CC BY
8НЕВИРУСНЫЕ МЕТОДЫ ГЕНЕРАЦИИ БЕЗ ИНТЕГРАЦИОННЫХ ИНДУЦИРОВАННЫХ
ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
Калиев Ерхат Кайратович
Евразийский Национальный Университет Л. Гумилева
АННОТАЦИЯ
Индуцированные плюрипотентные стволовые (IPS) клетки были созданы из фибробластов мыши с помощью индуцированной экспрессии Яманака факторов, Oct3 / 4, Sox2, Klf4 и с-Мус. Этот метод быстро привел к экспоненциальному увеличению в количествах исследований по плюрипотентности, а также обеспечивает ценный инструмент в регенеративной медицине. В то же время, многие методики для генерации плюрипотентных клеток были зарегистрированы и состоят в основном из вирусных методов и невирусных методов. Хотя вирусные методы не могут быть применимы для клинического применения, различные невирусные методы были зарегистрированы в последние годы, в том числе ДНК вектор основанных подходов, трансфекции мРНК, трансдукции пере -программирования белков, а также использование низкомолекулярные соединений. Этот обзор обобщает и оценивает эти невирусные методы.
Ключевые слова: без интеграционные ДНК, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, невирусные методы.
ВВЕДЕНИЕ
Индуцированные плюрипотентные стволовые (IPS) клетки, которые похожи на эмбриональные стволовые (ЭС) клетки в морфологии, экспрессии генов, эпигенетические состояний, и в инвитро дифференциации, являются типами плюрипотентных стволовых клеток, непосредственно полученные от соматических клеток путем различных методов синтеза [1]. По сравнению с ЭС клетками, IPS клетки обладают неотличимыми плюрипотентных возможностями, и их специфика по отношению к пациентам может обойти некоторые из рисков ЭС клеток. Поэтому они потенциальная альтернатива для ЭС клеток в регенеративной медицине. Кроме того, они могут обойти этические проблемы. Потому что iPS клетки были первоначально выведены из фибробластов мыши путем ретровирус-опосредованным введением четырех факторов, Oct3 / 4, Sox2, KLF4 и с-Мус [2], а затем перепрограммировать из фибробластов человека путем тех же четырех факторов [3] или путем Oct3 / 4, Sox2, Nanog, Lin28 [4], многочисленные методы для генерации этих клеток были разработаны.
На основании различных способов трансформации экзогенных генов, методика создания IPS клеток могут быть разделены на основе вирусных методов и невирусных методов. Оба эти метода могут или не могут включать в себя интеграцию экзогенных генов в геном хозяина. Потому что вирусные методы могут привести к генной реактивации и необычной фенотипической экспрессии iPS клеток [5, 6], что может быть полезным для дальнейших исследований и клинических применений, исследований с использованием невирусных методов, особенно без интеграции, были часто использованы.
Данный обзор представляет собой обзор методов для идентификации iPS клеток, обсуждаются текущие стратегии генерации iPS клеток c использованием невирусных систем доставки, которые приводят к без нтегра-ционной ДНК, и описывает различные приложения этой методологии.
МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ IPS КЛЕТОК
По сравнению с дифференцированными клетками, IPS клетки содержат очень различные эпигенетические следы. С разрешительным состоянием хроматина, более низкие уровни гетерохроматина и частое появление
двухвалентных доменов, плюрипотентные клетки способны дифференцироваться в различных типах тканей [7]. В настоящее время, используются три различных метода для идентификации.
Во-первых, предварительное определение IPS клеток может быть основан на морфологии. Как на ранней стадии эмбриональных клеток, главные отличительные особенности плюрипотентных клеток малый размер, высокая Коэффициенты ядерного / цитоплазмы, и один или несколько ядер. Исходя Из на микроструктура, гистохимия, Forssman антиген, и синтез белка, было сообщено, что плюрипотентных клеток состоит из более эухрома-тином несвязанный рибосомы, и митохондрии, с меньшим органелл и меньше сложностей сотовой структуры [8].
Во-вторых, иммуноцитохимическое окрашивание и анализ обратной транскрипционной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) имеет важное значение для идентификации iPS клеток. Иммунологический маркеры iPS клеток включают щелочную фосфатазу (AKP), стадиино-специфические эмбриональные антигены (SSEA), Тра-1-60, Тра-1- 81 и другие методы молекулярной маркировки [9]. Количество исследования показали, что экспрессия AKP была весьма коррелирована с недифференцированными IPS клетками, пока отрицательная экспрессия была найдена в дифференцированных ЭС клетках [10]. SSEA это гликопротеины, выраженные на ранней стадии развития, экспрессия которого меняется, когда клетки дифференцируются [11]. Выражение эпитопов, распознаваемых моноклональными антитела Тра-1-60 и Тра-1-81 имеет важное значение для оценки статуса плюри-потентности iPS клеток [12]. Кроме того, RT PCR анализ маркеров стволовых клеток, в том числе Oct4, Sox2, Nanog, и т.д., имеет важную роль [13].
