CC BY
22
DOI: 10.23868/202110013
НЕВИРУСНЫЙ ГЕННЫЙ ТРАНСФЕР В ГИДРОГЕЛЕВЫХ МАТРИКСАХ С МИКРОГРАНУЛАМИ ОКТАКАЛЬЦИЕВОГО ФОСФАТА В ОПТИМИЗАЦИИ РЕПАРАТИВНОГО ОСТЕОГЕНЕЗА
И.Я. Бозо1-3, Е.В. Пресняков4, Е.С. Рочев5, В.В. Церцеил4, П.С. Подлужный4, М.О. Мавликеев4, А.Ю. Федотов6, О.В. Баранов6, И.И. Еремин2' 7, А.А. Пулин2' 8, Т.С. Чаузова2, А.П. Петрикина2, А.И. Билялов9, А.А. Титова9, А.А. Исаев10, В.С. Комлев6, Р.В. Деев1 4 10
1 ООО «Гистографт», Москва, Россия
2 Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии, Москва, Россия
3 Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна ФМБА России, Москва, Россия
4 Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия
5 Первый Санкт-Петербургский медицинский университет им. И.П. Павлова, Санкт-Петербург, Россия
6 Институт металлургии и материаловедения РАН им. А.А. Байкова, Москва, Россия
7 Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт», Москва, Россия
8 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
9 Национальный медико-хирургический центр им. Н.И. Пирогова, Москва, Россия
10 ПАО «Институт Стволовых Клеток Человека», Москва, Россия
NON-VIRAL GENE TRANSFER IN HYDROGEL MATRICES WITH OCTACALCIUM PHOSPHATE MICROGRANULES IN OPTIMIZATION OF REPARATIVE OSTEOGENESIS
I.Y. Bozo1-3, E.V. Presnyakov4, E.S. Rochev5, V.V. Tserceil4, P.S. Podluzny4, M.O. Mavlikeev4, A.Yu. Fedotov6, O.V. Baranov6, I.I. Eremin77 2, A.A. Pulin8, 2, T.S. Chauzova2, A.P. Petrikina2, A.I. Bilyalov9, A.A. Titova9, A.A. Isaev10, V.S. Komlev6, R.V. Deev1, 4, 10
1 Histograft, LLC, Moscow, Russia
2 Research Institute of General Pathology and Pathophysiology, Moscow, Russia
3 A.I. Burnazyana Federal Medical Biophysical Center, FMBA of Russia, Moscow, Russia
4 I.I. Mechnikov North-Western State Medical University, Saint Petersburg, Russia
5 First I.P. Pavlov Saint Petersburg Medical University, Saint Petersburg, Russia
6 A.A. Baikov Institute of Metallurgy and Materials Science, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia
7 National Research Center "Kurchatov Institute", Moscow, Russia
8 Kazan (Volga Region) Federal University, Kazan, Russia
9 N.I. Pirogov National Medical and Surgical Center, Moscow, Russia
10 Institute of Human Stem Cells, PJSC, Moscow, Russia
Остеопластические материалы, сочетающие в себе остеоин-дуктивные свойства и возможность применения в ходе малоин-вазивных хирургических вмешательств, высоко востребованы в клинической практике.
Мы разработали три варианта ген-активированных остео-пластических материалов, содержащих три компонента: микрогранулы октакальциевого фосфата (ОКФ), молекулы плазмид-ной ДНК с геном сосудистого эндотелиального фактора роста (УЕ0Р-Д165) и один из гидрогелей: на основе альгината натрия, коллагена I типа и гиалуроновой кислоты. Молекулы генных конструкций содержались как в гидрогеле, так и на поверхности микрогранул оКФ.
В модели критического костного дефекта теменной кости кролика было установлено, что все варианты ген-активированных гидрогелей способствовали регенерации костной ткани, однако наибольший объем костного регенерата, в том числе в центральной части дефекта, был выявлен в группах с ген-активированными материалами на основе гиалуроновой кислоты и коллагена.
