CC BY
17МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
АПРОБАЦИЯ НОВОГО МЕТОДА ПРОБОПОДГОТОВКИ QUECHERS В ИССЛЕДОВАНИИ ПО ХИМИЧЕСКИМ СРЕДСТВАМ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ
Д.А. Колунтаев1, Е.В. Березовский2, А.В. Доля2, Н.В. Пухальская1, д.б.н., 1ВНИИА, 2РГАУ-МСХА
С использованием нового метода пробоподготовки, основанного на Европейской методике QuEChERS, позволяющего унифицировать специфику определения действующих веществ были определены особенности перемещения химических веществ, входящих в современные препараты защиты растений: имидаклоприда, флуопиколида и пропамокарб-гидрохлорида. Было установлено влияние препарата Престиж, используемого для обработки клубней, на динамику перераспределения веществ, наносимых на вегетативные органы картофеля.
Ключевые слова: методика QuEChERS, препарат Престиж, препарат Инфинито, имидаклоприд, картофель.
Введение. Настоящая работа посвящена апробации новой европейской методики QuEChERS, тестируемой в исследовании влияния препарата Престиж на перераспределение других химических средств защиты растений [1, 2]. QuEChERS, это аббревиатура из пяти слов - Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe, что в переводе обозначает - «быстрый, легкий, недорогой, эффективный, надежный и безопасный». Сегодня для тестирования на остаточные количества пестицидов в растениях в нашей стране используются разные методики для каждого вещества: отдельно для имидаклоприда [3], отдельно для пропамокарб-гидрохлорида [4], а для новых веществ, таких методик длительное время вообще нет, например, в нашем экспериментетаковым является флуопиколид. Новая методика пробоподготовки позволяет в одной пробе определять все искомые вещества, даже входящие в самые новейшие препараты. Мультиметод QuEChERS отличается от современных отечественных методик тем, что является намного более дешевым, универсальным и безопасным. Отличием пробоподготовки является применение 10мл растворителя ацетонитрила, используемого в закрытой капсуле. Тогда как в принятых сегодня методиках используется до100 мл ацетона, и гексан, что более опасно. Время, затрачиваемое на определение каждого вещества по старым методикам, составляет 2 суток, тогда как по новой методике- все вещества могут быть определены за 1 день.
Тестирование методики проводили в полевом опыте с картофелем, сосредоточив внимание на определении нового вещества имидаклоприд, относящегося к новым поколением пестицидов группы "неоникотиноидов" и используемый в современных препаратах, в частности в препарате Престиж. Имидаклоприду, как и всем неоникотиноидам, свойственны высокая биологическая активность против широкого спектра вредителей сельскохозяйственных культур, низкие нормы расхода, высокое системное действие в растениях [5, 6, 7]. Разработчики новых форм инсектицидов, в состав которых входит имидаклоприд, советуют проводить дополнительные исследования по влиянию используемых веществ, поскольку такие влияния малоизучены [8].
Цель эксперимента - тестирование возможности использования нового метода пробоподготовки QuEChERS для жидкостной хроматографии при определении содержания остаточных количеств пестицидов в растениях картофеля. В задачу исследования входило описание динамики распределения пестицидов в растении после обработки препаратами.
Методика эксперимента. Имидаклоприд применяли на картофеле сорта Удача двумя способами: при обработке клубней препаратом Престиж 4л/га) при посадке и при обработке вегетативной части растений имидаклопридом (0,25л/га в составе препарата Командор), совместно с фунгицидами
флуопиколидом и пропамокарб-гидрохлоридом, входящими в состав препарата Инфинито (1,5 л/га) (табл.1.). Расход рабочего раствора 300 л/га.