Наконец, общие тесты для плюрипотентности включают образование тератомы и химеры. Тератомы может развиваться, когда IPS клетки введены в животных с иммунодефицитом, которые состоят всех трех экто-дермального, мезодермальной и эндодермальной эмбриональные зародышевых листков [14]. Химеры могут быть сформированы, когда IPS клетки микровведены в бластоцисты мыши, которые приводят к дифференциации на несколько типов клеток во время нормального процесс роста [15, 16].
МЕТОДЫ ДЛЯ ПЕРЕДАЧИ ФАКТОРОВ РЕПРОГРАММИРОВАНИЯ
Передача факторов репрограммирования с помощью ДНК
Плазмиды: Плазмиды - это наиболее распространенный тип эписомных векторов, впервые были определены в качестве жизнеспособных векторов репрограммирования используя каноническое факторы репрограммирования детализированных с помощью Okita и другие [17]. Повторное трансфекции плазмид экспрессии в мышиных эмбриональных фибробластах образовывали IPS клетки без свидетельства интеграции плазмид, который вызвал тератомы, когда были пересажены в иммуноде-фицитных мышей. Гонсалес и др. разработали и испытали одну транскрипционную кассету содержащий
Oct4, Sox2, Klf4, и с-Мус, названный pCAG-OSKM
[18]. Когда pCAG-OSKM был доставлен путем нук-леофекции, это образовало неинтегрируемые линии IPS клеток, показывая, что индукция IPS клеток может быть достигнуто путем временной экспрессии используя одну полицистронную кассету. Путем периодической транс-фекции и кодирования четырех факторов перепрограммирования (Oct4, Nanog, Sox2 и Lin28) независимо, Si-Tayeb и др. смогли получить человеческие IPS клетки из фибробластов крайней плоти человека [19].
Хотя плазмидные векторы, использовавшиеся в их исследованиях были почти одинаковые как у лентивиру-сных векторов, при отсутствии упаковочных векторов исключается возможность появления вирусов дикого типа и экзогенных ДНК, которые будут потеряны из донорных клеток при делении клеток.
Использование плазмид, включая неэписомные плазмиды, требует фундаментальных программ, которые легко доступны для в любой лаборатории даже с базовым опытом в области молекулярной биологии. Тем не менее, необходимы дальнейшие исследования, чтобы улучшить эффективность этой методики.
Миникруговые Вектора: Jia и др. использовали один миникруговой вектор, содержащий 4 фактора реп-рограммирования (Oct4, Sox2, Lin28 и Nanog), с зеленым флуоресцентным белком (GFP) ген-репортер связан с 2А последовательностью саморасщепляющегося пептида, для создания нетрансгенных IPS клеток из жировых стволовых клеток взрослого человека без геномной интеграции [20]. Используя неинтегрирующий oriP вирус / Эпштейна-Барр вирусно ядерный антиген-1 (EBNA1) векторов для кодирования 7 факторов, в том числе Oct4, Sox2, Nanog, Lin28, Klf4, с-Мус, и SV40Tag, Yu. и др. получили человеческие IPS клетки из фибробластов крайней плоти человека, без вектора интеграции после того как они были удалены [21]. По трансфекции одного мультипротейно-вого вектора экспрессии для кодирования C-Myc, Klf4, Oct4 и Sox2 связан с 2А последовательностями, Kaji и др. перепрограммировали оба: мышиные и человеческие фибробласты в IPS клетки без интеграции. После того как они удалили экзогенные факторы когда репрограммиро-вание удалось, Cre-вырезанные клеточные линии поддерживали эндогенную экспрессию генов с-Мус, Klf4, Sox2 и Oct4, указывая, что одна векторная система может полностью исключить экзогенные гены без нарушения состояния IPS клеток [22].
По сравнению с другими неинтегрирующимися методами репрограммирования, эффективность репро-граммирования с миникруговыми векторами больше, но
технология является более сложной.
Передача факторов репрограммирования с помощью РНК
Путем многократного применения синтетических мРНК, используя простую неинтеграционную стратегию, Уоррен и др. продуктивно репрограммировали несколько типов клеток человека в плюрипотентные, и индуцировали дифференцировку РНК-индуцированных плюри-потентных стволовых клеток (RiPSCs) в дифференцированные миогенные клетки [23].
