а)х, где [^1их)7-Сх] - окисленный Р-циклодекстрин, х - количество сульфированных атомов углерода, SO3R - бисульфитная (сульфонат-ная) группировка. Структура и физико-химические свойства KS-6469 являются предметом дальнейших исследований и будут опубликованы позже.
Изучение цитотоксического действия KS-6469
Цитотоксические свойства KS-6469 в отношении клеток линии МДСК изучали с помощью МТТ-теста и анализа состояния клеток в реальном времени, позволяющего регистрировать токсическое действие соединений в динамике. По данным МТТ-теста концентрация KS-6469, при которой выживает 50% клеток в популяции, через 24 ч экспозиции = 15 ± 3.3 мг/мл (рис. 1А). Исследование цитоток-сического действия изучаемого соединения при более длительном его воздействии на клетки (в течение 65 ч) с использованием анализатора клеток xCELLigence показало, что в этом случае 1С50 равно 8.9 ± 1.3 мг/мл (рис. 1Б). Концентрация, не оказывающая на клетки токсичного действия (МПК), составила 2.5 мг/мл. Другими словами, соединение KS-6469 обладает низкой токсичностью в отношении культуры клеток МДСК.
Изучение противовирусной активности KS-6469 в культуре клеток
Противовирусную активность KS-6469 оценивали, используя модель вирус гриппа A/WSN/33/ -
Л
X 100
m
i* 80
о к,
¡5 о ¡Ó « £ * 60 40
л о
о К 20
5 10 15
Концентрация KS-6469, мг/мл
—-10 мг/мл -^-5 мг/мл -^2.5 мг/мл ~ —1.25 мг/мл --Контроль
20
20.0 40.0
Время наблюдения, ч
60.0
/6
О
е
а,
и
р и
m
р
5 4
3 -2
0 70 150300 600 24 ч
0 70 150300 600 48 ч
KS-6469, мкг/мл
Рис. 2. К^-6469 эффективно ингибирует репродукцию вируса гриппа A/WSN/33 (Н1Ж) в клетках МДСК. Инфицированные клетки МДСК инкубировали с различными концентрациями ^-6469. Продукцию инфекционных вирусных частиц определяли по методу ФОЕ через 24 и 48 ч. Предел чувствительности метода ФОЕ - 1.7 1д ФОЕ/мл, указан пунктирной линией. *р < 0.05, **р < 0.01 в сравнении с репродукцией вируса в необработанных клетках (0)
7
Б
Рис. 1. Цитотоксичность KS-6469 в культуре клеток МДСК. Клетки МДСК инкубировали с различными концентрациями KS-6469 при 37°С с последующим измерением жизнеспособности клеток с помощью МТТ-теста (А) и с помощью технологии микроэлектронного биосенсора на приборе xCELLigence Real-Time в реальном времени (Б). Контроль - клетки, инкубированные в ИМДМ без KS-6469
клетки МДСК. Клетки МДСК одновременно инкубировали в присутствии различных концентраций KS-6469 и инфицировали вирусом при MOI 0.1. Количественная оценка титра вируса после его инкубации с соединением (рис. 2) в течение 24 ч выявила зависимое от концентрации снижение репликации вируса в диапазоне концентраций KS-6469 70-600 мкг/мл. При концентрации KS-6469 600 мкг/мл через 24 ч после заражения титр вируса был ниже порога чувствительности метода. При инкубации инфицированных ВГ клеток с соединением KS-6469 в концентрации 70 мкг/мл наблюдалось значительное снижение титра вируса Ки = 75% (60.0-80.2%) (р < 0.05). Следует отметить, что при концентрации KS-6469 600 мкг/мл наблюдалось полное подавление вирусной инфекции, так как мы не выявили репродукции вируса через 48 ч после заражения клеток. Таким образом, KS-6469, бисульфитное производное окисленного Р-циклодекстрина, в концентрации выше 70 мкг/мл значительно снижает титр вируса при экспозиции и полностью подавляет
развитие инфекционного процесса при концентрации 600 мкг/мл. Результаты, полученные на модели in vitro, продемонстрировали высокую ингибирующую активность соединения KS-6469 в отношении ВГ. Необходимо отметить, что высокий химиотерапевти-ческий индекс KS-6469, равный 8.3, свидетельствует о целесообразности дальнейшего изучения противовирусной активности этого соединения in vivo.