1. Схема полевого опыта
Варианты опыта Обработка клубней при посадке от проволочника Обработка вегетативной части от фитофтороза и вирусов
Вариант А Обработка не проводилась Флуопиколид (62,5г/л) Пропамокарб-гидрохлорид(625г/л) Имидаклоприд (200г/л)
Вариант Б Препарат Престиж: Имидаклоприд (140г/л) + пенцику-рон (150 г/л) Флуопиколид (62,5г/л) Пропамокарб-гидрохлорид(625г/л) Имидаклоприд (200г/л)
Отбор проб был произведен в три приема: через 1, 2 и 3 недели после обработки листьев препаратом Инфинито в фазу цветения. Данные получены в полевом опыте вегетационного сезона 2009г., проведенном на двух соседних полях (1 га и 1,5 га) полевой опытной станции РГАУ-МСХА им. К.А.Тимирязева, различия в технологической схеме обработок только в предпосевной обработке клубней препаратом Престиж. Анализ остаточных количеств химических веществ был проведен мультиметодом пробоподготовки QuEChERS [1].
Принцип метода. Метод скрининга остаточных количеств пестицидов основан на извлечении растворителем из гомогенизированной смеси образца действующих веществ пестицидов с одновременной очисткой смесью солей и последующей идентификацией и количественным определением с помощью газовой хроматографии с электронно-захватным и термоионным детекторами, газовой масс-спектрометрии и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с тандемным масс-спектрометрическим детектором [2,9].
Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки. Избирательность метода основана на том, что детектирование действующих веществ пестицидов специфично для каждого искомого вещества, что обосновывается различной степенью разделения на хроматографиче-ской колонке, а также характерная фрагментация ионов на дочерние ионы действующих веществ.
Для выделения искомых веществ применяли экстракцию ацетонитрилом в соотношении 10 г пробы (клубни, стебель), 7,5 г листья, 5 г - корень и клубень:10 мл растворитель. Экстракцию осуществляли согласно методики ионообменным сорбентом Bondesil PSA, после чего экстракты исследовали методом жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии (ВЭЖХ/МС/МС). Хроматографирование и регистрацию масс-спектров в диапазоне масс от 50 до 500 производили на хро-матомасс-спектрометре TripleQuad 6410 LC/MS/MS фирмы Agilent.
Результаты и их обсуждение. Оценка динамики перемещения химических веществ, входящих в состав используемых растворов, для обработки листьев картофеля, показала, что из трех используемых веществ более активно перемещается в базипетальном направлении Имидаклоприд (рис. 1).
0,0 -10,0 -20,0 -30,0 -40,0 -50,0 -60,0 -70,0 -80,0 -90,0 -100,0
Лмидакпопри
Флуоп иколид
1ропам окарб гидро)
□ 1-2 нед +обработка клубней препаратом Престиж
□ 1-2 нед + без обработки клубней препаратом Престиж
Рис. 1. Сравнительное снижение содержания веществ в листьях между 1 и 2 неделей после обработки по листьям с обработкой и без обработки клубней препаратом Престиж
Обработка клубней препаратом Престиж является фактором, оказывающим существенное влияние на динамику оттока всех исследуемых веществ из листьев. Но направленность этого влияния различалась. По-видимому, одновременная обработка клубней и листьев препаратами, содержащими имидаклоприд, снижает активность оттока этого инсектицида из листьев: одновременное перемещение имидаклоприда в базипетальном и акропетальном направлениях, взаимно уменьшают интенсивность перемещения, что выражается в более высоких концентрациях веществ в листьях в динамике. В литературе, посвященной изучению особенностей этого вещества, отмечается влияние имидаклоприда на метаболизм растений посредством хлорникотиниловых кислот и никоти-намида [5, 8].
В вариантах с обработкой клубней препаратом Престиж усиливался отток из листьев и фунгицидов - флуопиколида на 21,3% и пропамокарб-гидрохлорида на 11,4%, что снижало их содержание в листьях.
Через 2 недели после обработки листьев вещества, входящие в состав препарата Престиж, наносимые на клубни, активировали перемещение фунгицидов от листьев к корням. Этот процесс сопровождался увеличением выхода этих веществ в почву и увеличением их концентрации в почве в 2,75 и 2,62 раза для пропамокарб-гидрохлорида и флуопиколида соответственно.