В то время как цитотоксичность трансфициро-ванных мРНК нуждалась в модификаций, Rosa и др. изменили рибонуклеотидные основы вектора мРНК путем замены 5-метил цитидина на цитидин и псевдоу-ридина на уридин, чтобы снизить иммуногенность мРНК. Это эффективный способ также может быть использован для направленной дифференцировки iPS клеток, или даже для трансдифференцировки чтобы создавать дифференцированные типы клеток для клинического использования
[24]. Кроме того, за счет увеличения связной последовательности поддающейся к РНК-направленному редактированию генома, Hou и др. сообщили эффективное фокусирование эндогенного гена в 3 человеческие IPS клеточные линии [25].
МикроРНК (miRNA) также играли важную роль в контроле плюрипотентных стволовых клеток [26-28], и также зависят от факторов плюрипотентности Sox2, Oct4 и Nanog [29, 30]. miR-302s, -17s, -515s, и miR-371- 373 кластеры были увеличены в ЭС клетках, но уменьшились, когда клетки дифференцировались [31, 32]. Мышиный miR-291/294/295 гомологичная человеческая копия, miR-302, было также установлено, что преимущественно эксп-рессируется в человеческих эмбриональных стоволовых клетках (HES) и плюрипотентных клеток, но не в дифференцированных клетках [33, 34]. Благодаря интеграции и внедрению кластера микроРНК miR-302 в геном, Lin и др. репрограммировал клетки человеческого волосяного фолликула (hHF) в iPS клетки [35]. Subramanyam и др. показали, что miR-302 и miR-372 способствует репро-граммированию фибробластов человека в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки [36] и Hu и др. показали, что miR-302 может увеличить эффективность репрограммирования путем подавления NR2F2 [37]. В последнее время, использование miR-302/367 кластеров способствовало эффективному образованию iPS клеток [38], и нокдаун или нокаут miR-302/367 кластеров повредило репрограммирование [39]. Lee и другие показали, что экспрессия экзогенных miR-302 кластеров может эффективно получать репрограммированные iPS клетки путем освобождения MBD2 (метил-ДНК-связывающий домен протеина 2) -опосредованного ингибирования экспрессии NANOG [40]. Кроме того, Judson и другие сообщили, что эффекты экспрессии микроРНК могут также способствовать соматическому репрограммирование клеток [41].
Методология на основе РНК исключает риск геномной интеграции, а также инсерционного мутагенеза, и имеет преимущества в плане эффективности и кинетики. Тем не менее, модифицированные мРНК труднее сформировать в лаборатории.
Передача факторов репрограммирования с помощью Протеина
Любые ДНК-основанные методы репрограмми-рования не могут полностью избежать случайной интеграции, так что еще один дополнительный метод для создания нетрансгенных iPS клеток включает передача с помощью протеинов(белков) [42]. Путем передачи 4 протеинов репрограммирования Oct4, Sox2, Klf4, и с-Мус, непосредственно соединнены с клеточно-проникающими пептидом (СРР), Kim и др. получили устойчивые iPS клетки из фибробластов человека [43]. Nemes и др. сообщили что трансдукции 4 протеина репрограммирования, в сочетании с СРР состояли из глутатион^-трансферазной метки и транскрипционно-ядерно локализованного сигнального полипептида, были
способны репрограммировать мышиные эмбриональные фибробласты (МЭФы) в iPS клетки [44]. Кроме того, Zhou и др. сообщили создание мышиных iPS клеток путем трансдукции с участием 4 этапов репрограммирования протеинов помеченные с полиаргинином в присутствии валь-проевой кислотой (VPA) в E.coli [45].
Kwon и др. дифференцировали оба: мышиные эмбриональных стволовые клетки и iPS клетки, основанные на протеине в среднем мозге дофаминергических (DA) нейронов. Сравнивая эффективность дифференциации DA нейрона от 2 типов клеток, репрограммирование на про-теинной основе привела к более устойчивой и действительной экспрессии Д. нейроноспецифических маркеров [46]. Cho и др. сообщили, что передача протеинов, полученных от эмбрионально стволовых клеток во взрослые фибробласты мыши привели к полному репрог-раммированию к плюрипотентности без всякого выражения эктопических трансгенов [47]. Использование усовершенствованного трансактиватора транскрипции каппа (TATA), синтетического TAT - HIV, Nordin и др. недавно описали стратегию для создания 293T клеток, секрети-рующих плюрипотентные факторы Oct-3/4 или KLF4, которые могут иметь важное значение в создании iPS клеток для терапевтических целей [48].