Для определения механизма ингибирования репродукции ВГ при инкубации с KS-6469 необходимо было установить, на какой стадии жизненного цикла вируса происходит подавление его репродукции. С этой целью был проведен эксперимент Time-of-addition, когда KS-6469 добавляли к клеткам на разных этапах развития вирусной инфекции. Во-первых, мы оценили, может ли KS-6469 при добавлении к клеткам до инфицирования вирусом защитить их от последующей инфекции. Клетки МДСК обрабатывали KS-6469 за 2 ч до заражения ВГ (от (-3) до (-1) ч) (рис. 3). Мы не обнаружили снижения титра вируса после предварительной инкубации клеток с KS-6469. Также не обнаружено снижения титра вируса при использовании KS-6469 на начальных стадиях инфекционного процесса в клетке ((-1)—0 ч) и на ранних стадиях репродукции вируса ((-1)—6 ч). Таким образом, показано, что соединение KS-6469 не влияет на ранние стадии репликации вируса, такие, как прикрепление вириона к клетке, проникновение в клетки-мишени. Ингибирование репродук-
заражение
I-е-1-#-1
-3 -10 6 48 ч
0 (-3)-(-1) (-1)-0 (-1)-6 0-48 6-48 Интервалы времени после заражения, ч
Рис. 3. Эксперимент Time-of-addition, показывающий механизм инактивации вируса гриппа под действием KS-6469. Клетки МДСК инфицировали ВГ при MOI 0.1 в течение 1 ч ((-1)-0 ч), затем в лунки добавляли 5 мг/мл KS-6469 в указанные моменты времени (•). После каждого периода инкубации (показано стрелками) среду, содержащую KS-6469, заменяли свежей средой, не содержащей соединения. Через 48 ч титр вируса оценивали по методу ФОЕ. Указаны средние значения ± S.D. (n = 3). Предел чувствительности метода ФОЕ - 1.7 lg ФОЕ/мл указан пунктирной линией
Таблица 1. Титр вируса гриппа в РГА после инкубации с KS-6469
Соединение Титр вируса и условия инкубации
4°C 37°C
1 ч 6 ч 1 ч 6 ч
KS-6469, 5 мг/мл 64 32 16 4
ФСБ 64 64 64 64
в 16 раз (табл. 1). Интересно, что титр вируса снизился только в 2 раза после инкубации в течение 6 ч при 4°С в присутствии KS-6469 в той же концентрации. Снижение связывания гемагглютинина вируса с эритроцитами предполагает возможное изменение конформации поверхностных эпитопов этого белка.
Способность KS-6469 влиять на структуру поверхностных эпитопов гемагглютинина была проанализирована с использованием набора коммерчески доступных моноклональных антител к гемагглютинину ВГ. Обработка вирионов ВГ KS-6469 (5 мг/мл) в течение 6 ч при 37°С, которая привела к 16-кратному снижению титра НА, не влияла на эффективность связывания НА с моноклональными антителами к НА вируса гриппа (рис. 4). Следует отметить, что процесс ингибирования функциональной активности НА вириона требует достаточно продолжительной инкубации с KS-6469 при температуре не менее 37°С, и мы наблюдали только частичную потерю функциональной активности НА после часовой экспозиции с KS-6469, что свидетельствует о сохранении инфекционных свойств вируса.
