CC BY
32
Д-р А. А. ЭГГЕР и д-р М. Л. ХАНИН (Одесса)
Новая методика выделения бактериофага с помощью мембран-фильтров 1
Из Одесского санитарно-бактериологического института (ди.р. — проф. iB. Л. Елин) сектора коммунальной гигиены (зав. — д-р ''ft.- А. Эггер)
Проблема санитарного значения присутствия бактериофага в различных водоисточниках представляет несомненно как теоретический, так и чисто практический интерес. С санитар,но-бактериологич-еской точки зрения представляется еще неясным значение находки бактериофага в том или ином водоисточнике, не говоря уже о том, что самое явление бактериофагии трактуется отдельными авторами различно.
Теории, пытающиеся выяснить самую природу бактериофага, можно свести к трем основным направлениям.
Первое направление, выдвинутое основоположником учения о бакте-оиофаге Д'Эреллем и разделяемое многими авторами (Hauduroy, Janzen, Wolff, Piausnitz, Элиава и др.), трактует бактериофаг как живой, организованный ультравирус, паразитирующий в микробах (о чем свидетельствует данное ему название).
Второе направление (Bordet, Kabeshima, Weinberg и Aznar, Pico, Da Costa Cruz, Otto, Kuttner, Borchardt и др.) говорит о неживой, ферментативной природе данного явления, появляющегося в результате жизнедеятельности микробов или вне их и ведущего к лизису бактерий.
Третье направление (Сукнев и его школа) считает это явление физиологическим проявлением цикличности развития микробов, приобретающих авизуальные формы в определенные моменты своего развития.
Не пытаясь в рамках настоящей работы стать твердо на какую-либо определенную точку зрения о природе явления бактериофагии, мы все же не можем не подчеркнуть того, что бактериофаг как правило обнаруживается в кишечных выделениях людей и животных или в материалах, содержащих эти выделения.
Возможность наличия явления бактериофагии в окружающей природе, вне зависимости от взаимодействия макро- и микроорганизма, многими авторами ставится под сомнение (Hauduroy, Dumas, Wege-mans и др.).
Так, Hauduroy указывает: «Повидимому верно, что бактериофаг является нормальный жильцом кишечника и только там его можно найти».
Этот имеющий весьма крупное для нас зАачение факт позволяет сделать его отправной точкой в подходе к разрешению поставленной t проблемы. Выяснение санитарного значения находок бактериофага в
1 Доложено là.XII.1935 на научной конфдр£нц^и Одесского бактериологического института. f
различных водах дало бы в руки санитарного бактериофага и эпидемиолога еще один показатель для суждения о качестве воды того или иного водоисточника.
Многие авторы, занимавшиеся поисками бактериофага в различных водах, не пришли к сожалению к единой санитарной оценке этого явления, хотя большинство все же считает наличие бактериофага в водах показателем фекального загрязнения (Д'Эррель, Gildemeister, Hauduroy, Zdansky, Dienert, Добротько и др.).
Наша настоящая работа является лишь предварительным м е т о-дическим шагом к разрешению намеченной проблемы в целом.
Методика выделения бактериофага является исключительно важным' моментом в осуществлении всякой работы, с бактериофагом, так как от нее может зависеть и успех самой (работы.
В настоящее время методы выделения бактериофага из любого материала базируются на 2 основных операциях: 1) моменте «обогащения» исследуемого' материала бактериофагом и 2) моменте его выделения в изолированном от бактерий виде.
Для обогащения материала бактериофагом подавляющее большинство авторов применяет различные питательные среды, определенный Ph и воздействие термостатной температуры, т. е. создает все условия для усиленного размножения в подлежащем исследованию материале имеющейся там бактериальной флоры, растущей при 3'7"Vo. Этот прием должен по мысли авторов наряду с усиленным размножением бактерий .привести также iif накоплению в исследуемом материале и бактериофага.
.Из питательных сред, применяемых в этих целях, классическим является ще-лочный раствор пептона. Кроме него многие пользуются обычным мясо-пептон-ным бульоном, бульоном Хоттингера, печеночным бульоном и другими средами с удовлетворительными результатами.
Повидимому различные вариации питательных сред, дающих обильный рост интересующей нас бактериальной флоры, не имеют решающего значения для выделения бактериофага; необходимо лишь наличие щелочной реакции среды.
