CC BY
22
УДК 577.112.083.3:577.27
НОВАЯ ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ TNF-a В ОБРАЗЦАХ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА
Т.В. Кузнецова, Б.И. Шевелев*, Я.С. Керученько, А.Б. Шевелев
(Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН; e-mail: shevelev@inbi.ras.ru)
Путем экспрессии искусственных генов TNF-a в клетках E. coli в виде тел включения получены полноразмерный TNF-a человека и его укороченная форма, в которой 18 а.о. с N-конца заменены на tag-пептид фага Т7. Отработана методика очистки и ренатурации рекомбинант-ных белков, показана их биологическая активность. Получены поликлональные антитела против TNF-a. Сконструирована тест-система ИФА типа "сандвич" для определения TNF-a с чувствительностью 100 пг/мл. Показана пригодность тест-системы для обнаружения повышенного уровня TNF-a в крови человека.
Белок-антиген ТОТ-а был изначально охарактеризован как белок, вызывающий некроз эксперимен-тальныгс опухолей у мышей [1]. В настоящее время накоплены данные о том, что ТОТ-а является одним из центральный белковыгс иммуномедиаторов, продуцируемым в основном активированными макрофагами. Т№-а биологически активен в форме тримера, что, как предполагается, необходимо для реализации его множественный функций [2]. Как противовоспалительный цитокин ТОТ-а играет ключевую роль в патогенезе некоторых заболеваний и состояний, таких как ревматоидный артрит, псориаз и септический шок [3, 4]. Повышенный по сравнению с нормой уровень ТОТ-а встречается при ряде заболеваний как инфекционной (туберкулез), так и аутоиммунной (склероз, саркоидоз) этиологии [5]. Динамика ТОТ-а в крови больного может служить индикатором развития инфекционного процесса и последующих стадий болезни. Этот факт можно с успехом использовать в клинической практике для диагностики различных инфекционных заболеваний человека.
Несмотря на доступность целого ряда коммерческих систем количественного определения ТНБ-а, имеется незначительное число сообщений об их применении в клинической практике. Возможно, это связано с повышенной чувствительностью систем, в некоторых случаях достигающей 0,5 пг/мл, тогда как уровень ТОТ-а в крови больных измеряется сотнями пикограмм. Перед нами стояла задача создать новую иммунохимическую систему детекции Т№-а
в образцах крови болынык и здоровык людей, пригодную для исполызования в клинике.
Материалы и методы
Для экспрессии в Е. coli исполызовали векторные системы на основе промотора Т7 (pET23a, Novagen). Плазмидную ДНК выделяли, как описано в работе [6], Е. coli выращивали на стандартной питателыной среде LB. Экспрессию и первичную очистку проводили, как описано в работе [7]. При денатурации белка содержание влажного осадка тел включения составляло 0,5 г на 10 мл буфера (50 мМ Tris-HCl, 7 М мочевина). Восстановление белка проводили при концентрации ДТТ 10 мМ (рН 8,0), сулыфитолиз -при концентрации тетратионата натрия 50 мМ и сулы-фита натрия 50 мМ (рН 8,8). Нерастворившийся остаток удаляли центрифугированием. Для нанесения на DEAE-ToyoPearl раствор белка разводили в 5-10 раз хроматографическим буфером (10 мМ Tris-HCl, рН 8,0, 4 М мочевина). Элюцию проводили градиентом NaCl от 0 до 1 М в хроматографическом буфере. Содержание продукта во фракциях анализировали при помощи ПААГ-электрофореза в денатурирующих условиях. Количественное содержание белка в растворе определяли по модифицированному методу Лоури с исполызованием бицинхонинового реагента [8].
Процедуру ренатурации проводили по принципу одноступенчатого разбавления денатурированного белка в 17 раз. Панелы буферов для ренатурации быша приготовлена согласно протоколу [http://www.athenaen-
*Московский городской центр профилактики и борьбы со СПИДом.
vironmental.com/]. Концентрацию общего белка, оставшегося в растворе после отделения агрегатов, определяли по модифицированному методу Лоури.
Иммунизация кроликов рекомбинантным TNF-a описана в работе [7]. Иммобилизацию рекомбинан-тного TNF-a на бромциан-агарозе ("Amersham Pharmacia Biotech") проводили по инструкции производителя. Аффинную очистку поликлональныгс антител проводили, как описано в работе [9]. Полученный препарат антител RA-TNF имел концентрацию 1 мг/мл. Биотинилирование антител осуществляли с помощью биотингидроксисукцинимида ("Amers-ham Pharmacia Biotech") по инструкции производителя.