ции вируса наблюдалось только тогда, когда KS-6469 постоянно присутствовал в среде, начиная с момента заражения клеток (0-48 ч) или при добавлении соединения через 6 ч после заражения клеток (6-48 ч) (рис. 3).
Влияние KS-6469 на функциональную активность поверхностных белков оболочки ВГ
Проникновение вирусных частиц в клетку обеспечивается согласованной работой основных поверхностных белков оболочки вириона, гликопротеи-нов гемагглютинина (НА) и нейраминидазы ^А). Изменения функциональной активности НА оценивали с использованием модельной системы связывания вирусных частиц с эритроцитами. Вирус гриппа инкубировали с KS-6469 (5 мг/мл) в течение 1 или 6 ч при 37 или 4°С, а затем титр вируса оценивали в РГА (табл. 1). Инкубация вируса с KS-6469 в течение 1 ч при 37°С приводила к снижению титра вируса в 4 раза, а после 6 ч инкубации титр вируса снижался
3.5 3
2.5 2
С 1.5 О.
1
0.5
А.
1.25 2.5
5.0
10
= [KS-6469] мг/мл 20 [MßUa] мг/мл
Рис. 4. Влияние KS-6469 на эффективность связывания вирусного НА с моноклональными антителами. Результаты представлены в О.П. ± S.D., где О.П. -оптическая плотность. Эксперимент проведен в трех повторах
0,
160000 140000 120000 =3100000 оЕ 80000 60000 40000 20000
0
01 0.1 1 10 100 1000 10000
-;-1-'-1-1-' Осельтамивир,
нМ
KS-6469 Осельтамивир
-1-1-г-■-'-> KS-6469, мг/мл
07 0.15 0.3 0.6 1.25 2.5 5
100
а 80
60
40
а 20
Рис. 5. Анализ активности NA. ВГ инкубировали с KS-6469 или осельтамивиром в течение 6 ч перед добавлением субстрата MUNANA, а затем инкубировали в течение 1 ч при 37°C. Результаты представлены в RFU ± S.D., где RFU - relative fluorescence units. Эксперимент проведен в трех повторах
Далее мы изучили возможное ингибирование активности вирусной нейраминидазы при инкубации с KS-6469. Нейраминидаза препятствует агрегации вирусных частиц и обеспечивает их высвобождение из зараженной клетки. Полученные результаты (рис. 5) показали, что инкубация ВГ с KS-6469 (5 мг/мл) не меняет активность NA. Это свидетельствует о том, что NA не является мишенью для KS-6469. Учитывая, что механизм противовирусного действия другого производного ß-циклодекстрина -метил^-циклодекстрина (МßЦД), связан с удалением холестерина из липидной оболочки вирионов ВГ [20], мы проанализировали возможное изменение уровня холестерина в вирусной оболочке после обработки KS-6469. ВГ предварительно обрабатывали KS-6469 и МßЦД (положительный контроль) в различных концентрациях или оставляли без обработки (рис. 6). Снижение содержания холестерина в вирусной оболочке наблюдали только после инкубации ВГ с МßЦД, но не KS-6469. Следовательно, противовирусный эффект KS-6469 не связан с изменением содержания холестерина в вирусной оболочке. Таким образом, мы показали, что KS-6469 частично
25 мг/мл 12.5 мг/мл 10 мг/мл 5 мг/мл
Mßua
KS-6469
Рис. 6. Содержание холестерина в оболочке ВГ после обработки KS-6469 или МРЦД. ВГ инкубировали с различными концентрациями KS-6469 или МРЦД в течение 6 ч при 37°С, уровень холестерина определяли с использованием набора для анализа холестерина Amplex Red Cholesterol. Уровень холестерина в необработанном вирусе принимали за 100%. *р < 0.05. Эксперимент проведен в трех повторах
снижает гемагглютинирующую активность вируса, но не влияет на функциональную активность вирусной NA и не уменьшает содержания холестерина в вирусной оболочке.