Как подчеркивает ряд авторов (Niberg, Gildemeister, А. 3. Беляев, Хлебникова и др.), чаще всего впервые обнаруживаемые бактериофаги слабы, для чего в дальнейшем приступают к их усилению.
Усиление идет уже по линии •специфического взаимовоздействия интересующих нас видов бактерий с найденным бактериофагом. Только при этих условиях, бактериофаг способен повышать свою силу, от пассажа к пассажу, по отношению к определенным видам бактерий.
По удачной мысли Niberg'a первую стадию общего накопления бактериофага можно совместить с его специфическим усилением по отношению к определенным видам бактерий, нас интересующих.
ч Способ первоначального обогащения баактериофата с его специфическим усилением давал нам, как увидим ниже, лучное результаты, чем обычные приемы «неорганизованного» накопления бактериофага в питательной среде.
Для получения бактериофага в «чистом» виде в смысле изолирования бактериофага от всех сопутствующих живых бактерий как правило пользуются методом фильтрации материала, содержащего бактериофаг, через различные бактериальные фильтры. Эта операция является наиболее громоздкой при массовых обследованиях на бактериофаг. Далеко не все виды фильтрации однако можно признать равноценными как в смысле -способности некоторых фильтров адсорбировать имеющийся в фильтруемом материале бактериофаг, так и в смысле технических трудностей фильтрации различных, часто весьма мутных, бактериальных эмульсий.
Классическим способом фильтрации, которым пользовалось большинство авторов |Щ'Эрелль, 'Niberg;, Forsmann, Элиава и многие другие), является применение свечей Шамберлена .и Беркфельда.
Этот прочно зарекомендовавший себя вид бактериальной фильтрации несомненно является вполне проверенным и надежным способом отделения бактериальных тел от жидкой части бактериальной эмульсии.
Этот способ однако не лишен значительных неудобств в условиях массовых обследований для нахождения бактериофага.
Большие количества одновременно исследуемых на бактериофаг объектов требуют также больших количеств свечей, являющихся, как известно, дефицитными в наших условиях. При наличии значительной мутности подлежащих фильтрации жидкостей (густых бактериальных эмульсий) самая фильтрация затруднена. Подобные жидкости рекомендуют предварительно максимально осветлять ,пу-
тем предварительной фильтрации тем или иным способом, что усложняет работу. Часто удобнее работать с малыми количествами жидкостей, фильтрация которых через обычные свечи затруднительна из-за небольшого объема материала.
Hauduroy подчеркивает, что «фильтрация — очень тонкая операция. Она должна производиться очень тщательно, и свечи, которыми пользуются, должны быть регенерированы и проверены между двумя фильтрациями».
Указанные моменты зачастую делают работу со свечами громоздкой и затруднительной, особенно при широком обследовании многих об'ектов на бактериофаг.
Для замены дефицитных бактериальных свечей и устранения ряда их недостатков (упрощенная техника фильтрации многих жидкостей в небольших ■объемных количествах) Дроботько в 1927 г. предложил производить фильтрацию через слой инфузорной земли в несложных приборах, могущих быть изготовленными в любой лаборатории.
Для фильтрации 'каждой отдельной жидкости нужен отдельный фильтрационный приборчик с инфузорной землей, заранее простерилизованной, что требует наличия в запасе многих заготовленных заранее стерильных фильтров.
Качество инфузорной земли играет существенную роль: в наших опытах «желтая» инфузорная земля как правило давала нам проскок бактерий, несмотря на значительный слой ее «загрузки», взятый для фильтрации. «Розовая» инфузорная земля дала значительно лучшие результаты; однако изредка и она давала проскок бактерий.
-Сам автор указывает на возможность некоторой адсорбции бактериофага Фильтрующим слоем инфузорной земли. Для устранения указанной адсорбции, ослабляющей, а при очень слабых бактериофагах могущей полностью задержать бактериофаг на фильтре, автор предлагает добавление к подлежащей фильтра-
N N
ции жидкости аммиака в количествах, дающих его концентрацию от -Jq- до -^у
Отсутствие полной гарантии в стерильности фильтрата и отмеченная самим автором адсорбирующая способность инфузорной земли являются моментами отрицательного порядка. Предлагаемое добавление ощутимого количества аммиака с нашей точки зрения не является желательным, так как при этом вносится совершенно посторонний химический фактор, могущий оказаться небезразличным при дальнейшем усилении полученного бактериофага с живыми бактериями (особенно при применении первоначального усиления по Нибергу).