Все препараты, нанесенные только на листья, в течение 1 недели попадали в клубни. Степень накопления препаратов в клубнях зависела от того, были ли предварительно клубни обработаны препаратом Престиж, содержащим имидаклоприд и пенцикурон (рис. 2).
Рис. 2. Содержание в клубнях флуопиколида и пропамокарб-гидрохлорида (мг/кг) через 3 недели после обработки листьев препаратом Инфинито (А - без обработки клубней препаратом Престиж, Б - с обработкой клубней препаратом Престиж)
Обработка клубней стимулировала активность базипеталь-ного передвижения препаратов флуопиколида и пропамокарб-гидрохлорида, оказывая влияние на метаболизм растений. При этом результаты содержания соединений в клубнях не были завышены и соответствовали нормам, утвержденным законодательством РФ [10-12]. Присутствие имидаклоприда и
пенцикурона в рецептуре предпосевной обработки вызывает увеличение оттока флуопиколида и пропамокарб-гидрохлорида в нижнюю часть растений, по сравнению с образцами без обработки и передвижение их в почву, окружающую корневую зону.
Новый метод пробообработки позволил определить очень низкие дозы исследуемых веществ в тканях растений. Одновременное нанесение имидаклоприда и на клубни и на листья вызывает изменение его перераспределения в растении. Общее содержание вещества в растении было принято нами за 100%, а содержание его в разных органах было выражено в процентах от общего количества. Таким образом, стало возможно наглядно представить изменение динамики распределения вещества при разных способах обработки
Изначально содержание имидаклоприда в листьях обоих вариантов одинаково (0,3 мг/кг и в варианте с обработкой клубней и в варианте без обработки клубней). Через неделю после обработки по листьям содержание имидаклоприда в клубнях составило 0,007 и 0,03 мг/кг соответственно в вариантах без обработки препаратом Престиж и с обработкой препаратом Престиж. В варианте без обработки клубней снижение концентрации в листьях идет постепенно, вещество перемещается в базипетальном направлении. При одновременном движении имидаклоприда от клубня вверх и сверху вниз, создается иная картина накопления вещества (рис. 3.)
А
Листья
3 недели
Корень
2 недели
1 неделя
□ 1 неделя □ 2 недели □ 3 недели
неделя
□ 1 неделя □ 2 недели □ 3 недели
Рис. 3 Динамика изменения содержания имидаклоприда (%) в тканях растений картофеля на 1, 2 и 3 неделю после обработки листьев при нанесении его и на листья растений картофеля и на клубни при посадке. (А - без обработки клубней, Б - с обработкой)
Данные рисунка 3 показывают, что при обработке клубней и листьев перемещение препарата характеризуется его перетеканием с максимальным накопление в корнях и более равномерным распределением по всем органам растения, по
-28,1
-41,9
-56,5
62,2
-86,3
Б
сравнению с обработкой только листьев. На 3 неделю после обработки листьев максимальное количество препарата сосредотачивается в корнях растения, что усиливало защиту молодых клубней от вредителей. Содержание вещества пен-цикурон, входящего в состав препарата Престиж, не уменьшалось с течением вегетации, наблюдалась стабильная концентрация вещества в подземных органах с тенденцией к увеличению до 0,1-0,2 мг/кг. Влияние обработки клубней препаратом Престиж сказалось и на содержании макроэементов в клубнях (рис.4). Установлено, что обработка клубней препаратом Престиж способствовала повышению продуктивности растений и уменьшению содержания макроэлементов в клубнях калия с 2,71 до 2,11%, фосфора с 0,57 до 0,43%, общего азота на с 3 до 2,1%. Влияние препаратов на содержание макроэлементов в клубнях определяется одновременно многими факторами и может варьировать от условий питания, года исследований и продуктивности растений. Обработка препаратом вызвала увеличение урожая с 26,2 т/га (без обработки) до 36,0 т/га.