Тем не менее, это не окончательно выяснено, может ли протеин трансдукции быть использован для взрослых клеток, которые были доказаны были более трудными для репрограммирования, по сравнению с эмбриональными клетками [49]. Кроме того, сложное создание и слабая эффективность репрограммирования ограничили применимость протеин основанных iPS клеток. Использование клеточно проницаемых протеинов фактора репрограммирования, Lim и др. индуцировали нарост колонии похожих на стволовые клетки, которые не смогли развится в iPS клетки или в ЭС клеточные линии. Они пришли к выводу, что частичное репрограммирование было распространенным ответом на передачу программирующих факторов на основе протеинов в соматические клетки [50]. Тем не менее, сообщалось что использование самостоятельно-проникающих белков и урезанных белков является более эффективным подходом [51]. Harreither и др. сообщали что немодифицированный OCT-4 протеин может быть использован в качестве самостоятельно проникающий фактор репрограммирования плюрипотентности, без добавления катионно- соединенной метки [52]. Thier и др. установили оптимальные стабилизационные условия для Oct4-TAT и Sox2-TAT протеинов, которые были заменой для вирусных методов [53, 54]. Кроме того, урезанный вариант фактора транскрипции
Nanog сохранил способность содействования репрограм-мированию [55], и версии Sox протеина сокращенные до их ДНК-связывающего с высокой мобильностью группы домена (HMG) также сохранили репрограммирование [56]. Поскольку оба: эффективность [57] и результаты [58] в значительной степени зависят от времени выставления и последовательности дополнительных факторов, использование протеинов для клеточного репрограммирования может быть отличным способом для получения iPS клеток, которые могут включать в себя обширный контроль над методикой проведения репрограммирования.
ПОЛУЧЕНИЕ IPS КЛЕТОК С ПОМОЩЬЮ МАЛЫХ МОЛЕКУЛЯРНЫХ СОЕДИНЕНИИ
Для iPS клеток, которые будут использоваться в клинической практике, остается несколько проблем, в том числе возможные риски и недостатки генетической манипуляции и низкая эффективность. Среди новых методов для репрограммирования iPS клеток, одна из самых идеальных и практических способов получения репрог-раммированных iPS клеток включает введение малых молекул вместо экзогенных генов в соматические клетки. Эти функциональные не пептиды или пептидные малые молекулы и природные продукты очень малы в молекулярной массе, состоят из простой структуры, являются недорогими для производства, легко впитываются, и являются стабильными при физиологических условиях.
До сих пор, множество малых молекул были идентифицированы для замены факторов репрограммирования для получения IPS клеток. Huangfu и др. сообщили, что ингибиторы ДНК-метилтрансферазы и гистондеа-цетилазы(HDAC), особенно VPA, улучшили эффективность репрограммирования, даже без необходимости для онкогенов с-Мус или Klf4 [59, 60]. Shi и др. нашли что BIX-01294, ингибитор метилтрансферазы, может заменить Sox2 и с-Мус для репрограммирования, а тем временем улучшилось эффективность [61, 62]. Li и др. сообщили что специфический ингибитор гликогенсинтазы-киназы 3 (GSK-3), CHIR99021, смог репрограммировать как эмбриональные фибробласты мыши, так и первичные человеческие кера-тиноциты трансдуцированные с помощью Oct4 и Klf4 [63]. Yuan и др. сообщили что, в сочетании с трансформирующими ростовыми факторами (TGF) -в ингибитор А-83-01, белок ингибитор аргинин метилтрансферазы AMI-5 осуществил Oct4-индуцированному репрограммирова-нию мышиных эмбриональных фибробластов [64]. Путем интегративного геномного анализа репрограммирования мышиных фибробластов и В-лимфоцитов, Mikkelsen и др предположили, что и РНК ингибирование факторов транскрипции и обработка с ингибиторами ДНК-метилтра-нсферазы может улучшить общую эффективность процесса репрограммирования
[65]. Li и др. сообщили, что малые молекулы, Oct4-активирующее соединение 1 (OAC1), могут повысить эффективность репрограммирования IPS клеток и ускорить процесс репрограммирования [66]. Kang и др. получили iPS клетки в два этапа, создавая устойчивые промежуточные клетки из астроцитов мыши с помощью Bmil и превращая их в iPS клетки путем обработки с ингибиторами МЕК / ERK и GSK3 пути, что продемонстрировало то, что соединения малых молекул могут непосредственно репрограммировать мышиные соматических клетки в iPS клетки [67].