Для определения биологической активности препаратов TNF-a использовали стандартный тест на индукцию апоптоза на клетках линии мышиной фибро-саркомы L929, обработанные актиномицином D [10]. Клетки рассевали по 30 тысяч на лунку в 2 плоскодонные 12-луночных планшета ("Costar") в культу-ральной среде (50% DMEM, 50% F12, 1% сыворотка, "Панэко") и культивировали при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% СО2, до образования монослоя на дне лунок. Затем культуральную среду удаляли и вносили по 2 мл свежей культуральной среды, содержащей актиномицин D в концентрации 10 мкг/мл, а также испытуемые препараты TNF-a в конечной концентрации 50 нг/мл. Параллельно вносили те же препараты, предварительно нейтрализованные антителами RA-TNF. Нейтрализация достигалась инкубацией испыггуемык препаратов TNF-a в конечной концентрации 10 мкг/мл с антителами в концентрации
100 мкг/мл в буфере PBS (20 мМ Na-фосфат, рН 7,5, 100 мМ NaCl) при 4°С в течение 20 ч. Планшеты инкубировали в течение 16 ч при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% СО2. В качестве контроля использовали клетки в культуральной среде с добавлением буфера PBS, а также клетки со свободными антителами RA-TNF. По окончании инкубации среду удаляли, а клетки окрашивали 0,1%-м раствором кристаллического фиолетового в 2%-м этаноле. Оптическую плотность измеряли при длине волны 595 нм.
Калибровка чувствительности тест-системы "Сандвич"
Полистироловые 96-луночные планшеты ("Costar") активировались антителами RA-TNF в концентрации 10 мкг/мл в 50 мМ буфере NСА (натрий-карбонат-бикарбонатный буфер, рН 9,6) в течение ночи при 4°С. Для блокирования неспецифического связывания использовали 1%-й раствор БСА (бычий сывороточный альбумин) в буфере ЖА и инкубировали в течение 1,5-2,0 ч при комнатной температуре. Затем в присутствии сыворотки крови здорового донора, разведенной в 5-20 раз буфером PBS, изготавливали серию разведений полноразмерного TNF-a из 6 точек с шагом в 5 раз (от 20 000 до 6 пг/мл). Инкубация происходила в течение 2 ч при комнатной температуре. Биотинилированные антитела В-RA-TNF вносили в концентрации 2 мкг/мл и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Конъюгат стрепта-видин-пероксидазы ("ИМТЕК", Москва, кат. номер P-S Avs) вносили в концентрации 1 мкг/мл и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре.
Рис. 1. Схемы экспрессионных конструкций pTNFa и pTNF short на базе pET23a, кодирующих полноразмерный и укороченный вариант TNF-a человека; N-концевые последовательности продуктов обеих
конструкций
Цветную реакцию на пероксидазу проводили при помощи субстратного буфера (400 мкг/мл о-фени-лендиамина, 0,015% H2O2, 100 мМ Na-цитрат, рН 5,0), реакцию останавливали добавлением 30 мкл 10% H2SO4. Оптическую плотность измеряли при длине волны 492 нм.
Исследование разрешающей способности сконструированной тест-системы в отношении клинических образцов проводили так же, как при определении чувствительности (см. выше). В эксперименте были использованы сыворотки 100 здоровых доноров, каждую из которых разводили в 5 раз буфером PBS.
Результаты и обсуждение
Белок-антиген для иммунологической тест-системы детекции TNF-a был получен с помощью ранее описанных конструкций на базе вектора pET23a, кодирующих полноразмерный зрелый TNF-a (конструкция рТОТа), и вариант, укороченный на 18 а.о. с N-конца (конструкция pTNF-short) [7]. Продукт конструкции pTNF-short содержал на N-конце 15 а.о. из белка 10 фага Т7 взамен собственных (рис. 1).