3,5
2,5
§ 1,5
0) s
S 1 £ а. о
Ч 0,5
о
О
0
""271
2,11
2,1
0,43
0,57
K2O, %
P2O5, %
N общ, %
□ клубень( Престиж) □ клубень (б/о)
Рис.4. Содержание макроэлементов в клубнях картофеля в вариантах с обработкой клубней препаратом Престиж и без обработки
Таким образом, в нашем эксперименте было установлено влияние препарата Престиж, используемого при обработке посадочного материала, на активность перемещения всех используемых веществ, наносимых на листья картофеля в период вегетации, а также на содержание макроэлементов в клубнях картофеля. Новый метод пробоподготовки в опыте, используемый для хроматографического анализа является высокочувствительным к невысоким концентрациям химических веществ во всех органах растений картофеля и в почве.
Литература
1. Anastassiades, M., Lehotay, S.J, Stajnbaher, D, and F.J. Schenck //The Journal ofAOACINTERNATIONAL. Vol. 86. - P. 412-431.
2. Бауэр, Г., Энгельгард, Х., Хеншен, А., [и др]. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии. Москва: Мир, 1988. - 688 с.
3. Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде: Справочник. - Т. 1 / сост. М.А. Клисенко, А.А. Калинина, К.Ф. Новикова [и др.] - М.: Колос, 1992. - 567 с.
4. Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде.: Спарвочник. - Т.2 / сост. М.А. Клисенко, А.А. Калинина, К. Ф. Новикова [и др.] - М.: Агропромиз-дат, 1992. - 416 с.
5. Pflanzenschutz Nachrichten Bayer, Calipso. 2001.- Levercuzen, V. 54. -P. 281-291.
6. Перелж пестицидiв i агрохiмiкатiв, дозволених до використання в Укрш'ш. -Киев, 2001. -С. 31-50.
7. Motohiro Tomizawa, John E.Casida. Minor structural changes in nicoti-noid insecticides confer differential subtype selectivity for mammalian nicotinic acetylcholine receptors. - British J. Pharmacology. -1999. -127. -P. 115-122.
8. Ермолова, Л.В., Проданчук, Н.Г., Жминько, П.Г., Лепешкин, И.В. Сравнительная токсикологическая характеристика новых неоникоти-ноидных инсектицидов // Сучасш проблеми токсикологи. Киев. -2004. - №2.
9. Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды, для определения микроколичеств пестицидов. Утверждены заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979, N 2051-79.
10. Федеральный закон о санитарно-эпидемиологическом благополучии населения от 30 марта 1999 года №109-ФЗ: принят Гос. Думой 12 марта 1999 г.: одобрен Советом Федерации 17 марта 1999 г.
11. Гигиенические нормативы содержания пестицидов в объектах окружающей среды. ГН 1.2.1323-03; с дополнениями № 1-11.
12. Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов. Санитарно-эпидемиологические правила и нормативы СанПиН 2.3.2.1078-01-Москва; ФГУП «ИнтерСЭН», 2002. - 168 с.
3
3
2
NEW SAMPLING PROCEDURE BASED ON THE QuEChERS-METHOD IN STUDIES OF PLANT-PROTECTING CHEMICALS
D.A. Koluntaev, E.V. Beresovskii*, A.V. Dolya*, N.V. Pukhalskaya Pryanishnikov All-Russian Scientific Research Institute of Agrochemistry, Russian Academy of Agricultural Sciences, ul Pryanish-
nikova 31a, Moscow, 127550 Russia *Russian State Agricultural University - Moscow Agricultural Academy, Russian Academy of Sciences, ul Timiryazeva 49, Moscow,
127550 Russia, E-mail: info@vniia-yr.ru, info@timacad.ru
With the use of a new sampling procedure based on the EU QuEChERS-method, which allows one to unify the detection of active substances, the translocation features were determined for chemical substances entering into the modern plant-protection agents: imidaclo-prid, fluopikolid and propamocarb hydrochloride. The effect of imidacloprid (Prestige preparation), which is used for tuber protection, on the redistribution dynamic of substances applied onto the potato vegetative organs was revealed. Key words: QuEChERS-method, Prestige preparation, Infinito preparation, imidacloprid, potato.