Кроме того в наших опытах сама фильтрация протекала очень медленно (отсос воздуха водоструйным насосом).
■Следующим видом бактериальной фильтрации, получающим все более широкое распространение, является применение асбестовых фильтров Зейтца, употребляемых в несложном аппарате того же автора (у нас фильтры и аппараты изготовляются в мастерских Киевского бактериологического института).
Эти фильтры как правило дают стерильный фильтрат. Некоторыми техничеД екими неудобствами данной методики являются: 1) пригодность отдельного фильтра лишь для одной фильтрации (таким образом для массовых обследований на бактериофаг потребны сотни Зейтц-фильтров); 2) необходимость для каждой отдельной фильтрации наличия особо простерилизованного Зейтц-аппарата с фильтром, что требует наличия целого ряда аппаратов, и 3) отсутствие бокового отростка в самом аппарате для создания вакуума в фильтроприемнике, что требует монтировки аппарата лучше всего в колбе Бунзена "(с боковым отростком).
Предложен также способ изолирования бактериофага от живых бактерий без всякой фильтрации, лишь путем прогревания бактериальной эмульсии -с бактериофагом с последующим добавлением туда бактерицидных веществ (фенола). Способ основан на гибели определенных бактерий после часового прогревания при 56—60° и «выживания» бактериофага .при этих условиях, а также на рези-v стентности бактериофага против небольших концентраций фенола. Данный спо- f
соб не применим для первичного выделения бактериофага из материалов, л богатых разнообразной бактериальной флорой (воды, почва', faeces), где ветре- II чаются стойкие спороносные формы бактерий.
Этот способ, как показали наши опыты, пригоден для уже выделенных бактериофагов при их усилениях с чистыми культурами патогенных представителей кишечной группы. Таким образом каждый из указанных способов бактериальной фильтрации страдает теми или иными недостатками, особенно ощутимыми при массовых исследованиях на бактериофаг.
Кроме того весьма существенным отрицательным моментом при первоначальном выделении бактериофагов (когда они, чаще всего, весьма слабы) является адсорбирующая способность самих фильтрующих материалов.
Как доказано, инфузорная земля и фарфоровые фильтры могут заметно адсорбировать бактериофаг, что заставляет желать усовершенствовать способы фильтрации.
Hauduroy в своем обзор.ном труде о бактериофагии это подчеркивает: ¡¿Levaediti показал, что вирус бешенства проходит очень хорошо через коллоидные пленки. То же нужно сказать о бактериофаге, о вирусе коровьей оспы... /Если они (ультравирусы) не проходят через фарфоровые фильтры, то это исклю-/ чительно вследствие феномена адсорбции. Они прилипают к стенкам канальцев 1 фарфоровых фильтров, чего не происходит с тонкими мембранами». [«Явилось бы большим прогрессом в бактериологии, — уговорит далее Hauduroy, •—■ если бы был найден простой и удобный способ при-тчзтовления коллодийных фильтров».
Мы склонны думать, что в предлагаемых нами для этой цели мембранных фильтрах (коллоидные пленки) мы приблизились к высказанной Hauduroy мысли.
Мембран-фильтры (или «ультрафильтры») были впервые предложены Бахма-ном для улавливания нанно-планктона.
Далее ¡Разумов использовал видоизмененные им мембран-фильтры в бакте-риоскопических целях для прямого учета бактерий в различных водах.
Дйанова и Ворошилова улучшили рецепт их приготовления, введя дополнительный растворитель и иной коагулятор.
Барсов впервые показал их пригодность для прямого выращивания водной микрофлоры на их поверхности.
Один из авторов настоящей работы (Эггер) впервые применил слегка модифицированные им мембран-фильтры на Украине для бактериологического исследования воды как в походных, так и в стационарных условиях.
Представлялось весьма целесообразным применять указанные мембран-фильтры и в другом направлении: в отношении выделения с их помощью бактериофагов из различных объектов. •
Этот новый способ фильтрации a priori можно было признать наиболее подходящим и удобным для выделения бактериофагов по соображениям, высказанным Hauduroy, а также ввиду простоты техники самой фильтрации в модифицированных аппаратах Зейтца и дешевизны фильтров.