Десяткам исследований удалось репрограмми-ровать клетки используя соединения малых молекул, но Oct4 был еще незаменим. В последнее время, Hou и др. создали плюрипотентные стволовые клетки из мышиных соматических клеток с частотой до 0.2% при использовании комбинации 7 небольших химических молекул, которые были называны химическии индуцированными iPS клетками (CiPSC) [68]. Хотя некоторые из этих заменителей могут вызвать стимулирование неожиданных путей и обширное сравнение CiPS и ES клеток требуется для последующих применений, малые молекулы еще более полезны для их наличия, обратимости, клеточной проницаемости и стандартизации.
ПРИМЕНЕНИЯ И ОЖИДАНИЯ
Для того, чтобы применить технологию IPS клеток для клинического использования, эффективность и безопасность должна быть улучшена. Предыдущие исследования показали, что удаление некоторых препятствии [6973] и активация врожденного иммунитета [74] может способствовать эффективности репрограммирования, и использование piggyBac (PB) перестановки может устранить потенциальную опасность вставки(введения) [75-79]. Кроме того, наряду с получением iPS клеток из крови [80] и первичных фибробластов кожи [81], создание банка невирусных человеческих iPS клеток от доноров был достигнут [82], на основе предыдущих методов основанных на вирусах [83-86]. Учитывая быстрый прогресс этой области, включая более безопасные, доступные, более эффективные, и более удобные протоколы, можно предположить, что это методология будет в ближайшем будущем использоваться клинически, для различных тканей человека.
iPS клетки обеспечивают широкую доступность, неэтический оспариваются, и почти бесконечный источник плюрипотентных клеток, который обещает новую парадигму в регенеративной медицине. В этом обзоре, описаны невирусные и неинтегрируемые технологии, а также их потенциальные применения как терапевтических, так и научных исследованиях. По сравнению с вирусными методами, методы основанные на ДНК транс-фекции оказались безопаснее, но они также влекут за собой определенные риски геномной рекомбинации или инсерционного мутагенеза. Технология на основе РНК тщательно уклоняется от рисков в то время как методы, чтобы изменить мРНК очень трудны. Создание iPS клеток с помощью рекомбинантных протеинов прежнему заслуживает рассмотрения для клинического применения из-за его высокой безопасности, несмотря на довольно дороговизну и очень низкую эффективность.
Поскольку некоторые малые молекулы были идентифицированы как повышающие эффективность репро-граммирования и заменяющие некоторые факторы реп-рограммирования, репрограммирование определенными химическими средствами может быть достигнуто в будущем. Так как соединения малых молекул были идентифицированы, как повышающие эффективность репро-граммирования и заменающие определенные факторы репрограммирования, полные подходы химической репрограммирования остаются для дальнейшего развития, чтобы репрограммировать человеческие соматические клетки в iPS клетки и в конечном итоге соответствовать потребностям восстановительной медицины.
Список Литературы
1. Lizier NF, Kerkis I, Wenceslau CV. Generation of induced pluripotent stem cells from dental pulp somatic cells. Pluripotent Stem Cells. Chapter 7. 1st edition. Edited by Deepa Bhartiya and Nibedita Lenka. Rijeka, Croatia; 2013: 131-2.
2. Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 2006; 126(4): 663-76.
3. Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 2007; 131(5): 861-72.
4. Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, et al. Induced pluripotent cell lines derived from human somatic cells. Science 2007; 318 (5858):1917-20.
5. Hacein-Bey-Abina S, Von Kalle C, Schmidt M, et al. LMO2-associated clonal T cell proliferation in two patients after gene therapy for SCID-X1. Science 2003; 302(5644): 415-9.
6. Soldner F, Hockemeyer D, Beard C, et al. Parkinson's disease patient-derived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors. Cell 2009; 136(5): 964-77.
7. Bilic J, Izpisua Belmonte JC. Concise Review: induced pluripotent stem cells versus embryonic stem cells: close enough or yet too far apart? Stem Cells 2012; 30(1): 33-41.
8. Bassaneze V, Sacramento CB, Freire R, et al. Development of a new approach to aid in visual identification of murine iPS colonies using a fuzzy logic decision support system. PLoS One 2013; 8(8):e70605.
9. Rogers MB, Hosler BA, Gudas LJ. Specific expression of a retinoic acid-regulated, zinc-finger gene, Rex-1, in preimplantation embryos, trophoblast and spermatocytes. Development 1991; 113(3):815-24.
10. Berstine EG, Hooper ML, Grandchamp S, et al. Alkaline phosphatase activity in mouse teratoma. Proc Natl Acad Sci USA 1973; 70(12): 3899-903.
