CC BY
38
4ШМИ«« мадшмш ЭДМЩИМИЙ
Нейропротекторное действие цикло-L-пролилглицина на моделях повреждения нейрональных клеток in vitro
Николаев С.В., Логвинов И.О., Антипов П.И., Колясникова К.Н., Антипова Т.А.
ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова», г. Москва
Резюме. Исследовано нейропротекторное действие цикло^-пролилглицина в экспериментах in vitro. Показано, что L-ЦПГ оказывает нейропротекторное действие в условиях оксидативного стресса, глутаматной и 6-гидроксидофаминовой токсичности.
Ключевые слова: нейропротекция, цикло-1_-пролилглицин, оксидативный стресс, глутаматная токсичность, 6-гидроксидофами-новая токсичность
Neuroprotective effect of L-cycloprolylglycine on models neuronal cells damage in vitro
NikoLaev S.V., Logvinov I.O., Antipov P.I., KoLyasnikova K.N., Antipova T.A.
FSBI «Zakusov Institute of Pharmacology», Moscow
Resume. We have studied neuroprotective effect of L-cycLoproLyLgLycine (L-CPG) in vitro experiments. It is shown that L-CPG has neuroprotective effect in the conditions an oxidative stress, glutamate and 6-hydroxydopamine toxicity.
Keywords: neuroprotection, L-cycLoproLyLgLycine, oxidative stress, glutamate toxicity, 6-hydroxydopamine toxicity
Автор, ответственный за переписку:
Николаев Сергей Владимирович - научный сотрудник ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова»; 125315, г. Москва, ул. Балтийская, 8; e-mail: [email protected]
Введение
Нейропептид цикло^-пролилглицин (L-ЦПГ), синтезированный в ФГБНУ «НИИ фармакологии им. В.В. Закусова» [1], был позже обнаружен в мозге крыс [2]. Ноотропный [3], анксиолитический [4], антигипоксический [5] эффекты L-ЦПГ при системном введении были схожи с таковыми при введении пирацетама. Подобно пирацетаму, ЦПГ является положительным модулятором AMPA-рецепторов [6]. Известно, что положительные AMPA-модуляторы обладают нейропротекторным действием на различных моделях in vitro [7]. Исходя из этих данных, можно было предположить наличие нейропротекторного действия и у L-ЦПГ.
Целью работы было выявление нейропротекторного действия L-ЦПГ на различных моделях повреждения in vitro: оксидативного стресса, глутаматной токсичности, клеточной модели болезни Паркинсона, индуцированной нейротоксином 6-гидроксидофамином.
Материалы и методы исследования
L-ЦПГ синтезирован в отделе химии НИИ фармакологии им. В.В. Закусова [8]. Для экспериментов использовались реактивы: глутаминовая кислота (ICN), 6-гидроксидофамин и MTT (Sigma Aldrich), ДМСО (Panreac), среда ДМЕМ (HyClone), фетальная бычья сыворотка FBS (Gibco).
Клетки культивировали в среде ДМЕМ в случае гиппокампальных клеток линии HT-22 с добавлением 5% FBS, в случае клеток нейробластомы человека
линии SH-SY5Y - 15% FBS при температуре 37 °C в атмосфере, содержащей 5% CO2.
Глутаматную токсичность моделировали путём внесения в культуральную среду раствора глутамино-вой кислоты в конечной концентрации 5 мМ. Через 24 ч среду заменяли на обычную. L-ЦПГ вносили за 24 ч до глутаминовой кислоты или сразу после смены среды. Жизнеспособность клеток измеряли методом MTT-теста через 24 ч [9].
Оксидативный стресс моделировали путём внесения перекиси водорода в конечной концентрации 1,5 мМ. Спустя 30 мин среду заменяли на обычную. Ещё через 4 ч выполняли измерение жизнеспособности клеток методом MTT-теста [10].
Клеточную модель болезни Паркинсона воспроизводили путём внесения раствора 6-гидроксидофа-мина в конечной концентрации 100 мкМ. Через 24 ч среду заменяли на обычную. Через 24 ч измеряли жизнеспособность клеток методом MTT-теста [11].
L-ЦПГ вносили за 24 ч до повреждения или сразу после смены среды в концентрациях 10-5 — 10—8М.
Жизнеспособность клеток измеряли с использованием MTT-теста с добавлением 0,5% раствора 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромида (MTT). Для растворения кристаллов форма-зана использовали ДМСО и измеряли оптическую плотность на спектрофотометре Multiscan EX при длине волны 600 нм [12].
Статистическую обработку данных проводили с использованием критерия Краскела-Уоллеса с последующим тестом по Данну (ANOVA). Данные представлены в виде m. ± s.d.