Вирулицидные свойства KS-6469
Ранее было показано, что сульфатированные полисахариды обладают вирулицидной активностью [21, 22]. Нами изучена способность KS-6469 непосредственно инактивировать вирус гриппа. Инкубация ВГ с KS-6469 в концентрации 2.5 или 5 мг/мл в течение 3 ч при 37°С привела к полной потере инфекционных свойств вирусных частиц. Снижение концентрации KS-6469 до 1.25 мг/мл с последующей инкубацией вируса в тех же условиях (3 ч, 37°С) привело к снижению титра вируса на 2 ^ ФОЕ/мл, а после инкубации в течение 6 ч инфекционные вирионы не были обнаружены (табл. 2). Инкубация вируса в при-
Таблица 2. Титр вируса (1д ФОЕ/мл) после инкубации вируса гриппа с К^-6469
KS-6469, мг/мл Условия инкубации
4°C 20°C 37°C
3 ч 6 ч 3 ч 6 ч 3 ч 6 ч
0.3 н.о. 5.4 ± 0.1 н.о. 4.9 ± 0.1 н.о. 4.8 ± 0.3
0.6 5.4 ± 0.1 4.9 ± 0.1 5.3 ± 0.1 4.9 ± 0.2 3.9 ± 0.1 1.9 ± 0.3
1.25 4.7 ± 0.3 5.1 ± 0.1 4.8 ± 0.2 4.6 ± 0.2 2.4 ± 0.2 < 1.7
2.5 5.0 ± 0.2 5.3 ± 0.3 4.5 ± 0.2 4.3 ± 0.2 < 1.7 < 1.7
5.0 н.о. 4.9 ± 0.4 н.о. 4.3 ± 0.4 < 1.7 < 1.7
ФСБ 5.1 ± 0.1 5.2 ± 0.2 5.1 ± 0.1 5.0 ± 0.3 4.4 ± 0.3 4.6 ± 0.1
Примечание. «н.о.» - не определяли.
Л
га с
<и
н
и <и
CÛ
241 2016 12 8 4 0
250 мг/кг 500 мг/кг ФСБ
0 2 4 6 8 10 12 Дни после внутрибрюшинного введения KS-6469
14
20
16
г
га" л 12
е
т
с 8
е
CÛ
4
0
однократное введение двукратное введение ФСБ
2 4 6 8 10 12 Дни после интраназального введения KS-6469
14
Рис. 7. Токсичность соединения KS-6469 для мышей. Мыши BALB/c (n = 6) получали KS-6469 в дозе 500 или 250 мг/кг однократно внутрибрюшинно в 0.2 мл ФСБ (А) или 1 или 2 раза интраназально в дозе 250 мг/кг в 40 мкл ФСБ (Б). Представлены средние значения массы тела животных ± S.D. в указанные промежутки времени
сутствии 0.3 мг/мл KS-6469 при 37°С в течение 6 ч не влияла на его инфекционность. Снижение температуры инкубации привело к значительному снижению вирулицидных свойств KS-6469: при инкубации вируса с соединением при 4 или 20°С, снижения ин-фекционности вируса не наблюдалось. Мы предполагаем, что вирулицидный эффект KS-6469 может быть опосредован образованием агрегатов вирусных частиц и соединения, а снижение температуры инкубации может резко уменьшить эффективность образования таких агрегатов.
Изучение противовирусной эффективности KS-6469 на модели гриппозной пневмонии мышей
Токсичность соединения KS-6469 для мышей. Мышам линии BALB/c однократно внутрибрюшинно вводили ^-6469 (250 или 500 мг/кг) в 0.2 мл ФСБ.