11. Henderson JK, Draper JS, Baillie HS, et al. Preimplantation human embryos and embryonic stem cells show comparable expression of stage-specificembryonic antigens. Stem Cells 2002; 20(4): 329-37.
12. Natunen S, Satomaa T, Pitkänen V, et al. The binding specificity of the marker antibodies Tra-1-60 and Tra-1-81 reveals a novel pluripotency- associated type 1 lactosamine epitope. Glycobiology 2011; 21(9): 112530.
13. Yuan T, Liao W, Feng NH, et al. Human induced pluripotent stem cell-derived neural stem cells survive, migrate, differentiate, and improve neurologic function in a rat model of middle cerebral artery occlusion. Stem Cell Res Ther 2013; 4(3): 73.
14. Wobus AM, Holzhausen H, Jakel P, et al. Characterization of a pluripotent stem cell line derived from a mouse embryo. Exp Cell Res 1984; 152(1): 21219.
15. Zhao XY, Li W, Lv Z, et al. IPS cells produce viable mice through tetraploid complementation. Nature 2009; 461(7260): 86-90.
16. Boland MJ, Hazen JL, Nazor KL, et al. Adult mice generated from induced pluripotent stem cells. Nature 2009; 461(7260): 91-94.
17. Okita K, Nakagawa M, Hyenjong H, et al. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science 2008;322 (5903): 949-53.
18. Gonzalez F, Barragan Monasterio M, Tiscornia G, et al. Generation of mouse induced pluripotent stem cells by transient expression of a single nonviral polycistronic vector. Proc Natl A cad Sci USA 2009; 106 (22): 8918-22.
19. Si-Tayeb K, Noto FK, Sepac A, et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by simple transient transfection of plasmid DNA encoding reprogramming factors. BMC Dev Biol 2010; 10: 81.
20. Jia F, Wilson KD, Sun N, et al. A nonviral minicircle vector for deriving human iPS cells. Nat Methods 2010; 7(3): 197-9.
21. Yu J, Hu K, Smuga-Otto K, et al. Human induced plu-ripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science 2009; 324(5928): 797-801.
22. Kaji K, Norrby K, Paca A, et al. Virus-free induction of pluripotency and subsequent excise on of reprogramming factors. Nature 2009; 458(7239): 771-5.
23. Warren L, Manos PD, Ahfeldt T, et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell 2010; 7(5):618-30.
24. Rosa A, Brivanlou AH. Synthetic mRNAs: powerful tools for reprogramming and differentiation of human cells. Cell Stem Cell 2010; 7(5): 549-50.
25. Hou Z, Zhang Y, Propson NE, et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proc Natl Acad Sci USA 2013; 110(39): 15644-9.
26. Kanellopoulou C, Muljo SA, Kung AL, et al. Dicer-deficient mouse embryonic stem cells are defective in differentiation and centromeric silencing. Genes Dev 2005; 19(4): 489-501.
27. Murchison EP, Partridge JF, Tam OH, et al. Characterization of Dicer-deficient murine embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 2005; 102 (34): 12135-40.
28. Wang Y, Medvid R, Melton C, et al. DGCR8 is essential for microRNA biogenesis and silencing of embryonic stem cell selfrenewal.Nat Genet 2007; 39(3): 380-5.
29. Barroso-delJesus A, Romero-Lopez C, Lucena-Aguilar G, et al. Embryonic stem cell-specific miR302-367 cluster: human gene structure and functional characterization of its core promoter. Mol Cell Biol 2008; 28(21): 6609-19.
30. Marson A, Levine SS, Cole MF, et al. Connecting mi-croRNA genes to the core transcriptional regulatory circuitry of embryonic stem cells. Cell 2008; 134(3): 521-33.
31. Stadler B, Ivanovska I, Mehta K, et al. Characterization of microRNAs involved in embryonic stem cell states. Stem Cells Dev 2010; 19(7): 935-50.
32. Laurent LC, Chen J, Ulitsky I, et al. Comprehensive mi-croRNA profiling reveals a unique human embryonic stem cell signature dominated by a single seed sequence. Stem Cells 2008; 26(6): 1506-16.
33. Suh MR, Lee Y, Kim JY, et al. Human embryonic stem cells express a unique set of microRNAs. Dev Biol 2004; 270(2): 488-98.
34. Wilson KD, Venkatasubrahmanyam S, Jia F, et al. Mi-croRNA profiling of human-induced pluripotent stem cells. Stem Cells Dev 2009; 18(5): 749-58.