Рецепт мембран-фильтров, применяемых нами уже свыше 3 лет, следующий (слегка измененная пропись Диановой и Ворошиловой): отмытой кинопленки — 7,0 г, химически чистого ацетона — 64,0 см3, уксусно-этилового эфира — 36,0 см3, изо-амилового спирта — 42,48 см3. Как качество входящих ингредиентов, так и внешние условия при их приготовлении (температура, влажность), по нашему мнению, обусловливают доброкачественность полученных фильтров.
Основными требованиями, поставленными нами в отношении фильтров, являлись: полная задержка ими рсех бактериальных форм и возможность фильтрации даже наиболее мутных жидкостей (густых бактериальных эмульсий) без их предварительной обработки.
Указанные требования оказались вполне осуществимыми при Условий наличия химически чистых компонентов, входящих в рецепт фильтров.
Изготовленные подобным образом фильтры дмеют вид тонких, эластичных, белых пластинок наподобие «меловой» писчей бумаги. Одна сторона у них глянцевитая, другая — матовая. Они очень огнеопасны {сгорают со взрывом), легко электризуются, противостоят кислотам и растворяются в крепких щелочрх.
Перед фильтрацией они должны быть промочены и простерилизованы, что одновременно достигается их длительным кипячением в дестилированной воде.--
Изученная Эггером совместно с д-ром Фишер микроструктура наших фильтров на срезах показала, что эти тонкие пластинки, имеющие толщину около 120 мм, состоят из густого переплетения тончайших волоконец наподобие вой-Тюка. 1В структуре фильтра различают ряд слоев: верхний тончайший, глянцевитый слой, названный нами «кутикулой»,, слой мелких пор, занимающий основную толщину фильтра, затем еще 2 тонких слоя («слой крупных пор» и «пограничная полоса»).
Вся масса бактерий оседает и задерживается почти полностью уже самой «кутикулой» фильтра.
Технически фильтрацию осуществляют в аппаратах типа Зейтца, усовершенствованных московскими работниками. Весь аппарат цельнометаллический и допускает обжигание и кипячение. Вакуум в фильтроприемнике достигается -с
помощью водоструйного или поршневого насоса, а то и непосредственным отсасыванием воздуха ртом.
В процессе работы мы удостоверились в полной практической возможности многократного использования наших мембран-фильтров для фильтрации различных объектов.
Это осуществлялось следующим образом: после 1-й фильтрации весь аппарат вместе с фильтром погружается в кастрюлю с водой, в которой кипятится 20— 30 минут. Кипячением достигается: стерилизация аппарата с фильтром и смывание с глянцевитой поверхности фильтра всех осевших на ней в процессе фильтрации микробов. После этого аппарат с фильтром снова готов к следующей фильтрации. Таким образом нам удавалось с одним лишь аппаратом и фильтром (чаще мы для верности брали 2 фильтра) провести 10 и более фильтраций, причем фильтраты как правило оставались стерильными. Такой способ чрезвычайно упростил технику работы с бактериофагом.
Для осуществления поставленной задачи мы провели сперва серию контрольных опытов по проверке стерильности фильтров при фильтрации густых (сильно мутных) бактериальных эмульсий через наши мембран-фильтры. Фильтры из химически чистых ингредиентов давали нам стерильный фильтрат даже 'при максимально заросших бактериями жидкостях (сточные воды с пептоном после стояния в термостате). За 10—15 минут мы отфильтровывали около 5 см3 подобной жидкости непосредственно в стерильные пробирки.
Всего нами обследовано на присутствие ба^ериофага около 150 разнообразных объектов, где мы рассчитывали его обнаружить. Объектами исследования служили различные воды: сточные, дренажные, речные, колодезные, морские, воды из цистерн, прудов и садков и фекалии больных различными инфекционными заболеваниями.
Для первоначального накопления бактериофага в исследуемом материале мы пользовались главным образом двумя способами: обогащением с пептоном и способом Ниберга. Последний способ представляется нам более обоснованным и целесообразным, что и подтвердили наши экспериментальные данные.
Нашими повседневными рабочими штаммами были проверенные культуры тифа, паратифов, палочек Шига и кишечной.
