Нейробиологиские основы девиантного поведения при алкоголизме Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 611.813.14.018: 599.323.4

НЕИРОБИОЛОГИСКИЕ ОСНОВЫ ДЕВИАНТНОГО ПОВЕДЕНИЯ ПРИ АЛКОГОЛИЗМЕ

© А. В. Ахмадеев, Л. Б. Калимуллина*

Башкирский государственный университет Россия, Республика Башкортостан, 450076, Уфа, ул. Заки Валиди, 32.

*Email: mpha@ufanet.ru

Целью работы являлся анализ поведения и содержания биогенных аминов в миндалевидном комплексе мозга (МК) предпочитающих (ПА) и не предпочитающих алкоголь (НА) крыс до и после акустического стресса. Показано, что ПА крысы до стресса проявляют повышенную двигательную активность и исследовательскую деятельность в «открытом поле» и признаки тревожности в «приподнятом крестообразном лабиринте», содержание дофамина и норад-реналина в МК у них выше, чем у НА крыс. После стресса у обеих групп крыс уровень тревожности возрастает, но паттерн его проявления различается. ПА крысы становятся гиперактивными, а НА - пассивными. Указанные особенности поведения сопровождаются снижением дофамина и серотонина при увеличении содержания норадреналина. На основании результатов работы и обобщения сведений литературы авторы приходят к выводу, что предрасположенность к алкоголизму обусловлена изменением стресс-реактивности организма.

Ключевые слова: предрасположенность к алкоголизму, стресс, миндалевидный комплекс, биогенные амины.

Введение

Нарушение деятельности дофаминергической системы - важное патогенетическое звено многих психоневрологических заболеваний, включая и аддик-тивные расстройства. Основным этиологическим фактором этих заболеваний является нарушение функционирования дофаминовых рецепторов, среди которых наиболее распространен в нервной системе дофаминовый рецептор второго типа ^2-рецептор).

Профилактика аддиктивных расстройств должна осуществляться комплексом мер, учитывающих социальные, психологические и биологические факторы возникновения заболевания. Разработка эффективных превентивных мер возможна на основании знаний особенностей нейромедиаторного обмена, лежащих в основе предрасположенности к употреблению психоактивных веществ (ПАВ), генетических факторов, и поведенческих паттернов, указывающих на риск возникновения наркомании.

Первое экспериментальное подтверждение роли полиморфизма локуса Taq ^ DRD2 в развитии алкогольной зависимости получено на молекулярно-генетических моделях - крысах, имеющих различия в аллельной структуре указанного локуса, которые были выявлены после генетического анализа, и к моменту эксперимента прошли 20 поколений [1]). Крысы с генотипом А1/А1 по локусу Taq ^ DRD2, показавшие ускоренные темпы формирования толерантности и психической зависимости по сравнению с крысами с генотипом А2/А2 в эксперименте с принудительной алкоголизацией, являются валидной моделью для исследования факторов, определяющих предрасположенность к ПАВ.

Целью работы являлся сравнительный анализ до и после действия стрессора поведения и содержания биогенных аминов предпочитающих (ПА) и не предпочитающих (НА) алкоголь крыс.

Материалы и методы

Использованные в работе предпочитающие алкоголь (ПА, генотипом А1/А1) и не предпочитающие алкоголь (НА, генотипом А2/А2) крысы получены из популяции крыс линии WAG/Rij после генотипирования локуса Taq ^ DRD2 (выполненного под руководством проф. Э. К. Хуснутдиновой) скрещивания гомозиготных животных и выявления в последующем предпочтения алкоголя

в тесте двух поилок. Среди крыс, имевших генотип А1/А1, для получения потомства (которое использовано для проведения данной работы) были отобраны особи (самки и самцы) имевшие высокие темпы нарастания количеств потребляемого спирта при принудительной алкоголизации в течение двух недель и с установкой двух поилок на третьей неделе эксперимента предпочитавшие пить спирт. В группе крыс с генотипом А2/А2, наоборот, для получения потомства были отобраны особи, которые после двух недельного периода принудительной алкоголизации, при возможности выбора (с установкой двух поилок), предпочитали пить воду. В настоящем исследовании использовано четвертое поколение неаудигенных ПА и НА крыс.