35. Lin SL, Chang DC, Lin CH, et al. Regulation of somatic cell reprogramming through inducible mir-302 expression. Nucleic Acids Res 2011; 39(3): 1054-65.
36. Subramanyam D, Lamouille S, Judson RL, et al. Multiple targets of miR-302 and miR-372 promote reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol 2011; 29(5): 443-8.
37. Hu S, Wilson KD, Ghosh Z, et al. MicroRNA-302 increases reprogramming efficiency via repression of NR2F2. Stem Cells 2013; 31(2): 259-68.
38. Anokye-Danso F, Trivedi CM, Juhr D, et al. Highly efficient miRNA-mediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell 2011; 8(4): 376-88.
39. Zhang Z, Xiang D, Heriyanto F, et al. Dissecting the Roles of miR-302/367 Cluster in Cellular Reprogramming Using TALE-based Repressor and TALEN. Stem Cell Reports 2013; 1(3): 218-25.
40. Lee MR, Prasain N, Chae HD, et al. Epigenetic regulation of NANOG by miR-302 cluster-MBD2 completes induced pluripotent stem cell reprogramming. Stem Cells 2013; 31(4): 666-81.
41. Judson RL, Babiarz JE, Venere M, et al. Embryonic stem cellspecific microRNAs promote induced pluripotency. Nat Biotechnol 2009; 27(5): 459-61.
42. Hu K. Vectorology and factor delivery in induced pluripotent stem cell reprogramming. Stem Cells Dev 2014; 23(12): 1301-15.
43. Kim D, Kim CH, Moon JI, et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell 2009; 4(6): 4726.
44. Nemes C, Varga E, Polgar Z, et al. Generation of mouse induced pluripotent stem cells by protein transduction. Tissue Eng Part C Methods 2014; 20(5): 383-92.
45. Zhou H, Wu S, Joo JY, et al. Generation of induced plu-ripotent stem cells using recombinant proteins. Cell Stem Cell 2009; 4(5):381-4.
46. Kwon YW, Chung YJ, Kim J, et al. Comparative study of efficacy of dopaminergic neuron differentiation between embryonic stem cell and protein-based induced pluripotent stem cell. PLoS One 2014; 9(1): e85736.
47. Cho HJ, Lee CS, Kwon YW, et al. Induction of pluripotent stem cells from adult somatic cells by protein-based reprogramming without genetic manipulation. Blood 2010; 116(3): 386-95.
48. Nordin F, Tye GJ, Gaken J, et al. TATE Fusion Protein of OCT-3/4 and KLF-4: Stable Mixed Population Cell Lines Capable of Delivering Fusion Proteins to Target Cells. J Cell Sci Ther 2014; 5(2):158.
49. Park IH, Zhao R, West JA, et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature 2008; 451(7175): 141-6.
50. Lim J, Kim J, Kang J, et al. Partial somatic to stem cell transformations induced by cell-permeable reprogramming factors. Sci Rep 2014; 4: 4361.
51. Wang XC, Ralf J. OCT4: A penetrant pluripotency inducer. Cell Regeneration 2014; 3: 6.
52. Harreither E, Rydberg HA, Amand HL, et al. Characterization of a novel cell penetrating peptide derived from human Oct4. Cell Regeneration 2014; 3: 2.
53. Thier M, Münst B, Edenhofer F. Exploring refined conditions for reprogramming cells by recombinant Oct4 protein. Int J Dev Biol 2010; 54(11-12): 1713-21.
54. Thier M, Münst B, Mielke S, et al. Cellular Reprogramming Employing Recombinant Sox2 Protein. Stem Cells Int 2012; 2012:549846.
55. Theunissen TW, Costa Y, Radzisheuskaya A, et al. Reprogramming capacity of Nanog is functionally conserved in vertebrates and resides in a unique homeo-domain. Development 2011; 138(22): 4853-65.
56. Aksoy I, Jauch R, Eras V, et al. Sox transcription factors require selective interactions with Oct4 and specific transactivation functions to mediate reprogramming. Stem Cells 2013; 31(12): 2632- 46.
57. Liu X, Sun H, Qi J, et al. Sequential introduction of reprogramming factors reveals a time-sensitive requirement for individual factors and a sequential EMT-MET mechanism for optimal reprogramming. Nat Cell Biol 2013; 15(7): 829-38.
58. Thier M, Wörsdörfer P, Lakes YB, et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell 2012; 10(4): 473-9.
59. Huangfu D, Maehr R, Guo W, et al. Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small molecule compounds. Nat Biotechnol 2008; 26(7): 795-7.