0 стт
Результаты и их обсуждение
На модели глутаматной токсичности нами показано, что L-ЦПГ в культуре клеток НТ-22 в концентрациях 10-5—10-8 моль/л оказывал нейропротек-торное действие, но только в схеме внесения за 24 ч до повреждения. При внесении после глутаминовой кислоты нейропротекторное действие выявлено не было (рис. 1).
При моделировании оксидативного стресса путём добавления к культуре клеток НТ-22 перекиси водорода L-ЦПГ оказывал защитное действие как при внесении за 24 часа до перекиси в концентрациях от 10-5 моль/л до 10-8 моль/л, так и при внесении после перекиси, но только в концентрации до 10-7 моль/л (рис. 2, 3).
На клеточной модели болезни Паркинсона в культуре клеток SH-SY5Y с использованием 6-ги-
Рис. 1. Нейропротекторное действие ЦПГ на модели глутаматной токсичности (результат МТТ-теста)
Примечание: Внесение Ь-ЦПГ за 24 ч до глутаминовой кислоты (р < 0,05 по критерию Краскела-Уоллеса). * — достоверность отличия от контроля; А — от глутаминовой кислоты
Рис. 2. Нейропротекторное действие ЦПГ на модели оксидативного стресса
Примечание: Внесение Ь-ЦПГ за 24 часа до перекиси водорода (р < 0,05 по критерию Краскела-Уоллеса). * — достоверность отличия от контроля; А — от перекиси водорода
Рис. 3. Нейропротекторное действие ЦПГ на модели оксидативного стресса
Примечание: Внесение Ь-ЦПГ после перекиси водорода (р < 0,05 по критерию Краскела-Уоллеса). * — достоверность отличия от контроля; А — от перекиси водорода
4ШМИ«« мадшмш ЭДМЩИМИЙ
Рис. 4. Нейропротекторное действие ЦПГ на модели 6-гидроксидофаминового повреждения.
Примечание: Внесение L-ЦПГ после 6-гидроксидофамина (р < 0,05 по критерию Краскела-Уоллеса). * — достоверность отличия от контроля; А — от 6-гидроксидофамина
дроксидофамина, L-ЦПГ в концентрациях 10-510-8 моль/л, как и в случае глутаматной токсичности, нейропротекторное действие обнаруживалось только при добавлении пептида за 24 часа до токсина в концентрациях 10-5-10-8 моль/л (рис. 4).
Таким образом, нами показано наличие ней-ропротекторного действия L-ЦПГ на моделях повреждения нейронов in vitro, наблюдавшееся преимущественно при внесении препарата до начала действия повреждающего агента. Эти результаты согласуются с данными литературы о наличии протекторного эффекта у L-ЦПГ на моделях кислород-но-глюкозной депривации на первичной культуре гиппокампальных нейронов [13], а также майтоток-син-индуцированного некроза и апоптоза, индуцированного сульфатом железа (II) в зёрнах мозжечка [14]. Защитный эффект L-ЦПГ отсутствовал в схеме внесения после повреждения на модели травматического повреждения кокультуры нейрональных и глиальных клеток, а также апоптоза, индуцированного стауроспорином в культуре зёрен мозжечка [14], и NMDA-экзайтотоксичности на гиппокампальных нейронах [15].
Одним из ключевых звеньев механизма действия L-ЦПГ является его способность к положительной
модуляции АМРА-рецепторов [16], что, как известно, приводит к усилению синтеза нейротрофинов, являющихся эндогенными нейропротекторами [7]. Поэтому наличие нейропротекторного эффекта только при внесении за 24 ч можно объяснить, исходя из предположения о том, что L-ЦПГ осуществляет своё защитное действие через положительную модуляцию АМРА-рецепторов и последующий синтез нейротрофинов, на который требуется интервал времени 18—24 ч [17]. Выявленное защитное действие L-ЦПГ в обеих схемах эксперимента на модели оксидативного стресса может быть обусловлено его антиоксидант-ными свойствами [14] и за счёт возможного влияния на систему антиоксидантной защиты клеток.
Выводы
Цикло^-пролилглицин оказывает нейропротекторное действие в экспериментах in vitro и это согласуется с литературными данными о его защитном действии в других модельных системах in vitro и in vivo. Полученные результаты согласуются с литературными данными о наличии у положительных модуляторов AMPA-рецепторов нейропротекторных свойств.
Литература
1. Гудашева Т.А., Василевич Н.И., Золотое Н.Н., Лезина В.П., Розен-берг С.Г., Кравченко Е.В., Островская Р.У., Воронина Т.А., Розанцев Г.Г., Сколдинов А.П. О механизме ноотропного действия топологических аналогов пирацетама на основе пролина. Хим.-фарм.ж.. 1991; 6: 25:12-16.