Рекомбинантные белки накапливались в виде телец включения с выходом до 200 мг/л. Солюбилиза-цию тел включения в денатурирующих условиях проводили либо традиционным методом, размыкая ди-сульфидные связи при помощи восстановления ДТТ,
^280
либо окислительным сульфитолизом с образованием сульфонатного производного белка [11]. Предполагалось, что восстановленная и сульфонатная формы денатурированного белка будут отличаться по эффективности очистки в денатурированных условиях и ре-натурации. Осветленные препараты денатурированного белка подвергали анионообменной хроматографии в денатурирующих условиях. Хроматографию проводили в буфере с содержанием мочевины 4 М. Преимуществом снижения концентрации денатурирующего агента является то, что при использовании для ренатурации метода разбавления исходный препарат достаточно разбавлять в два раза (до конечной концентрации мочевины 2 М), за счет чего раствор ре-натурированного белка оказывается в конечном итоге более концентрированным.
Хроматографию полноразмерного Т№-а после обработки ДТТ на БЕЛЕ-Тоуореаг1 проводили при рН 8,2. Десорбция белка градиентом №С1 достигалась при концентрации соли 120 мМ, а десорбция ДНК -при 450 мМ. Анионообменную хроматографию полноразмерного ТОТ-а после реакции сульфирования проводили в тех же условиях, однако при этом наблюдалось три пика на хроматограмме, которые предположительно представляют собой различные продукты сульфитолиза двух дисульфидных связей молекулы ТОТ-а. Десорбция белка с колонки проходила при
Л2М
Рис. 2. Профиль хроматографии ТОТ-а в денатурирующих условиях на БЕЛЕ-Тоуореаг1. Солюбилизацию тел включения в растворе мочевины перед нанесением на колонку проводили одновременно с восстановлением
ДТТ (а) и сульфитолизом (б)
Рис. 3. Цитотоксический эффект ренатурированного ЮТ-а на клеточную линию мышиной фибросаркомы Е-929 (а: 1 - отрицательный контроль, 2 - ТКЕ-а, ренатуриро-ванный в буфере № 7, 3 - ТКЕ-а, ренатурированный в буфере № 13, 4 - ТОТ-а-Б^г!, ренатурированный в буфере № 13; б - то же в присутствии антител против ТКЕ-а
концентрации соли 80-160 мМ, а десорбция ДНК -при 420 мМ (рис. 2). Поскольку полученный препарат не был достаточно гомогенным, в дальнейшем мы пользовались процедурой восстановления при помощи ДТТ. Аналогичным образом был очищен продукт конструкции рТКЕ 8Иог1;.
Ренатурацию белков проводили с использованием набора буферов [http://www.athenaenvironmental.com/]. Эффективность ренатурации ТКЕ-а оценивали по выходу растворимого белка и с помощью цитотокси-ческого теста на клеточной линии мышиной фибросаркомы [10]. Наибольшая удельная биологическая активность обнаружена у белков, ренатурированных с помощью буферов № 7 и № 13 (рис. 3).
Для оценки специфичности действия полученных форм ТКЕ-а был проведен тест на нейтрализацию его активности аффинно очищенными кроличьими антителами против Т№-а человека. Приведенные на рис. 3 результаты позволяют сделать вывод о том, что цитотоксический эффект ренатурированных препаратов Т№-а не связан с примесями, поскольку полностью подавляется очищенными антителами, не способными взаимодействовать с этими примесями. Анализируя наличие цитотоксической активности у укороченного белка ТКЕ^оГ;, необходимо отметить, что в числе остатков, отсутствующих в усеченном варианте ТКЕ-а по сравнению с природным белком,
находился Ьу8-11, участвующий в стабилизации три-мера ТКЕ-а [12]. Поскольку в работе [2] было высказано предположение о необходимости тримерной структуры для связывания ТКЕ-а с рецепторами, наличие биологической активности у белка ТОТ^ой можно считать неожиданным. Не исключено, что этот белок имеет аномальную по сравнению с природным лигандом структуру комплекса с рецептором и, возможно, необычный спектр физиологической ак-
^450
О -1-1-1-1
О 5 ООО 10 ООО 15 000 2 ООО
ЮТ-а , пг/мл
Рис. 4. Калибровка чувствительности тест-системы ИФА "сандвич" для определения содержания ТКЕ-а (содержание донорской сыворотки в образце, %: 1 - 5, 2 - 7, 3 - 10, 4 - 20)
Рис. 5. Распределение уровня ТОТ-а в сыворотках крови здоровых доноров, выявляемое тест-системой ИФА "сандвич"
тивности, что может иметь значение для фундаментальных исследований в области биологической роли ТОТ-а, изучения механизмов передачи информации лиганд-рецепторными комплексами, а также может оказаться полезным при диагностике и лечении ряда заболеваний, связанных с работой иммунной системы.