Поведение ПА и НА крыс (всего 40 крыс в возрасте шести месяцев обоего пола) изучено с использованием двух тестов - открытого поля (ОП) и приподнятого крестообразного лабиринта (ПКЛ). Круглое ОП представляло собой арену 1.5 м в диаметре с высотой стенок 0.8 м, дно которой имело деления на сектора. В открытом поле было очерчено 3 зоны: центральная, промежуточная (6 сегментов) и периферическая (12 сегментов). Освещение производилось 2 лампами, мощностью по 60 вт, которые располагались на высоте 1.5 м от дна камеры над центральными сегментами поля.

ПКЛ, использованный в работе, представлял собой установку, имеющую два рукава, в месте пересечения которых находилась открытая площадка. Один из рукавов лабиринта имел закрытые отсеки. Лабиринт устанавливали на высоте одного метра от пола. Мы регистрировали время нахождения крысы в открытом (ОР) и закрытом (ЗР) рукавах лабиринта, количество стоек в ОР и ЗР рукавах, латентный период до первого движения, общую неподвижность в ОР и ЗР рукавах, количество свешиваний в ОР, количество заходов в ОР и ЗР.

Эксперимент, направленный на выяснение действия стрессорных нагрузок на ПА и НА крыс, проводился в три этапа: 1 этап - тестирование поведения животных в ОП и в ПКЛ в течение 5 дней; 2 этап -пятикратное в течение пяти дней воздействие стрессора; 3 этап - повторное тестирование поведенческих реакций животных в ОП и ПКЛ в течение 5 дней. В качестве стрессора использовали пятикратную еже-

ISSN 1998-4812

Вестник Башкирского университета. 2015. Т. 20. №2

445

дневную аудиогенную стимуляцию, которая проводилась в специальной камере (60x60x60 см) по методике [2], используя «звон ключей» («keys ringing»).

Содержание биогенных аминов и их метаболитов в МК (по 20 ПА и 20 НА крыс до и после стресса, самцы и самки) определяли на ВЭЖХ (Аквилон, Россия) со спектрофотометрическим детектором (UVV-104 M) в ЦКП БашГУ. Область МК выделяли из на-тивного мозга и гомогенизировали в 20 объемах холодной 0.1М перхлорной кислоты (Sigma, USA) и 1пг/50 мкл дигидроксибензиламина гидробромида (Sigma, USA) в качестве внутреннего стандарта. Гомо-генизат центрифугировали (при -20 °С) в течение 10 минут при 6000 оборотах в минуту. Супернатант подвергали микрофильтрации с помощью специальных наборов фирмы «Биохром» (Россия). После повторного центрифугирования пробы анализировали на содержание моноаминов (норадреналина, дофамина и серотонина) и их метаболитов - 3,4-диоксифенилук-сусной кислоты (ДОФУК) и 5-оксииндолуксусной кислоты (5-ГИУК). Полученные результаты систематизировали, и подвергали статистической обработке с помощью пакета программ Statistica 6.

Результаты и обсуждение

Данные, характеризующие поведение ПА и НА крыс представлены в табл. Они демонстрируют, что общая двигательная активность крыс ПА значимо больше, чем у крыс НА. Наибольшие различия по числу амбуляций между крысами ПА и НА выявляются в периферической (затемненной) зоне, в которой крысы ПА пребывают и двигаются в 1.5 раза больше, чем в центральных и промежуточных секторах. Эти данные позволяют предполагать у крыс ПА наличие большей тревожности. На это указывают и данные регистрации груминга, длительность которого у ПА крыс вдвое меньше по сравнению с крысами НА.

Предположение о большей тревожности крыс ПА мы решили проверить с использованием ПКЛ. Анализ результатов показал, что ПА крысы значимо отличаются от НА крыс по выраженности исследовательской деятельности в ЗР (p < 0.05), у них снижена длительность груминга (p < 0.05) в обеих рукавах лабиринта, что при почти равном количестве его эпизодов у крыс обеих групп показывает, что он у крыс ПА имеет характеристики незавершенного груминга.