Таким образом, разработанные материалы могут служить кандидатами в медицинские изделия, однако требуются дополнительные исследования для оценки дозозависимости эффекта и оптимизации состава материалов.
Ключевые слова: ген-активированный материал, гидрогель, коллаген, альгинат, гиалуроновая кислота, УЕвР, остеогенез.
There is a strong unmet need for bone grafts and substitutes combining osteoinductive capacities and biophysical properties for using them in minimally invasive surgical interventions.
We have developed three variants of injectable gene-activated bone substitutes containing three components: octacalcium phosphate microgranules (OCP), plasmid DNA delivering the gene of vascular endothelial growth factor, and one of the hydrogels based on sodium alginate, type I collagen, and hyaluronic acid. The molecules of the gene constructs were contained both in the hydro-gel and on the surface of the OCP microgranules.
In the model of a critical-sized bone defect in rabbit parietal bone, we found that all the gene-activated hydrogels contributed to bone tissue regeneration, however, the largest amount of newly formed bone, including those in the central part of the defect, was detected in the groups with gene-activated materials based on hy-aluronic acid and collagen.
Thus, the developed materials can be considered as candidates for medical devices, but additional studies are required to assess the dose-depended effect and optimize the materials composition.
Keywords: gene-activated material, hydrogel, collagen, algi-nate, hyaluronic acid, VEGF, osteogenesis.
Введение
В связи с растущим запросом клинической практики, невирусная генная терапия находит все большее количество примеров экспериментального
и клинического применения [1-3]. На территории Российской Федерации уже внедрены лекарственный препарат и медицинское изделие, фармакологическое действие которых обеспечено невирусным генным
трансфером сосудистого эндотелиального фактора роста (УБСР-Д165): «Неоваскулген» (ИСКЧ, Россия) показан для лечения пациентов с хронической ишемией нижних конечностей [4, 5], а «Гистографт» (Гистографт, Россия) — для костной пластики [6, 7]. Последний представляет собой гранулы октакальциевого фосфата (ОКФ) с нанесенными на их поверхность молекулами плазмид-ной ДНК, несущей ген VEGFA (pDNД-VEGF). Имплантация материала осуществляется в ходе стандартного оперативного вмешательства, предполагающего выполнение широкого операционного доступа, подготовку костного реципиентного ложа, внесение материала, его фиксацию в зоне костной пластики и ушивание послеоперационной раны. с учетом тенденции к разработке и применению малоинвазивных хирургических технологий, реализация которых в случае костной пластики подразумевает применение полужидких форм медицинских изделий, которые могут быть введены через шприц, разработка этого класса медицинских изделий представляется актуальной.
Активно разрабатываются гелевые формы остео-пластических материалов, в том числе активированных, несущих в себе живые клетки [8], факторы роста [9] или генные конструкции, кодирующие терапевтические белки [10-12]. Первые два варианта уже представлены среди внедренных в клиническую практику медицинских изделий, а ген-активированные материалы на основе гелей до настоящего времени не имеют прецедентов клинической трансляции.
В связи с этим, целью исследования стала разработка ген-активированного материала на основе различных гидрогелей, микрогранул ОКФ и pDNA-VEGFA для оптимизации регенерации костной ткани.