Принимая во внимание, что не все штаммы, даже одного вида, являются одинаково лизочувствительными, мы при контрольных проверках применяли по 3 избранных штамма каждого вида. Кроме того некоторые поливалентные бактериофаги мы проверяли также на культурах паратифа /1 бацилл Флекснера, Стронга и Гиссе. /
Наша техника .работы при обогащении по Нибергу были следующая: пообирка с 5 см3 бульона (pH = 7,4—7,6) засевалась одноврменно свежими 24-часовыми бульонными культурами тифа, паратифа В, Шига и Coli (по 1 петле каждой бульонной культуры), затем туда добавлялось в зависимости от мате-оиала 1—2,5 ем3 исследуемой на бактериофаг жидкости' (сточные воды, эмульсии faeces и т. д.). Пробирка ставилась в термостат при 37° не более, чем на сутки, после чего производилась фильтрация в специальном аппарате (московская модификация аппаратов Зейтца) через наши мембран-фильтры.
Чаще для большей уверенности в стерильности фильтра мы применяли ¡по 2 мембран-фильтра (ацетон не всегда был у . нас должного качества). Фильтрат проверялся на стерильность в термостате и одновременно пробовалось его лизирующее действие на вышеуказанных штаммах.
Лизирующее действие фильтратов испробовано как на жидких, так, и на твердых средах; на последних это более удобно и более демонстративно.1 На чашки с агаром- засевались «еп парре» свежие бульонные культуры указанных штаммов, чашки подсушивались в термостате и затем на уже сухую поверхность свежего засева наносились капли испытуемого фильтрата. Через 8—24 часа стояния в термостате при наличии бактериофага наступали заметные изменения в росте культур в местах нанесенных капель.
Далее приступали к усилению бактериофагов. При отсутствии изменений мы также приступали к усилению бактериофага по способу. Ниберга и часто удавалось на 2—3-м и даже 4-м пассажах получить бактериофаг там, где «начале никаких признаков его не обнаруживали.
Усиление бактериофага по Нибергу проводился так же, как и при первоначальном накоплении: пробирка с 5 см3 бульона засевалась интересующими нас
свежими бульонными культурами (по 1 петле каждой культуры). Затем туда добавлялся 1 см3 полученного фильтрата, ставился в термостат на -сутки и. затем, снова фильтровался через мембран-фильтры.
Фильтрат усиленного бактериофага испытывался ориентировочно указанным выше способом или титрованием. Титрацию бактериофагов мы производили по Аппельману. Исследуемый фильтрат с бактериофагом разводился в ряде пробирок с бульоном так, чтобы разведение .бактериофага в каждой последующей пробирке было в 10 раз больше, чем в предыдущей. Затем во в>се пробирки добавлялась одна капля свежей лизочувствительной культуры Шига. Ставились также соответствующие контроли (бульон с бактериофагом без культуры и бульон,, зараженный культурой, без бактериофага).
Результаты учитывались после 8 и 24 часов стояния в термостате. 'Сила бактериофага, как известно, обозначается степенью разведения жидкости в последней пробирке, где еще наблюдается полный лизис культуры.
Из 148 различных объектов бактериофаг найден и выделен в 57 случаях (38,5%), а в 91 случае не обнаружен.
Результаты наших исследований на присутствие бактериофага с помощью мембран-фильтра представлены в следующей сводной таблице.
Объекты исследования Общее число исследований Бактериофаг найден Бактериофаг не найден
Воды
Сточные (из них 8 с полей орошения) . . . 9 8 1
Д| енажные (с полей орошения)...... 14 9 5
Речные . ................ 57 16 41
10 3 7
Пруды-ставки.............■ 2 0 2
Море-лиман............... 2 0 2
Атмосферные (из цистерны)........ 1 1 0
Faeces1
Брюшнотифозных больных......... 21 12 9
Дизентерийных „ ......... 17 8 9
Прочих (сыпной тиф, колиты, с невыясненным 15
диагнозом)................ 15 0
Итого .... 1 148 57 J ' 91
В различных водах в зависимости от их качеств бактериофаг обнаруживается далеко не одинаково часто. Так, интересно отметить,, что в сточных водах одесских полей орошения бактериофаг найден почти во всех случаях (из 9 исследований — в 8 случаях). В фильтрате тех же сточнйх вод сквозь почву полей орошения (дренажные воды) бактериофаг обнаружен в 64% случаев. Воды речные (Днепр, Кошевая, Днестр, Буг) в зависимости от места и времени взятия дали всего положительных находок 28%. Колодезные воды имели бактериофаг в 30%. Частота выделения бактериофага из фекалий различных инфекционных больных, повидимому, стоит в прямой зависимости от вида инфекции. Из кала брюшнотифозных больных в разные периоды заболевания был выделен бактериофаг в 57%; кал дизентерийных дал бактериофаг в 47®/о и наконец прочие инфекции
1 Следует оговориться, что указанные диагнозы являются клиническими (по> историям болезней), часто не подтвержденными бактериологическими исследованиями. Это особенно следует принять' во внимание в группе «дизентерий-н ы х» заболеваний.