Физические параметры и вес животных контролировали ежедневно (рис. 7). Однократное введение соединения в максимальной дозе 500 мг/кг не приводило к снижению веса и изменению общего состояния животных, что указывает на низкую токсичность KS-6469. Мыши, которым двукратно с интервалом 24 ч интраназально вводили KS-6469 (250 мг/кг), теряли вес минимально в течение 2 дней после введения, далее токсических побочных эффектов не наблюдали в течение всего периода наблюдения (рис. 7А и 7Б).
Протективное действие KS-6469. Эффективность KS-6469 против летального заражения ВГ протестировали на модели гриппозной пневмонии мышей. Для оценки репродукции ВГ в легких мышам интраназально вводили KS-6469 в различных дозах и заражали вирусом в дозе, соответствующей 3 ЛД50. На следующий день мыши интраназально получали вторую дозу KS-6469. Мыши группы положительного контроля ежедневно перорально получали осельтамивир (7.5 мг/кг); мыши контрольной группы без лечения получали ФСБ по аналогичной схеме (отрицательный контроль). Через 3 сут в гомогена-тах легких с помощью метода ФОЕ определяли титр вируса (рис. 8А). Из представленных данных видно, что в легких мышей, получавших KS-6469, титр вируса значительно ниже, чем в контрольной группе, что свидетельствует об эффективном подавлении репродукции вируса гриппа в легких мышей после интраназального введения KS-6469 (рис. 8А). На 3-й день в легких мышей, не получавших лечения, титры вируса были на ~ 2.5 lg выше, чем у мышей, получавших KS-6469 и осельтамивир (р < 0.05). Необходимо отметить отсутствие дозозависимого снижения титра вируса в легких мышей, получавших разные дозы KS-6469, что, возможно, связано с механизмом действия этого соединения.
Для сравнения протективных свойств KS-6469 использовали две схемы введения препарата: 1) мышам первой группы однократно интраназально вводили KS-6469 в дозе 250 мг/кг с последующим заражением вирусом (3 ЛД50); 2) вторая группа мышей получала KS-6469 в тех же дозах 2 раза с интервалом в 1 день. В качестве положительного контроля мыши ежедневно перорально получали осельтамивир (7.5 мг/кг), мышам из группы без лечения по аналогичной схеме вводили ФСБ. В течение 14 дней после заражения ежедневно оценивали падение массы тела (количественный клинический признак гриппозной пневмонии) и выживаемость. Показано (рис. 8Б, 8В), что двукратное интраназальное введение KS-6469 приводило к минимальной потере массы тела и обеспечивало полную защиту мышей от заражения, как и введение осельтамивира (100% выживаемость). В группе мышей, получавших KS-6469 однократ-
Б
0
но, показатель выживаемости достигал 66%, и потеря массы тела была минимальной. Значительное падение массы тела у мышей без лечения (до 20%) свидетельствует о развитии тяжелой гриппозной
л
х и к
s I
вм
а0
в р
т и
7 1*
О 1*
6 1*
5 о 1* ♦ □
4 • ■ А ♦
3 ■ S ~О-
2 А
1 « 1 А ♦ а
ФСБ 250 125.5 62.5 31.2 Осельтами-KS-6469, мг/кг вир
20
16
г
а, л 12
е
т
с е 8
В
4
KS-6469 однократное введение KS-6469 двукратное введение Осельтамивир ФСБ
В
as
с
о
м
е
а
в
и
ж
ы
CÛ
100^ 80 60 40 20
4 6 8 10 12 Дни после заражения
- KS-6469 однократное введение
KS-6469 двукратное введение Осельтамивир ФСБ
14
2 4 6 8 10 12 Дни после заражения
14
Рис. 8. Протективное действие соединения KS-6469 при летальном заражении мышей ВГ. А - мышам BALB/c (n = 6) вводили интраназально KS-6469 в указанных дозах и инфицировали 3 ЛД50 ВГ. На следующий день мыши получали вторую дозу KS-6469 интраназально. Через 72 ч определяли титр вируса в легких мышей по методу ФОЕ. Б - изменение массы тела мышей, инфицированных вирусом гриппа и получавших однократно или двукратно интраназально KS-6469 (250 мг/кг), осельтамивир или ФСБ. В - выживаемость мышей BALB/c (n = 6), инфицированных 3 ЛД50 ВГ и получавших однократно или двукратно интрана-зально KS-6469 (250 мг/кг). *р < 0.05 по сравнению с контрольной группой без лечения
пневмонии, которая привела к гибели 84% мышей. Таким образом, полученные нами данные показывают, что лечебно-профилактическое применение соединения КS-6469 в модели гриппозной пневмонии эффективно защищает мышей от летальной гриппозной инфекции.