Материал и методы
Изготовление ген-активированных материалов
Экспериментальные образцы ген-активированных материалов изготавливали с использованием pDNД-VEGFA, одного из трех вариантов гидрогелевых матрик-сов: на основе альгината натрия, ксеногенного коллагена I типа и гиалуроновой кислоты, а также микрогранул ОКФ. Для изготовления ген-активированных гидрогелей использовали сверхскрученную голую pDNA-VEGFA лекарственного препарата «Неоваскулген» (ПАО «Институт Стволовых Клеток Человека», Россия) [4]. Препарат растворяли в дистиллированной воде с получением раствора, который добавляли к образцам гидрогелей тестовых групп в дозировке 400 мкг на 1 мл гидрогеля. Для получения альгинатного гидрогеля концентрацией 3 масс. % 0,3 г. альгинат натрия (ДppliChem, Германия) растворяли в 9,7 мл дистиллированной воды при температуре 37 °С и постоянном перемешивании в течение 1 сут., как описано ранее [13]. Вторым вариантом инъекционного матрикса был выбран коллагеновый гидрогель «Коллост» (Ниармедик, Россия). В качестве гидрогелевого матрикса-носителя на основе гиалуроновой кислоты использовали медицинское изделие «Ostenil» 20 мг/2 мл (ИЗБ ^етеСюа AG, Германия), показанное для лечения дегенеративно-дистрофической патологии суставов.
Гранулами ОКФ с pDNA-VEGFA в концентрации 10 мкг на 100 мкг матрикса стал ген-активированный остеопла-стический материал «Гистографт» (Гистографт, Россия). Гранулы ОКФ без плазмидной ДНК синтезировали согласно ранее опубликованной методике [22], согласно которой производится изготовление Гистографта.
Микрогранулы ОКФ совмещали с гидрогелевыми материалами в объемном соотношении 1:2 непосредственно перед внесением в костные дефекты.
Имплантация материалов in vivo
Дизайн эксперимента. Исследование выполнено на кроликах породы Шиншилла (n=24), массой 2,5-3,0 кг, с соблюдением международных правил гуманного обращения с лабораторными животными. В качестве модели критического костного дефекта была выбрана отработанная и стандартизированная модель: билатеральные полнослойные дефекты (диаметром 10 мм) крыши черепа в области обеих теменных костей, нанесенные с сохранением твердой мозговой оболочки. В дефекты правых теменных костей имплантировали ген-активированные материалы (тестовая сторона), в дефекты левых — соответствующие гидрогели без плазмидной ДНК (контрольная сторона). Животные были разделены на 3 основные группы в соответствии с вариантом использованного гидрогеля: на основе альгината натрия, коллагена и гиалуроновой кислоты.
Протокол операции. После премедикации (Sol. Atropini Sulfatis 0,04 мг/кг, Sol. Cephazolini 25 мг/ кг внутримышечно) и седации (Sol. Zoletili 100 30 мг/ кг внутримышечно), подготовки и асептической обработки операционного поля под инфильтрационным обезболиванием (Sol. Lidocaini 1% — 2 мл) производили линейный разрез (длиной 25 мм) «мягких тканей» в проекции сагиттального шва от бугра затылочной кости кпереди. Поверхность теменных костей обнажали распатором. Каждому животному с помощью трепана (наружный диаметр 1 0 мм) формировали костные дефекты до твердой мозговой оболочки, без ее повреждения. Сверление отверстий в кости осуществляли при идентичных стандартизированных параметрах: 800 об./ мин., торк 20 Н/см, постоянная ирригация для предотвращения перегрева костной ткани и температурного повреждения краев костных дефектов. Костные дефекты заполняли исследуемыми материалами. В случае материалов на основе альгината натрия, их поверхность после внесения в дефект смачивалась хлоридом кальция для полимеризации. Операционные раны ушивали послойно узловыми швами Vicryl 5/0 (надкостница, апоневроз), Surgipro 5/0 (кожа). Сведение краев рассеченной надкостницы узловыми швами обеспечивало надежную фиксацию имплантированных материалов в пределах костных дефектов, использование дополнительных средств фиксации не требовалось. Животные находились на ежедневном динамическом наблюдении.