(главным образом сыпной тиф) из 15 случаев не дали ни одной находки бактериофага.
Подходя в этой работе к выделению бактериофага из различных материалов лишь методически, мы не будем подробно анализировать полученные нами количественные данные и значения находок бактериофага в тех или иных исследованных объектах.
Следует указать, что из различных вод мы после усиления по Нибергу нередко получали поливалентные бактериофаги, действовавшие одновременно на культуры Шига, паратифа В и часто тифа, но обычно с различной силой. Поливалентные бактериофаги как правило выделялись из сточных и дренажных вод полей орошения. Речные и колодезные воды чаще давали моновалентные бактериофаги против Шига. В отдельных случаях после ряда пассажей с культурами тифа, паратифа В и Шига моновалентный бактериофаг становился поливалентным.
Что касается культур b. Coli, то действие на них бактериофага отличается пестротой, повидимому в значительной степени завися от происхождения того или иного штамма. Так, например, мы имели Coli-бактериофаг, выделенный из сточных вод, который только ли-зировал Coli-штамм, полученный из этих же сточных вод, в то время как культуры b. Coli, выделенные из фекалий и речных вод, были бактериофагорезистентны. То же мы наблюдали с СоН-фагом из дренажных вод, проявлявшем лишь избирательное действие по отношению к ряду СоН-штаммов.
Что касается вопроса о с и л е выделяемых бактериофагов, то почти все полученные нами водные бактериофаги оказывались первоначально весьма слабыми, и только путем дальнейших усилений их на 3—4—5-м пассажах можно было добиться полного лизиса соответствующих культур.
В сточных водах наличие бактериофага обнаруживалось после 2-го пассажа (лишь в 1 случае бактериофаг был обнаружен после первичного обогащения по Нибергу).
Дренажные воды с полей орошения давали признаки присутствия бактериофага после 2—3-го пассажа; речные воды чаще обнаруживали признаки наличия бактериофага лишь после 3-го пассажа (а в 1 случае и после 4-го пассажа).
В отношении faeces следует сказать, что нередко уже после первичного обогащения по Нибергу обнаруживается бактериофаг в исследуемом материале (из 12 тифозных faeces в 7 случаях).
В ряде случаев нами отмечалось скачкообразное усиление бактериофага между отдельными пассажами.
При отсутствии признаков наличия бактериофага после 5-го пассажа нам уже из данного материала бактериофаг выделять не удавалось вовсе; поэтому мы как правило доводили исследование на бактериофаг каждого отдельного объекта не далее 5-го пассажа.
За весь период работы нами проделано свыше 700 фильтраций сквозь наши мембран-фильтры.
Для выяснения наиболее рационального способа первичного обогащения бактериофага в исследуемом материале был поставлен ряд параллельных опытов с пептоном и по методу Ниберга.
Нами брались одинаковые объекты исследования (сточные, дренажные и речные воды), причем к одной части исследуемого материала добавлялся основной раствор пептона (чтобы получилось не «иже 11°/о разведения его), а другая усиливалась по способу Ниберга; обе пробы ставились >в термостат на 20—24 часа, затем фильтровались и испытывались на наличие бактериофага. Если бактериофага после первой фильтрации не оказывалось, то оба фильтрата далее одинаково усиливались с соответствующими штаммами.
Опыты с несомненностью показали преимущество обогащения бактериофага способом Ниберга по сравнению с пептоном.
Все параллельно обследованные объекты (дренажные, сточные и речные воды) дали нам наличие бактериофага, причем в ряде дренажных вод, в первых 2 пассажах, при первоначальном обогащении с пептоном, бактериофага не было обнаружено (бактериофаг появлялся ,на 3—5-м пассаже), в то время как по способу Ниберга бактериофаг обнаруживался сразу же после первоначального обогащения. Сточные воды также дали бактериофаг по Нибергу сразу же после первичного обогащения, в то время как с пептоном бактериофаг появился лишь на 2-м пассаже. Речная вода (Днестр) при обогащении с пептоном вовсе не обнаружила бактериофага (после 5 пассажей), в то время как бактериофаг по Нибергу найден в ней на 4-м пассаже.