Анализ биогенных аминов в МК показал, что у крыс ПА достоверно выше содержание норадреналина (p < 0.01). Анализ содержания ДОФУК выявил, что при почти равных количествах содержания ДОФУК, содержание дофамина (ДФ) значимо больше у крыс ПА (p < 0.05). Соотношение ДОФУК/ДФ вдвое больше (0.39±0.03 против 0.17±0.03) у крыс ПА, что указывает на его ускоренный метаболизм. Величины, характеризующие содержание серотонина и 5-ГИУК у ПА и ОА крыс статистически не различались.

Исследование поведения в ПКЛ после действия стрессора показало, что обе группы крыс больше времени проводят в закрытом рукаве лабиринта (ЗР, таблица) по сравнению со светлым рукавом (ОР, p < 0.05), выявляя проявление тревожного поведения. Это подтверждают и показатели груминга, длительность которого и количество эпизодов изменяются после действия стрессора, как у крыс ПА, так и крыс НА.

Изучение двигательной активности крыс в ОП после действия стрессора показало, что у крыс ПА она увеличивается, в то время как у крыс НА - уменьша-

ется. Увеличение горизонтальной активности крыс ПА после действия стрессора не достигает уровня значимости, но обращает на себя внимание изменение трека перемещения крыс по разным секторам поля. Если до действия стрессора ПА крысы двигались преимущественно по периферии поля (что стало одним из оснований для предположения, что им свойственна тревожность), после стресса они стали, не только более активно перемещаться, но и больше выходить в центральные (в 1.3 раза) и промежуточные сектора (1.2 раза) ОП.

У крыс НА действие стрессора привело к уменьшению двигательной активности. При этом значимо уменьшилось посещение центра поля (р < 0.05), что следует объяснить повышением чувства страха при выходе в центральные освещенные сектора поля. У крыс ПА возросший уровень тревожности после действия стрессора, регистрируемый в ПКЛ, проявляется увеличением двигательной активности в ОП. Это сопровождается учащением посещения центральных и промежуточных секторов ОП, которое свидетельствует об «утрате чувства опасности». Следует отметить и особенности проявления исследовательской деятельности крыс после действия стрессора. У крыс ПА она снижается незначимо, в то время как у крыс НА снижение достигает уровня значимости на периферии ОП (табл.). Процентное соотношение совершаемых крысами НА вертикальных стоек по зонам ОП после стресса, остается неизменным, в то время как у крыс ПА число стоек в центральной зоне увеличивается в 1.5 раза, в промежуточных секторах почти в два раза. Это свидетельствует о том, что крысы ПА реагируют на действие стрессора не только увеличением двигательной активности в центральных и промежуточных секторах ОП, но это увеличение сопровождается и возрастанием активности исследовательской деятельности. Стремление исследовать новые пространства у мышей и крыс расценивается как признак растормо-женности (дезингибиции), и это, в целом, может быть интерпретировано, как усиление поискового поведения [11].

После действия стрессорных нагрузок содержание дофамина и серотонина в МК, как у крыс ПА, так и НА снижается. При этом снижение содержания дофамина почти равно у обеих групп крыс (у ПА на 33%, а у НА на 42%), а серотонина - более выражено у НА (16 процентов у ПА и 28 у НА) крыс. В отличие от дофамина и серотонина, в ответ на стресс содержание норадреналина увеличивается (у крыс ПА на 17%, а у крыс НА - на 30%).

Обнаруженное нами повышенное содержание норадреналина, дофамина и ускоренный метаболизм последнего в МК у ПА крыс объясняет особенности их поведения, выявленные у «наивных» крыс, т.е. до стресса. Это находит подтверждение в высказываниях ведущих физиологов о том, что «дофамин и норадре-налин причастны к активному типу поведения» [4]. К сожалению, нам не удалось найти сведений литературы, характеризующих содержание этих катехолами-нов в МК у ПА крыс. Но они согласуются с результатами [9, 10], выявившими увеличение содержания дофамина в прилежащем ядре перегородки и в пре-фронтальной коре у ПА крыс. Данные о повышенном содержании норадреналина согласуются с находками [12], которые обнаружили повышенное содержание НА в конечном мозге ПА крыс.