Гистологическое исследование
Животных выводили из эксперимента передозировкой препарата «Золетил 100». Извлеченные крыши черепов фиксировали в 1 0% растворе нейтрального формалина в течение 24 ч., затем промывали в проточной воде в течение 60 мин. с последующей подрезкой и заливкой фрагментов черепов в декальцинирующий раствор «Софтидек» (Биовитрум, Россия) в соотношении объемов объекта и декальцинирующей жидкости 1 :50. Смену раствора производили каждые 24 ч., одновременно проверяя степень декальцинации при помощи иглы. Декальцинация была окончена на 5 сут., когда объекты стали мягкими и эластичными, а игла свободно проходила сквозь ткань. После этого производили промывку образцов водопроводной водой в течение 30 мин. Гистологическую проводку, заливку, и микротомию
30 сут
60 сут
90 сут
Альгинат
Альгинат + pIVEGFA
Рис. 1. Регенерат в центральной зоне костного дефекта после имплантации материалов на основе альгината натрия: 1 — фрагменты имплантированного материала (микрогранулы ОКФ), 2 — вновь образованная костная ткань, 3 — волокнистая соединительная ткань. Окраска: по Маллори (синий), гематоксилин и эозин (розовый). Ув.: х100
с толщиной срезов 5 мкм осуществляли по стандартной методике. Препараты окрашивали обзорными красителями (гематоксилином и эозином) и по Маллори. Все препараты сканировали в приборе Aperio CS2 (Leica, Германия) с получением цифровых изображений. На сканограммах препаратов проводили качественную оценку гистологической картины, а также гистомор-фометрию с определением доли костного регенерата и нерезорбированных фрагментов имплантированных изделий в общей площади костного дефекта, количества сосудов в 10 произвольных полях зрения на одном и том же увеличении.
Статистический анализ
В ходе статистического анализа определяли среднее значение, медиану, стандартное отклонение, верхний и нижний квартили (доли вновь образованной костной ткани, фрагментов имплантированных материалов, количество сосудов). Затем оценивали соответствие распределения количественных признаков закону нормального распределения с использованием критерия Шапиро-Уилка. Для сравнения групп использовали непараметрические методы (U-критерий Манна-Уитни для межгрупповых сравнений, критерий Вилкоксона — для внутригрупповых). Уровень статистической значимости различий (p) был принят за 0,05.
Результаты и обсуждение
Регенерация костной ткани под влиянием ген-активированного материала на основе альгината натрия
Через 30 суток после имплантации гидрогеля на основе альгината натрия без плазмидной ДНК
(контроль) в центральной области дефекта была обнаружена относительно мономорфная волокнистая соединительная ткань, матрикс которой был построен из умеренно крупных коллагеновых волокон, ориентированных параллельно поверхности твердой мозговой оболочки. соединительная ткань окружала разноразмерные микрогранулы ОКФ. Гидрогель визуализировался в виде фуксинофильных (при окрашивании по Маллори) участков на поверхности микрогранул. На поверхности единичных гранул выявлялись зоны отложения остео-ида и ретикулофиброзной костной ткани, занимающие не более 30-40% периметра гранулы. Гранулы, лежащие в непосредственном контакте с исходным межтрабеку-лярным пространством, были интегрированы в костный регенерат, представленный разветвленными анастомо-зирующими трабекулами, окружающими гранулы ОКФ с фрагментами гидрогеля (рис. 1).
В экспериментальной группе значимое посттравматическое развитие костной ткани происходило непосредственно со стороны опилов костей. Гранулы ОКФ были интегрированы во вновь образованную костную ткань, причем последняя характеризовалась высоким темпом перестройки ретикулофиброзного варианта в пластинчатый. Сформированные костные балки анастомозиро-вали друг с другом, в ряде случаев располагаясь вокруг кровеносных сосудов. Пространства между костным регенератом и гранулами материала были заполнены малоклеточной волокнистой соединительной тканью с высокой степенью зрелости. Признаки клеточной резорбции материала ОКФ и лейкоцитарная инфильтрация отсутствовали. Костная ткань формировалась с внешней стороны гидрогеля, заключая его таким образом между собой и поверхностью микрогранул ОКФ. В центральных участках дефекта была развита преимущественно фиброзная ткань; единичные свободные костные трабекулы не анастомозировали друг с другом.