Таким образом мы должны признать метод обогащения по Нибергу более успешным, чем способ с пептоном, и рекомендовать его применение при выделении бактериофага из различных водоисточников.
Для сравнительного изучения применения нового способа фильтрации при выделении бактериофага мы также выяснили, насколько тот или иной фильтрующий материал ослабляет силу бактериофага путем его адсорбирования.
Для сравнения, помимо наших мембран-фильтров, мы применили следующие, наиболее употребительные методы фильтрации: 1) свечи Шамберлена и Беркфельда, 2) асбестовые фильтры Зейтца, 3) фильтры Дроботько из инфузорной земли. Особо мы также изучили влияние прогревания (1 час при 56°) на силу бактериофагов.
Методика указанных исследований состояла в следующем: один из ранее выделенных бактериофагов брался как «исходный» (в качестве «исходных» мы чопытали около 10 наших бактериофагов) и точно определялась его сила путем титрации по Аппельману. Одновременно бульон с указанным бактериофагом фильтровался всеми способами (мембран-фильтры, свечи, фильтры Зейтца и Дроботько).
После каждой фильтрации одним из указанных способов определялась сила бактериофага. Путем сравнения титра «исходного» бактериофага и его же титра после отдельных фильтраций выяснялась степень снижения его силы благодаря адсорбирующей способности того или иного фильтрующего материала. Таким -образом мы могли дать оценку указанных способов фильтрации и сравнить их с нашим методом. Подобных сравнительных опытов с тем или иным видом фильтрации проведено свыше 60.
Сравнение силы «исходного» бактериофага с его силой после фильтрации через 1—2 мембран-фильтра показало полное отсутствие ослабления бактериофага, иначе говоря, отсутствие адсорбции. Фильтрация через 4 мембран-фильтра (вместе сложенные) уже дает в единичных случаях незначительное ослабление силы бактериофага (с Ю-6 на Ю-5). Фильтрация через 6 вместе сложенных фильтров уже обычно давала снижение силы бактериофага, но также незначительное (с ,10-5 на Ю-4).
Таким образом мы удостоверились, что фильтрация через один и даже два мембран-фильтра не давала заметной адсорбции бактериофага.
Опыты со свечами Шамберлена (фильтр Р, форма с!) и Беркфельда (фиг.. Ы) показали, что этот вид фильтрации в большинстве случаев не дает адсорбции. Из 10 опытов небольшое снижение силы бактериофага отмечено лишь в 2 случаях (с Ю-8 на Ю-7).
Таким образом мы удостоверились, что классический способ фильтрации сквозь свечи Шамберлена й Беркфельда дает в этом отношении вполне благо-'получные результаты.
Опыты с асбестовыми фильтрами Зейтца показали, что в половине всех случаев (12 опытов) сила бактериофага после фильтрации несколько ослаблялась, правда, незначительно (с 10-в до Ю-6). В остальных случаях видимой адсорбции. не наступало, и титр оставался да том же уровне. Таким образем в 50% всех случаев отмечалось небольшое ослабление бактериофага.
При способе фильтрации по Дроботько следует подчеркнуть отчетливое влияние качества самой инфузорной земли, употребляемой в качестве фильтрующего материала, «Желтая» инфузорная земля давала нам неудовлетворительные результаты в отношении проскоков бактерий. «Розовая» инфузорная земля давала как правило стерильный фильтрат, почему мы на последней и остановились.
Аммиака при фильтрации, как рекомендует автор, мы сознательно не применяли, так как желали выяснить адсорбирующие свойства инфузорной земли как таковой.
При фильтрующем слое в 1—1,5 см инфузорной земли фильтрат бактериофага лишь в Ун случаев (из 10 опытов) дал небольшое ослабление силы бактериофага (с ilO-8 до Ю-7). В остальных -А случаев сила бактериофага не уменьшилась.
Таким образом фильтраты Дроботько показали удовлетворительный результат в смысле небольшого уменьшения силы бактериофага лишь в гА опытов.
Подытоживая результаты нашего сравнительного изучения адсорбирующей способности различных фильтрующих материалов для выделения бактериофага, можно притти к следующим заключениям: 1) фильтрация бактериофага через наши мембран-фяльтры (1—2 фильтра) не снижает его силы, что является существенным преимуществом данного метода; 2) остальные способы фильтрации (свечи, фильтры Zeitz и фильтры Дроботько) в некотором проценте случаев давали незначительное ослабление силы бактериофага.