С использованием полноразмерного ТОТ-а были получены кроличьи моноклональные антитела. После очистки на сорбенте, содержащем иммобилизованный полноразмерный белок Т№-а, часть антител была биотинилирована. Схема иммунологического теста типа "сандвич" включала в себя сорбцию на поверхность иммунологического планшета небиотини-лированных антител в насыщающей концентрации, блокировку неспецифической емкости бычьим сывороточным альбумином, внесение источника антигена (донорских сывороток), маркировку связавшегося антигена биотинилированными антителами и визуализацию с помощью стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена. Для определения чувствительно-
сти и специфичности тест-системы была проведена калибровка с использованием серийных разведений полноразмерного ТОТ-а в присутствии конкурента - сыворотки крови здорового донора, разведенной в 5-20 раз (рис. 4). Построение калибровочного графика показало, что результирующий сигнал прямо пропорционален количеству Т№-а в образце в диапазоне концентраций в исходном материале от 100 до 5000 пг/мл и не зависит от количества конкурента.
Уровень детектируемого тест-системой сигнала был проверен на выборке сывороток здоровых доноров (100 человек). При разведении сыворотки в 5 раз примерно половина значений ^492 оказалась ниже 0,01. Другая половина значений ^492 находилась в диапазоне от 0,01 до 0,08, несколько значений достигали 0,12. Таким образом, наша система детектирует слабые, но достоверно отличные от нуля сигналы. Такая чувствительность позволяет достоверно выявлять повышение уровня Т№-а в крови человека по сравнению с нормой при любых патологиях.
Работа выполнена при поддержке Государственного контракта № 02.467.11.3001 (ЖС-КП 6/002).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Carswell E.A., Old L.J., Kassel R.L., Green S., Fiore N.,
Williamson B. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1975. 72. P. 3666.
2. ReedC, Fu Z.Q., Wu J, Xue Y.N., Harrison R.W., Chen M.J.,
Weber I.T. // Protein Eng. 1997. 10. P. 1101.
3. Wildbaum G., Youssef S., Karin N. // J. Immunol. 2000. 165.
P. 5860.
4. Шингарова Л.Н., Сагайдак Л.Н., Турецкая Р.Л., Недоспа-
сов С.А., Есипов Д.С., Коробко В.Г. // Биоорг. хим. 1996. 22. P. 243.
5. Erkut Z.A., Endert E., Huitinga I., Swaab D.F. // Mult. Scler.
2002. 8. P. 229.
6. Maniatis T., Fritsch E.E., Sambrook J. Molecular Cloning. A
laboratory manual. Cold Spring Harbor. 1982.
7. Суровцева E.B., Кузнецова T.B., Хоменков В.Г., Домогатс-
кии СЛ., Шевелев А.Б. // Биоорг. хим. 2005. 31. С. 474.
8. Smith P.K., Krohn R.I., Hermanson G.T., Mallia A.K., Gartner
F.H., Provenzano M.D., Fujimoto E.K., Goeke N.M., Olson B.J, KlenkD.C. // Anal Biochem. 1985. 150. P. 76.
9. Bashkov G.V., Stepanova I.P., Domogatsky S.P. // Thromb. 11. Patrick J.S., Lagu A.L. // Anal. Chem. 1992. 64. P. 507.
Res. 1994. 74. P. 321. 12. EckM.J., Beutler B., Kuo G., Merryweather J.P., SprangS.R.
10. Kramer S.M., CarverM.E. // J. Immunol. Methods. 1986. 93. // J. Biol. Chem. 1988. 263. P. 12816. P. 201.
nocTynma B pe^aKunro 23.11.07
NEW SYSTEM FOR TNF-ALPHA QUANTIFICATION IN CLINICAL SAMPLES
T.V. Kuznetsova, B.I. Shevelev, J.S. Keruchenko, A.B. Shevelev
(Division of Chemical Enzymology)
Full-length TNF-alpha and its truncated derivative with 18 N-terminal amino acids replaced to T7-tag were produced in E. coli using artificial genes and rendered inclusion bodies. Purification and refolding methods were established for the recombinants, their biological activity was demonstrated. Polyclonal antibodies against TNF-alpha were raised. ELISA-Sandwich testsystem for TNF-alpha quantification with 100 pg/ml sensitivity was engineered. The system was shown to be applicable for detection of the TNF-alpha elevation in human blood.