Таблица

_Показатели поведения предпочитающих и не предпочитающих алкоголь крыс (Ы ± m)_

_ОТКРЫТОЕ ПОЛЕ_

_Двигательная активность (количество амбуляций)_

__Предпочитающие алкоголь крысы__

В центральной зоне | В промежуточной зоне | В периферической зоне | Общая

до 9.75 ±1.06

до 10.16 ±0.93

2.77 ±0.47

3.28 ±0.61

0.28 ±0.12

0.64 ±0.44

после 12.57 ±1.80

после 8.26* ±0.83о

3.77 ±1.08

2.58 ±0.80

0.31 ±0.14

0.78 ±0.46

до после до после

45.57 56.94 163.77 170.34

±7.68 ±8.24 ±19.91 ±9.48

Не предпочитающие алкоголь крысы после до после

31.36 98.36 92.10

±4.35 ±5.86 ±5.60

Исследовательская деятельность (количество стоек) Предпочитающие алкоголь крысы 9.31 38.62 32.00

±2.98 ±7.27 ±6.62

Не предпочитающие алкоголь крысы

4.94 32.16 23,. 4*

±1.35 ±5.80 ±5.29

Длительность груминга (с) Предпочитающие алкоголь крысы 0.48 70.91 66.35

±0.32 ±17.11 ±13.24

Не предпочитающие алкоголь крысы 1.10 2.36 114.22 181.56*

±0.94 ±1.49 ±26.10 ±7.95

до 45.66 ±7.23

5.57 ±1.21

6.59 ±1.38

0.42 ±0.23

до 219.09 ±27.66

до 154.18 ±8.76

45.17 ±7.28

42.24 ±7.60

71.48 ±17.28

115.96 ±29.43

после 236.88 ±16.24

после 131.66* ±9.35

41.88 ±8.85

30.64* ±7.18

67.14 ±13.34

184.74* ±15.45

ПРИПОДНЯТЫМ КРЕСТООБРАЗНЫЙ ЛАБИРИНТ

Предпочитающие алкоголь крысы

Время пребывания в закрытом рукаве (с)

Время пребывания в открытом рукаве (с)

Длительность груминга в закрытом рукаве (с)

Количество эпизодов грумин-га в закрытом рукаве

до 396.13 ±30.57

до 466.34 ±30.87

после 512.44* ±29.88

после 653.93* ±26.69

до 503.80 ±19.45

до 433.71 ±30.87

после до после

383.51* 15.11 49.93*

±30.57 ±2.39 ±9.15

Не предпочитающие алкоголь крысы

после

247.33 *±26.73

до 28.43 ± 5.35

после 192.81* ± 54.54

до 3.04 ±0.74

до 2.43 ± 0.37

после 4.95 * ±0.54

после 9.83* ±3.12

Примечание: * p < 0.05 при сравнении до и после стресса

Главным фактором, определяющим повышение содержания дофамина у ПА крыс, является то, что они имеют генотип А1/А1 по локусу Taq 1A DRD2. Исследованиями по молекулярной генетике показано, что аллель А1 этого локуса находится в неравновесии по сцеплению (D' = 0.855) с минорными аллелями (Т) двух фланкирующих 6 экзон интронных локусов (rs 2283265 и rs 1076560) этого гена, снижающими экспрессию короткой изоформы (D2S). Приведенные данные [14] подтверждены и [7], показавшими наличие неравновесия по сцеплению между локусами rs1800497 and rs2283265 (D' = 0.78). Так как DRD2 у крысы на 95% гомологичен с этим геном человека [8], можно полагать, что выявленная закономерность имеет место и у крыс. Известно, что снижение экспрессии короткой изоформы D2 и изменение в силу этого соотношения длинной и короткой изоформ приводит к повышению содержания внеклеточного дофамина [5, 13].

Особенности паттерна поведения, выявленного у НА крыс (снижение общей двигательной активности и урежение посещений центра, менее интенсивная исследовательская деятельность) свидетельствуют о формировании у них пассивной, в целом адекватной ситуации, стратегии поведения. У ПА крыс двигательная активность повышается, при этом учащается посещение ими центральных и промежуточных зон ОП, т.е. тревога находит свое выражение через гиперактивность

с элементами «бесстрашия», и отражает активную стратегию поведения, направленную на борьбу с опасностью. Она сходна с проявлениями алкоголизма второго типа [6], для которого характерно асоциальное поведение.

Отмеченные факты позволяют предполагать, что механизмы формирования стрессорной реакции у ПА и НА имеют особенности, предопределенные, видимо, изменением соотношения стресс-активирующих и стресс-ингибирующих механизмов у этих двух групп крыс [3].