60. Huangfu D, Osafune K, Maehr R, et al. Induction of pluripotent stem cells from primary human fibroblasts with only Oct4 and Sox2. Nat Biotechnol 2008; 26(11): 1269-75.
61. Shi Y, Do JT, Desponts C, et al. A combined chemical and genetic approach for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell 2008; 2(6): 5258.
62. Shi Y, Desponts C, Do JT, et al. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic fibroblasts by Oct4 and Klf4 with smallmolecule compounds. Cell Stem Cell 2008; 3(5): 568-74.
63. Li W, Zhou H, Abujarour R, et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells in the absence of exogenous Sox2. Stem Cells 2009; 27(12): 2992-3000.
64. Yuan X, Wan H, Zhao X, et al. Brief report: combined chemical treatment enables Oct4-induced reprogramming from mouse embryonic fibroblasts. Stem Cells 2011; 29(3): 549-53.
65. Mikkelsen TS, Hanna J, Zhang X, et al. Dissecting direct reprogramming through integrative genomic analysis. Nature 2008; 454(7200): 49-55.
66. Li W, Tian E, Chen ZX, et al. Identification of Oct4-acti-vating compounds that enhance reprogramming efficiency. Proc Natl Acad Sci USA 2012; 109(51): 20853-8.
67. Kang PJ, Moon JH, Yoon BS, et al. Reprogramming of mouse somatic cells into pluripotent stem-like cells using a combination of small molecules. Biomaterials 2014; 35(26): 7336-45.
68. Hou P, Li Y, Zhang X, et al. Pluripotent stem cells induced from mouse somatic cells by small-molecule compounds. Science 2013; 341(6146): 651-4.
69. Tanabe K, Nakamura M, Narita M, et al. Maturation, not initiation, is the major roadblock during reprogramming toward pluripotency from human fibroblasts. Proc Natl Acad Sci USA 2013; 110(30):12172-9.
70. Rais Y, Zviran A, Geula S, et al. Deterministic direct reprogramming of somatic cells to pluripotency. Nature 2013; 502(7469): 65-70.
71. Mali P, Chou BK, Yen J, et al. Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency-associated genes. Stem Cells 2010; 28(4): 713-720.
72. Li R,Liang J, Ni S, et al. A mesenchymal-to-epithelial transition initiates and is required for the nuclear reprogramming of mouse fibroblasts. Cell Stem Cell 2010; 7(1): 51-63.
73. Worringer KA, Rand TA, Hayashi Y, et al. The let-7/LIN-41 pathway regulates reprogramming to human induced pluripotent stem cells by controlling expression of prodifferentiation genes. Cell Stem Cell 2014; 14(1): 40-52.
74. Lee J, Sayed N, Hunter A, et al. Activation of innate immunity is required for efficient nuclear reprogramming. Cell 2012; 151(3): 547-558.
75. Ding S, Wu X, Li G, et al. Efficient transposition of the piggyback (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell 2005; 122(3):473-483.
76. Wu SC, Meir YJ, Coates CJ, et al. piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci USA 2006; 103(41):15008-13.
77. Cadinanos J, Bradley A. Generation of an inducible and optimized piggyBac transposon system. Nucleic Acids Res 2007; 35(12): e87.
78. Wang W, Lin C, Lu D, et al. Chromosomal transposition of Piggy-Bac in mouse embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 2008;105(27): 9290-5.
79. Woltjen K, Michael IP, Mohseni P, et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature 2009; 458(7239): 766-70.
80. Okita K, Yamakawa T, Matsumura Y, et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells 2013; 31(3): 458-66.
81. Chestkov IV, Vasilieva EA, Illarioshkin SN, et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells for SOD1-asso-ciated amyotrophic lateral sclerosis pathogenesis studies. Acta Naturae 2014; 6(1): 54-60.
82. Xue Y, Cai X, Wang L, et al. Generating a non-integrating human induced pluripotent stem cell bank from urine-derived cells. PLoS One 2013; 8(8): e70573.
83. Zhou T, Benda C, Duzinger S, et al. Generation of induced pluripotent stem cells from urine. J Am Soc Nephrol 2011; 22(7): 1221-8.
84. Zhou J, Wang X, Zhang S, et al. Generation and characterization of human cryptorchid-specific induced pluripotent stem cells from urine. Stem Cells Dev 2013; 22(5): 717-25.
85. Chen Y, Luo R, Xu Y, et al. Generation of systemic lupus erythematosus-specific induced pluripotent stem cells from urine. Rheumatol Int 2013; 33(8): 2127-34.
86. Zhou T, Benda C, Dunzinger S, et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Protoc 2012; 7(12): 2080-89.