2. Gudasheva T.A., Boyko S.S., Akparov V.Kh., Ostrovskaya R. U., Skoldi-nov A.P., Rozantsev G.G., Voronina T.A., Zherdev V.P., Seredenin S.B. Identification of a novel endogenous memory facilitating cyclic dipeptide cyclo-prolylglycine in rat brain. FEBS Letters. 1996; 391: 149-152.
3. Гудашева Т.А., Островская Р.У., Трофимов С.С., Воронина Т.А., Сколдинов А.П., Середенин С.Б. Новый эндогенный дипептид цикло-пролилглицин подобен пирацетаму по селективности мнемотропно-го эффекта. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1999; 10: 128: 411-413.
4. Гудашева Т.А., Константинопольский М.А., Островская Р.У., Середенин С.Б. Анксиолитическая активность эндогенного ноотропа цикло-пролилглицина в тесте приподнятого крестообразного лабиринта стереоселективна. Бюлл. эксп. биол. и мед.. 2001; 5: 131: 545-550.
5. Колясникова К.Н., Гудашева Т.А., Назарова Г.А., Антипов П.И., Николаев С.В., Антипова Т.А., Воронина Т.А., Середенин С.Б. Сходство цикло-пролилглицина с пирацетамом по антигипоксическому и нейропротекторному эффектам. Экспериментальная и клиническая фармакология. 2012; 9: 75:3-6.
6. Гудашева Т.А., Григорьев В.В., Колясникова К.Н., Замойский В.Л., Середенин С.Б. Нейропептид циклопролилглицин является эндогенным положительным модулятором AMPA-рецепторов. Доклады Академии наук. 2016; 1: 471:106-108.
7. JoudiH, Hsu Y.-T, ZhouM, Qin Q, BiX., Baudry M. Positive AMPA Receptor Modulation Rapidly Stimulates BDNF Release and Increases Dendritic mRNA Translation. Journal of Neuroscience. 2009; 8: 29: 8688-8697.
4ШШ1МС« (»мшвдимшм
8. Гудашева Т.А., Василевич Н.И., Островская Р.У., Трофимов С.С., Воронина Т.А., Сколдинов А.П., Розанцев Г.Г. Синтез и ноотропная активность пирролидино [1,2-a] диазациклоалканонов. Хим.-фарм. ж. 1996; 9: 30: 12-17.
9. Tan S., Wood M., Maher P. Oxidative Stress Induces a Form of Programmed Cell Deathwith Characteristics of Both Apoptosisand Necrosis in Neuronal Cells. Journal of Neurochemistry. 1998; 1: 71: 95-105.
10. Jackson G.R., Werrbach-PerezK., EzellE.L., Post J.F.M., Perez-Polo J.R Nerve growth factor effects on pyridine nucleotides after oxidant injury of rat pheochromocytoma cells. Brain Research. 1992; 592: 239-248.
11. Riveles K. HuangL.Z., Quik M. Cigarette smoke, nicotine and cotinine protect against 6-hydroxydopamine-induced toxicity in SH-SY5Y cells. NeuroToxicology. 2008; 29: 421-427.
12. Twentyman P.R., Luscombe M. A study of some variables in a tetrazolium dye (MTT) based assay for cell growth and chemosensitivity. British journal of cancer. 1987; 56: 279-285
13. DRA. María Teresa García López, el potencial terapéuticodel tripéptido n-terminal deligf-1 y de sus mimé ticos comofármacos neuroprotectores, 2007.
14. Prakash K.R.C., Tang Y., Kozikowski A.P., Flippen-Anderson J.L., Knoblachc S.L., Fadenc AI. Synthesis and Biological Activity of Novel Ne uroprotectiveDiketopiperazines. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 2002; 10: 3043-3048.
15. Burgos-Ramos E., Martos-Moreno G.A., López M.G., Herranz R., Aguado-Llera D., Egea J., Frechilla D., Cenarruzabeitia E., León R., Arilla-Ferreiro E., Argente J., Barrios V. The N-terminal tripeptide of insulin-like growth factor-I protects against beta-amyloid-induced somatostatin depletion by calcium and glycogen synthase kinase 3 beta modulation. Journal of neurochemistry. 2009; 109: 360-370.
16. Гудашева Т.А., Колясникова К.Н., Антипова Т.А., Середенин С.Б. Нейропептид циклопролилглицин увеличиваетсодержание мозгового нейротрофического фактора в нейрональных клетках. Доклады Академии наук. 2016; 4: 469:492-495.
17. Tabakman R., Lecht S., Sephanova S., Arien-Zakay H., LazaroviciP. Interactions between the cells of the immune and nervous system: neurotrophins as neuroprotection mediators in CNS injury. Interactions between the cells of the immune and nervous system: neurotrophins as neuroprotection mediators in CNS injury. 2007; 146: 385-401.