Из вышеперечисленных способов наилучшим в этом отношении повидимому является классический способ фильтрации через свечи. Фильтры Дроботько и Зейтца уже несколько чаще снижают титр бактериофага.
Следует подчеркнуть, что все указанные способы фильтрации очень незначительно ослабляют титр сравнительно сильных бактериофагов. Это однако может играть существенную роль при первичном выделении очень слабых бактериофагов, обычно встречаемых в естественных водах.
Особо мы изучали действие прогрева наших фильтров с бактериофагом при 56°—1 час. Согласно работе Мельника и Хастовича подобный способ позволяет получать бактериофаг без фильтрации. Ряд опытов по определению силы наших бактериофагов как до, так и после прогрева показал, что ¡после подобной операции титр бактериофага оставался на прежней^высоте.
Выводы
1. Накопление бактериофага в подлежащем исследованию материале, как показали наши опыты, целесообразно проводить по способу Ниберга, где совмещается стадия общего накопления бактериофага с его специфическим усилением.
2. Получение бактериофага в изолированном от бактерий виде обычно состоит в фильтрации исследуемой жидкости через тот или иной бактериальный фильтр. Существующие общепринятые методы фильтрации (бактериальные свечи, фильтры Зейтца и До^рс^гько) не свободны от ряда дефектов, особенно ощутимых при массовой работе по выделению бактериофага.
3. Отдельные упомянутые способы бактериальной фильтрации имеют в наших условиях следующие отрицательные моменты при их использовании: а) свечи Шамберлена и Беркфельда дефицитны: сравнительно сложно их восстановление, при сильной мутности жидкости желательно ее предварительное осветление, малые количества жидкости неудобны для фильтрации. Монтировка свечей относительно сложна; б) при фильтрации по способу Зейтца каждый фильтр пригоден лишь для однократного использования в особо простерилизо-ванном аппарате; в) способ Добротько относительно прост, но также тр'ебует для каждой фильтрации отдельного стерильного приборчика.
Не всякая инфузорная земля полностью задерживает бактерии. Фильтрация протекает медленно. В 30% отмечалось некоторое снижение силы бактериофага после фильтрации.
4. Предлагаемый метод фильтрации через мембран-фильтры для выделения бактериофага лишен указанных выше дефектов и особенно пригоден для массовых обследований на бактериофаг.
5. Преимущества нашего метода фильтрации следующие: а) техническая простота монтировки прибора и самой фильтрации; б) отсутствие адсорбции бактериофага нашими мембран-фильтрами, что особенно важно при выделении слабых бактериофагов; в) возможность фильтрации мутных жидкостей без их предварительной обработки; г) относительная скорость фильтрации; д) возможность многократного использования отдельного мембран-фильтра после его кипячения; е) отсутствие необходимости для каждой фильтрации иметь особо простерилизованный прибор (кипячение всего цельнометаллического прибора с фильтром после каждой фильтрации); ж) дешевизна нашего способа даже при массовой работе.
6. Указанные преимущества предлагаемого метода как наиболее простого и точного позволяют рекомендовать его даже для малоосна-щенных периферических лабораторий.
7. Для широкого внедрения в практику этого метода необходимо однако развернуть массовое стандартное производство самых мембран-фильтров и ультрафильтрационных аппаратов.
ЛИТЕРАТУРА
1. H a u d и го у, Учение о бактериофаге ё'НегеПе'я, 1927.-2. Niberg. Zentrbl. f. Bakt. Orig., В. 122, 1931.—3. G il d e m e i s t e г и. Watanabe, Zentrbl. f. Bakt. Orig. B. 122, H. 8, 1931.— 4. Д'Эрелль, Бактериофаг и его значение для иммунитета, 1926.— 5. С у к н е в, Ж. микроб, и эпидем., № 5, 1935.-6. Niberg u. Forsman, Acta pathog. et microbiolog. Scandinavie, 1934.—7. Буяновский, Ж. микроб, и иммун. т. VII, 1930.—8. M е л ь н и к, Лабор. практ., № 2, 1935.—9. Дроботько, Проф. медиц., 1928. — 10. Э г ге р, Проф. медиц., № 8—9, 1933—11. Эггер и Верник, Проф. медиц., № 1, If34,—12. Эггер, Эпидемиолог, и микробиолог., № 2, 1934.— 13. Эггер и Фишер, Лабор. практ., № 1, 1935.