ОБСУЖДЕНИЕ
Грипп остается одним из самых опасных вирусных заболеваний. На сегодняшний день одобрены только два класса препаратов для лечения гриппа - блока-торы ионных каналов белка М2 и ингибиторы NA [23, 24]. Вакцинация является надежным способом борьбы с гриппозной инфекцией [25], но вирусы гриппа постоянно меняются как в результате случайного накопления мутаций в генах поверхностных белков ге-магглютинина и нейраминидазы, так и в результате реассортации сегментов вирусного генома различных штаммов вируса гриппа, что приводит к снижению эффективности противогриппозных вакцин и терапевтических препаратов. Таким образом, существует острая необходимость в разработке новых подходов к борьбе с гриппом. Одно из возможных решений -разработка противовирусных соединений на основе сульфопроизводных олиго- и полисахаридов, полученных из синтетических или натуральных продуктов. Такие соединения эффективно инактивируют более восприимчивые к ним оболочечные вирусы [3-7]. Ранее было показано, что сульфатированные полисахариды из морских микроводорослей обладают активностью против вирусов без оболочки [26]. Считается, что сульфатированные полисахариды влияют на такие стадии цикла репликации гриппа, как связывание вирусных частиц с рецепторами клеточной поверхности [27], интернализация ви-рионов [28] и высвобождение вируса из клетки [12, 29]. Однако для выяснения механизмов их противовирусного действия требуются дополнительные исследования. Нами исследованы противовирусные свойства нового сульфированного производного Р-циклодекстрина KS-6469. Обнаружено полное подавление репродукции вируса после инкубации инфицированных клеток в течение 24 ч с KS-6469 в концентрации 600 мкг/мл, что указывает на высокий противовирусный потенциал соединения. Для определения механизма противовирусной активности KS-6469 мы оценили эффективность ин-гибирования на разных стадиях жизненного цикла вируса (рис. 3). Оказалось, что KS-6469 не влияет на ранние стадии репликации вируса, однако значительное снижение титра вируса происходило при инкубации инфицированных клеток с KS-6469 в течение длительного времени. Таким образом, мы можем предположить, что KS-6469 влияет на поздние ста-
Б
2
дии развития гриппозной инфекции. Ингибирующий эффект KS-6469 на поздних стадиях инфекции может быть связан с подавлением активности NA, однако мы не обнаружили каких-либо изменений в активности NA после инкубации с KS-6469 (рис. 5). Функциональная активность другого белка вирусной оболочки - гемагглютинина, после инкубации вирусных частиц с KS-6469 в течение 1 ч при 37°С была снижена в 4 раза по сравнению с гемагглютинином необработанного вируса (табл. 1), что не повлияло на эффективность связывания вирионов с рецепторами клеток и не привело к снижению эффективности репродукции вируса. Следует отметить, что инкубация ВГ с KS-6469 не снижала способность НА взаимодействовать с определенными моноклональ-ными антителами к этому белку, что свидетельствует о сохранности антигенных детерминант, к которым направлены эти антитела (рис. 4). Нами показано, что KS-6469 обладает выраженной вирулицидной активностью, способной вызывать полную потерю инфекционности вируса после инкубации с KS-6469 (табл. 2). Вирулицидная активность соединения была максимальной при 37°С, но требовала длительной инкубации, что, в свою очередь, объясняет отсутствие эффекта ингибирования ранних этапов репликации вируса при инкубации