Работа выполнена при финансовой поддержке базовой части Госзадания Минобрнауки РФ, тема № 301-14.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ахмадеев А. В. Экспериментальные подходы к исследованию роли генотипа по локусу Taq 1А дофаминового Д2 рецептора в наркотической зависимости // Российский физиологический журнал им. И. М. Сеченова. 2010. Т. 96. №5. С. 513-520.

2. Кузнецова Г. Д. Аудиогенные припадки у крыс различных линий // Журнал Высшей нервной деятельности. 1998. Т. 48. №1. С. 143-152.

3. Пшенникова М. Г. Феномен стресса. Эмоциональный стресс и его роль в патологии // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2000. №2. С. 24-31.

4. Шаляпина В. Г. Основы нейроэндокринологии. 2005. СПб. Элби-СПб. 346 с.

ISSN 1998-4812

BeciHHK EamKHpcKoro yHHBepcHTeTa. 2015. T. 20. №2

447

5. Bertolino A., Fazio L., Caforio G., Blasi G., Rampino A., Romano R., Giorgio A., Taurisano P., Papp A., Pinsonneault J., Wang D., Nardini M., Popolizio T., Sadee W. Functional variants of the dopamine receptor D2 gene modulate prefron-to-striatal phenotypes in schizophrenia // Brain. 2009. Vol. 132. No. 2. Pp. 417-425.

6. Cloninger C. R. Neurogenetic adaptive mechanisms in alcoholism // Science. 1987. Vol. 236. No. 4800. Pp. 410-416.

7. Jocham G., Klein T. A., Neumann J., von Cramon D. Y., Reuter M., Ullsperger M. Dopamine DRD2 polymorphism alters reversal learning and associated neural activity // J. Neuroscience. 2009. Vol. 29. No. 12. Pp. 3695-3704.

8. Jonathan M., Sagvolden T. Sequence analysis of DRD2, DRD4, and DAT in SHR and WKY rat strains. // Behavior and Brain Function. 2005. Vol. 1. № 24. P. 112-117.

9. Katner S. N., Weiss F. Neurochemical characteristics associated with ethanol preference in selected alcohol-preferring and -nonpreferring rats: a quantitative microdialysis study // Alcohol Clinical Experimental Research. 2001. Vol. 25. No. 2. Pp. 198-205.

10. Leggio B., Masi F., Grappi S., Nanni G., Gambarana C., Colombo G., de Montis M. G. Sardinian alcohol-preferring and

non-preferring rats show different reactivity to aversive stimuli and a similar response to a natural reward // Brain Research. 2003. Vol. 973. No 2. Pp. 275-284.

11. Natalie M. Zahr, Edith V. Sullivan. Translational Studies of Alcoholism // Alcohol Research Health. 2008. Vol. 31. No. 3. Pp. 215-230.

12. Penn P. E., McBride W. J., Lumeng L, Gaff T. M., Li T. K. Neurochemical and operant behavioral studies of a strain of alcohol-preferring rats // Pharmacology and Biochem Behavior. 1978. Vol. 8. No 4. Pp. 475-481.

13. Usiello A., Baik J. H., Roug-Pont F., Picetti R., Dierich A., LeMeur M., Piazza P. V., Borrelli E. Distinct functions of the two isoforms of dopamine D2 receptors // Narure. 2000. Vol. 408. No. 6809. Pp. 199-203.

14. Zhang Y., Bertolino A., Fazio L., Blasi G., Rampino A., Romano R., Mei-Ling Lee T., Tao Xiao, Papp A., Wang D., Sadee W. Polymorphisms in human dopamine D2 receptor gene affect gene expression, splicing, and neuronal activity during working memory // Journal The Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 2007. Vol. 104. No. 51. Pp. 20552-20557.

nocmynma e peda^um 18.06.2014 г.

448

BHOHOrH^

NEUROBIOLOGICAL BASICS OF THE DEVIANT BEHAVIOR UNDER ALCOHOLISM

© A. V. Akhmadeev, L. B. Kalimullina*

Bashkir State University 32 Zaki Validi St, 450076 Ufa, Republic of Bashkortostan, Russia.

Phone: +7 (347) 273 67 76.