30 сут
60 сут
90 сут
Гиалуронат
Гиалуронат + рМЕБЕЛ
Рис. 2. Регенерат в центральной зоне костного дефекта после имплантации материалов на основе гиалуронового кислоты: 1 — фрагменты имплантированного материала (микрогранулы ОКФ), 2 — вновь образованная костная ткань, 3 — волокнистая соединительная ткань. Окраска: по Маллори (синий), гематоксилин и эозин (розовый). Ув.: х100 и х200
В контрольной группе на сроках 60-90 сут. доля костного регенерата увеличивалась незначительно. И в центральных, и в краевых участках была отмечена перестройка костной ткани в пластинчатую. При этом, основной объем регенерата составляли нерезорбиро-ванные микрогранулы ОКФ и волокнистая соединительная ткань, остатки гидрогеля практически полностью резорбировались, только к сроку 90 сут. В экспериментальной группе гистологическая картина, в целом, соответствовала контролю. Однако ретикулофиброзная костная ткань, сформированная вокруг микрогранул ОКФ в центральной части дефекта, была несколько толще, насчитывая 4-5 остеоцитов по высоте, но лишь в единичных случаях замыкала весь периметр гранулы и не анастомозировала с соседними на сроке 60 сут., к 90 — определялись единичные анастомозы. В краевых участках дефекта был сформирован костно-десмальный регенерат, в котором прослеживалась тенденция к перестройке в пластинчатую костную ткань, особенно существенная на сроке 90 сут. Кроветворный костный мозг не был выявлен.
Регенерация костной ткани под влиянием
ген-активированного материала
на основе коллагенового гидрогеля
Через 30 сут. после операции в контроле зона повреждения была заполнена плотной волокнистой соединительной тканью; в ней регистрировался остров-ковый остеогенез, как правило, связанный с единичными микрогранулами ОКФ. На поверхности гранул клеточные элементы отсутствовали. Вокруг некоторых гранул пучки коллагеновых волокон формировали циркулярную «оплетку», что, по-видимому, предшествовало формированию капсулы. Вблизи костных опилов имелись слаборазвитые зоны остеогенеза, разветвленные трабекулы
охватывали микрогаранулы ОКФ, на поверхности некоторых из них выявлялись следы гидрогеля.
В экспериментальной группе центральная часть дефекта была заполнена волокнистой соединительной тканью, группами микрогранул ОКФ, вокруг некоторых из них отмечалось скудное костеобразование. Фуксинофильные следы геля присутствовали как на поверхности, так и внутри объема гранул. В десмаль-ной части регенерата определялось обилие полнокровных сосудов, количество которых статистически значимо превышало показатель в контроле (р=0,022). В краевой части дефекта костная ткань формировала петлистую сеть трабекул, интегрирующих гранулы ОКФ (рис. 2).
Через 60 и 90 сут. сохранялась тенденция к превалированию доли костного регенерата в экспериментальной группе, по сравнению с контрольной (р=0,037). К 90 сут. в экспериментальной группе очаги остеогенеза определялись на всем протяжении дефекта, происходило ремоделирование ретикулофирозной костной ткани в пластинчатую.
Регенерация костной ткани под влиянием ген-активированного материала на основе гиалуроновой кислоты
На сроке 30 сут. в обеих группах гидрогелевый компонент не был выявлен. В контроле краевые зоны регенерации характеризовались типичными разрастаниями вновь образованных костных трабекул, вовлекающих в регенерат микрогранулы ОКФ. Неожиданной особенностью стало обнаружение формирования ранних остеонов или полуостеонов вокруг остатков гранул; как правило, концентрически расположенные костные пластинки окружали достаточно крупный кровеносный сосуд. Межбалочное пространство было занято соединительной тканью с кластерами адипоцитов. Особенно
30 сут
60 сут
90 сут
Коллаген
Коллаген + p\VEGFA
Рис. 3. Регенерат в центральной зоне костного дефекта после имплантации материалов на основе коллагенового гидрогеля: 1 — фрагменты имплантированного материала (микрогранулы ОКФ), 2 — вновь образованная костная ткань, 3 — волокнистая соединительная ткань. Окр.: по Маллори (синий), гематоксилин и эозин (розовый). Ув.: х40 и х100
выраженное развитие костная ткань получала вблизи твердой мозговой оболочки; ее отроги распространялись центростремительно и в ряде случаев достигали удаленных участков дефекта. Часто в эту костную ткань были интегрированы гранулы ОКФ. Гранулы, вынесенные за пределы костной регенерации — в верхние слои апоневротического шлема — были заключены в соединительнотканное окружение.