клеток с KS-6469 (рис. 3). Экспозиция клеток с KS-6469 в течение первых часов развития инфекционного процесса приводила лишь к частичному снижению инфекционности вируса, явно недостаточной для инактивации всего пула вирусных частиц и, как следствие, полной остановки репликации вируса. Детальный механизм действия KS-6469 находится в процессе изучения, тем не менее, полученные результаты позволяют предположить, что при взаимодействии KS-6469 с вирусными частицами in vitro образуются агломераты, что приводит к значительному снижению инфек-
ционности вируса. Однако этот процесс требует достаточно длительного времени, более 6 ч. Ранее было высказано предположение [21], что именно вирулицидная активность противовирусных препаратов связана с их высокой терапевтической активностью в экспериментах in vivo. Наши данные полностью подтверждают это предположение. Мы показали, что KS-6469 обладает выраженной противовирусной активностью при гриппозной пневмонии у мышей (рис. 8). Интраназальное введение соединения одновременно с заражением мышей летальной дозой ВГ приводило к снижению смертности животных. При однократном введении соединения KS-6469 выжило 66% животных, тогда как его двукратное введение обеспечивало полную защиту от заражения вирусом гриппа. В контрольной группе выжило только 16% мышей, не получавших препарата. Интраназальное применение KS-6469 для лечения зараженных гриппом мышей заметно снижало титр вируса в легких даже при введении низкой дозы KS-6469 (62.5 мг/кг (рис. 8)).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проведенные эксперименты показывают, что KS-6469 - это препарат с низкой токсичностью, который эффективно ингибирует развитие гриппозной пневмонии. Интраназальное применение KS-6469 оказывало противовирусное действие, сопоставимое с действием осельтамивиром. Таким образом, KS-6469 представляется перспективным кандидатом для разработки противовирусного препарата, эффективного для профилактики и лечения гриппозных инфекций.
Работа выполнена при частичной поддержке проекта базового бюджетного финансирования ПФНИ ГАН 2013-2020 № АААА-А17-117020210024-8.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Iuliano D., Roguski K.M., Chang H.H., Muscatello D.J., Palekar R., Tempia S., Cohen C., Gran J.M., Schanzer D., Cowling B.J., et al. // Lancet. 2018. V. 391. P. 1285-1300.
2. Ginsberg H.S., Goebel W.F., Horsfall F.J. // J. Exp. Med. 1948. V. 87. P. 385-410.
3. Moriya T., Saito K., Kurita H., Matsumoto K., Otake T., Mori H., Morimoto M., Ueba N., Kunita N. // J. Med. Chem. 1993. V. 36. P. 1674-1677.
4. Ying C., van Pelt J.F., van Lommel A., van Ranst M., Leyssen P., De Clercq E., Neyts J. // Antivir. Chem. Chemother. 2002. V. 13. P. 157-164.
5. Cardozo F.T., Camelini C.M., Leal P.C., Kratz J.M., Nunes R.J., MendonQa M.M., Simoes C.M. // Intervirology. 2014. V. 57.
P. 375-383. doi: 10.1159/000365194.
6. Hidari K.I., Takahashi N., Arihara M., Nagaoka M., Morita K., Suzuki T. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008. V. 376. P. 91-95. doi: 10.1016/j.bbrc.2008.08.100.
7. Novetsky A.P., Keller M.J., Gradissimo A., Chen Z., Morgan S.L., Xue X., Strickler H.D., Fernández-Romero J.A., Burk R., Einstein M.H. // Gynecol. Oncol. 2016. V. 143. P. 313-318. doi: 10.1016/j.ygyno.2016.09.003.
8. Ikeda S., Neyts J., Verma S., Wickramasinghe A., Mohan P., De Clercq E. // Antimicrob. Agents Chemother. 1994. V. 38. P. 256-259.