*Email: mpha@ufanet.ru

Disruption of the dopaminergic system is an important pathogenic link of many diseases, including addictive disorders. A major factor in these diseases is the dysfunction of the dopamine receptor of the second type (D2 receptor). The development of effective preventive measures are possible on the knowledge of neurotransmitter metabolism, genetic factors, and behavioral patterns that indicate the risk of addiction. The aim of this study was investigation the behavior and content of biogenic amines in the Amygdala of brain alcohol-preferring and non- alcohol-preferring rats before and after acoustic stress. Authors made the analysis of behavioral orientation-research reactions and content of biogenic amines and their metabolites in the Amygdala before and after exposure to the stressor. The object of the study were rats with genotype A1/A1 on the locus Taq 1A gene D2 receptor, after breeding on the preference of alcohol. As a stressor used five times daily audiogenic stimulation. It is shown that alcohol-preferring rats exhibit increased locomotor activity before stress and rearing in "open field" and anxiety-like behavior in the "elevated plus maze"; the content of dopamine and norepinephrine in amygdala is higher than in non-alcohol-preferring rats. After stress in both groups of rats, anxiety level increases, but the pattern its manifestation is different. Alcohol-preferring rats are hyperactive and non-alcohol-preferring rats are passive. The above behavior is accompanied by decrease of dopamine and serotonin content and norepinephrine increase. On the basis of the results and summarized literature, authors concluded that the predisposition to alcoholism is explained by the change of stress reactivity of an organism.

Keywords: predisposition to alcoholism, amygdala, stress, biogenic amine.

Published in Russian. Do not hesitate to contact us at bulletin_bsu@mail.ru if you need translation of the article.

REFERENCES

1. Akhmadeev A. V. Rossiiskii fiziologicheskii zhurnal im. I. M. Sechenova. 2010. Vol. 96. No. 5. Pp. 513-520.

2. Kuznetsova G. D. Zhurnal Vysshei nervnoi deyatel'nosti. 1998. Vol. 48. No. 1. Pp. 143-152.

3. Pshennikova M. G. Fenomen stressa. Emotsional'nyi stress i ego rol' v patologii. Patologicheskaya fiziologiya i eksperimental'naya ter-apiya. 2000. No. 2. Pp. 24-31.

4. Shalyapina V. G. Osnovy neiroendokrinologii [Basics of neuroendocrinology]. 2005. SPb. Elbi-SPb.

5. Bertolino A., Fazio L., Caforio G., Blasi G., Rampino A., Romano R., Giorgio A., Taurisano P., Papp A., Pinsonneault J., Wang D., Nar-dini M., Popolizio T., Sadee W. Brain. 2009. Vol. 132. No. 2. Pp. 417-425.

6. Cloninger C. R. Science. 1987. Vol. 236. No. 4800. Pp. 410-416.

7. Jocham G., Klein T. A., Neumann J., von Cramon D. Y., Reuter M., Ullsperger M. J. Neuroscience. 2009. Vol. 29. No. 12. Pp. 36953704.

8. Jonathan M., Sagvolden T. Behavior and Brain Function. 2005. Vol.1. No. 24. Pp. 112-117.

9. Katner S. N., Weiss F. Alcohol Clinical Experimental Research. 2001. Vol. 25. No. 2. Pp. 198-205.

10. Leggio B., Masi F., Grappi S., Nanni G., Gambarana C., Colombo G., de Montis M. G. Brain Research. 2003. Vol. 973. No 2. Pp. 275284.

11. Natalie M. Zahr, Edith V. Sullivan. Translational Studies of Alcoholism. Alcohol Research Health. 2008. Vol. 31. No. 3. Pp. 215-230.

12. Penn P. E., McBride W. J. Pharmacology and Biochem Behavior. 1978. Vol. 8. No 4. Pp. 475-481.

13. Usiello A., Baik J. H., Roug-Pont F., Picetti R., Dierich A., LeMeur M., Piazza P. V., Borrelli E. Narure. 2000. Vol. 408. No. 6809. Pp. 199-203.

14. Zhang Y., Bertolino A., Fazio L., Blasi G., Rampino A., Romano R., Mei-Ling Lee T. Journal The Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 2007. Vol. 104. No. 51. Pp. 20552-20557.

Received 18.06.2014.