В экспериментальной группе краевые зоны дефекта характеризовались мощно развитым костным регенератом ретикулофиброзного строения. Микрогранулы ОКФ были надежно интегрированы в регенерат. Отмечалось наличие свободных трабекул в верхних участках регенерата. «Мягкотканная часть» изобиловала расширенными кровеносными сосудами, в некоторых из них — явления плазмоконцентрации (гиалиновые тромбы). Центральная часть дефекта демонстрировала признаки интеграции образованной вокруг гранул костной ткани с краевым регенератом (рис. 3).
На сроках 60 и 90 сут. в контрольной группе центральная часть дефекта была выполнена или плотной волокнистой соединительной тканью, или конгломератом разноразмерных гранул ОКФ, скрепленных коллагеновым матриксом. Ближе к краям дефекта, вокруг гранул обнаруживали рыхлую волокнистую соединительную ткань. Гель вокруг гранул на сроке 60 сут. определялся в следовых количествах. Доля костной ткани в центральной зоне была минимальна, ее можно было идентифицировать при окрашивании по Маллори вокруг единичных гранул. Вблизи опилов, напротив, костная ткань интегрировала в один массив гранулы ОКФ. Соединительная ткань характеризовалась высокой плотностью расположения волокон в матриксе. Гигантские многоядерные клетки инородных тел и воспалительная инфильтрация не определялись.
В экспериментальной группе со стороны костных опилов выявлялась петлистая разветвленная сеть вновь
образованных костных трабекул. Костный регенерат уже на сроке 60 сут. был выражен настолько, что демонстрировал тенденцию к слиянию дискретных островков в единую структуру, а на сроке 90 сут. отмечалась фактически полная консолидация дефекта. Межбалочное пространство даже на сроке 60 сут. в краевых частях регенерата было заполнено кроветворным костным мозгом.
Таким образом, во всех группах краевая регенерация костной ткани была весьма выражена, а формирующиеся объемы ретикулофиброзной кости давали основания ожидать продолженный остеогенез на более поздних сроках. Однако с учетом ограниченности камбиальных источников репаративного процесса именно в центральных частях дефектов, эти зоны являются наиболее показательными для оценки остеоиндуктивных свойств материалов в этой модельной системе.
Гистологическая картина в центральных зонах существенно различалась в сравниваемых группах. так, в группах с использованием материала на основе колла-генового гидрогеля в независимости от его активации доминировала весьма грубая (фиброзированная) соединительная ткань, окружающая гранулы костнопластического материала и не дающая оснований предполагать изменения гистогенетического процесса в дальнейшем.
Наиболее развитый костный регенерат удалось обнаружить в группе использования ген-активированного геля на основе гиалуроновой кислоты; в группах гидрогеля на основе альгината натрия прослеживалась тенденция к межгранулярному скоплению геля: в больших объемах — в случае обычного геля, в умеренных — в случае генной активации.
Общей особенностью для всех групп являлось формирование большего объёма соединительной ткани в центральной зоне дефекта костей черепа, что является известной особенностью. Однако в ряде случаев оправдано ожидание того, что при более длительном сроке наблюдения соединительная ткань могла быть
вытеснена костной. Важно, что обширная васкуляри-зация фиброзной ткани в непосредственной близости к остаточным объемам микрогранул ОКФ, а также наличие на их поверхности остеоида, были наиболее выражены в группах с применением плазмидной ДНК.