9. Fitton J.H. // Mar. Drugs. 2011. V. 9. P. 1731-1760.
10. Tang F., Chen F., Li F. // J. Appl. Polym. Sci. 2012. V. 127. P. 2110-2115.
11. Kim M., Yim J.H., Kim S.Y., Kim H.S., Lee W.G., Kim S.J., Kang P.S., Lee C.K. // Antiviral Res. 2012. V. 93. P. 253-259. doi: 10.1016/j.antiviral.2011.12.006.
12. Ciejka J., Milewska A., Wytrwal M., Wojarski J., Golda A., Ochman M., Nowakowska M., Szczubialka K., Pyrc K. // Antimicrob. Agents Chemother. 2016. V. 60. P. 1955-1966. doi: 10.1128/AAC.02183-15.
13. Eccles R., Winther B., Johnston S.L., Robinson P., Trampisch
M., Koelsch S. // Respir. Res. 2015. V. 16. P. 121. doi: 10.1186/ s12931-015-0281-8.
14. Carmihael J., DeGraff W.G., Gazdar A.F., Minna J.D., Mitchell J.B. // Cancer Res. 1987. V. 47. P. 936-942.
15. Brien J.D., Lazear H.M., Diamond M.S. // Curr. Protoc. Microbiol. 2013. doi:10.1002/9780471729259.mc15d03s31.
16. Крылова Н.В., Леонова Г.Н. // Проблемы вирусологии. 2016. Т. 61. С. 139-144.
17. Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. M.: Медицина, 2005. 832 с.
18. Goncharova E.P., Koroleva L.S., Silnikov V.N., Ternovoy V.A., Vlassov V.V., Zenkova M.A. // J. Mol. Genet. Med. 2011. V. 5. P. 266-272.
19. European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and Other Scientific Purposes. European Treaty Series. 1986. No. 123.
20. Sun X., Whittaker G.R. // J. Virol. 2003. V. 77. P. 12543-12551.
21. Harden E.A., Falshaw R., Carnachan S.M., Kern E.R., Prichard M.N. // Antiviral Res. 2009. V. 83. № 3. P. 282-289. doi: 10.1016/j.antiviral.2009.06.007.
22. Leibbrandt A., Meier C., König-Schuster M., Weinmüllner R., Kalthoff D., Pflugfelder B., Graf P., Frank-Gehrke B., Beer M., Fazekas T., et al. // PLoS One. 2010. V. 5. № 12. E. 14320. doi: 10.1371/journal.pone.0014320.
23. Yen H.L. // Curr. Opin. Virol. 2016. V. 18. P. 126-134.
24. Nakamura S., Miyazaki T., Izumikawa K., Kakeya H., Saisho Y., Yanagihara K., Miyazaki Y., Mukae H., Kohno S. // Open Forum Infect. Dis. 2017. V. 4. ofx129. doi: 10.1093/ofid/ofx129.
25. Lewnard J.A., Cobey S. // Vaccines (Basel). 2018. doi: 10.3390/vaccines6020028.
26. Yim J.H., Kim S.J., Ahn S.H., Lee C.K., Rhie K.T., Lee H.K. // Mar. Biotechnol (NY). 2004. V. 6. P. 17-25.
27. Vives R.R., Imberty A., Sattentau Q.J., Lortat-Jacob H.J. // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. P. 21353-21357.
28. Hashimoto K., Kodama E., Mori S., Watanabe J., Baba M., Okutani K., Matsuda M., Shigeta S. // Antiviral Chem. Chemother. 1996. V. 7. P. 189-196.
29. Wang W., Wu J., Zhang X., Hao C., Zhao X., Jiao G. Shan X., Tai W., Yu G. // Sci. Rep. 2017. V. 7. P. 40760. doi: 10.1038/ srep40760.