Заключение
Таким образом, невирусный генный трансфер УЕЭР-А165 обеспечивал терапевтический эффект
в виде оптимизации репаративного остеогенеза во всех трех исследуемых вариантах гидрогелевых матриксов. Однако наибольший объем вновь образованной костной ткани формировался в случае применения изделия на основе гиалуронового гидрогеля. Разница между исследуемыми материалами могла быть обусловлена как спецификой воздействия самого материала на ткани реципиентного ложа, так и уровнем доставки плазмидной ДНК. Выяснение этих механизмов требует проведения дальнейших исследований.
ЛИТЕРАТУРА [REFERENCES]:
1. Shimamura M., Nakagami H., Sanada F., et al. Progress of Gene Therapy in Cardiovascular Disease. Hypertension. 2020; 76(4): 1038-1044.
2. Kukuta K., Urbanowicz A., Ktopotowski M., et al. Long-term follow-up and safety assessment of angiogenic gene therapy trial VlF-CAD: Trans-catheter intramyocardial administration of a bicistronic plasmid expressing VEGF-A165/bFGF cDNA for the treatment of refractory coronary artery disease. Am Heart J. 2019; 215:78-82.
3. Kolk A., Boskov M., Haidari S., et al. Comparative analysis of bone regeneration behavior using recombinant human BMP-2 versus plasmid DNA of BMP-2. J Biomed Mater Res A. 2019; 107(1):163-173.
4. Deev R., Bozo I., Isaev A., et al. Results of 5-year follow-up study in patients with peripheral artery disease treated with PL-VEGF165 for intermittent claudication. Ther Adv Cardiovasc Dis. 2018;12(9): 237-246.
5. Kalinin R.E., Suchkov I.A., Deev R.V., et al. Gene-mediated induction of angiogenesis in inoperable patients with atherosclerosis and diabetes mellitus. Angiol Sosud Khir. 2018; 24(2):33-40.
6. Bozo I.Y., Drobyshev A.Y., Redko N.A., et al. Bringing a Gene-Activated Bone Substitute Into Clinical Practice: From Bench to Bedside. Front Bioeng Biotechnol. 2021; 9:599300
7. Salient I., Capella-Monsonis H., Procter P., et al. The Few Who Made It: Commercially and Clinically Successful Innovative Bone Grafts. Front Bioeng Biotechnol. 2020; 8:952.
8. Hasani-Sadrabadi M.M., Sarrion P., Pouraghaei S., et al. An engineered cell-laden adhesive hydrogel promotes craniofacial bone tissue regeneration in rats. Sci Transl Med. 2020 Mar 11;12(534): eaay6853.
9. Krishnan L., Priddy L.B., Esancy C., et al. Hydrogel-based Delivery of rhBMP-2 Improves Healing of Large Bone Defects Compared With Autograft. Clin Orthop Relat Res. 2015; 473(9):2885-97.
10. Wang P., Huang S., Hu Z., et al. In situ formed anti-inflammatory hydro-gel loading plasmid DNA encoding VEGF for burn wound healing. Acta Biomater. 2019;100:191-201.
11. Wang W., Tan B., Chen J., et al. An injectable conductive hydrogel encapsulating plasmid DNA-eNOs and ADSCs for treating myocardial infarction. Biomaterials. 2018; 160:69-81.
12. Li H., Ji Q., Chen X., et al. Accelerated bony defect healing based on chitosan thermosensitive hydrogel scaffolds embedded with chitosan nanoparticles for the delivery of BMP2 plasmid DNA. J Biomed Mater Res A. 2017; 105(1):265-273.
13. Bozo I.Y., Mavlikeev M.O., Presnyakov E.V., et al. Gene-Activated Hydrogels Based on Sodium Alginate for Reparative Myogenesis of Skeletal Muscle. Inorganic Materials: Applied Research 2021; 12:1026-1032.
