CC BY
21
Вюник Дтпропетровського унiверситету. Бюлопя, медицина Visnik Dnipropetrovs'kogo universitetu. Seria Biología, medicina Visnyk of Dnipropetrovsk University. Biology, medicine
Visn. Dnipropetr. Univ. Ser. Biol. Med. 2014. 5(2), 143-147.
doi:10.15421/021427
ISSN 2310-4155 print ISSN 2312-7295 online
www.medicine.dp.ua
УДК 577.156:612.015
Нейропротекторш ефекти а-лшоево1 кислоти на розвиток окисного стресу й астроглюзу у мозку СТЗ^абетичних щурiв
С.В. Кириченко, 1.В. Прищепа, В.С. Лагода, М.О. Велика, В.С. Недзвецький
Днтропетровський нацюнальний утверситет Мет Олеся Гончара, Днтропетровськ, Укра'ша
Дослщжено вплив стрептозотоцин-шдукованого дабету на розвиток окисного стресу в нервовш тканинi, стан глiальних про-мiжних фiламентiв, показано протекторний вплив a-лiпоeвоi кислоти. У мозку щурiв i3 стрептозотоцин-iндукованим дiабетом ви-значено достовiрне зростання вмiсту продукпв перекисного окислення лiпiдiв. Змiни полшептидного складу глiального фiбриляр-ного бика виявлено в гiпокампi та кор1 великих пiвкуль. У гiпокампi щурiв iз гiпертиреозом вщмчаеться збiльшення штенсивносп полiпептидних зон як розчинноi, так i фiламентноi форм глiального фiбрилярного кислого бiлка. Виявлено високий ступшь коре-ляци мiж вмiстом ГФКБ i рiвнем продуктов перекисного окиснення. Ц данi вказують на важливу роль окисного стресу в шдукцп астроглiальноi реактивноi вiдповiдi за умов розвитку дiабетичноi енцефалопатй. Отриманi результата вказують на можливють реконструкцii цитоскелета глiальних клiтин пiд протекторним впливом a-лiпоeвоi кислоти.
Ключовi слова: стрептозотоцин-шдукованний даабет; окисний стрес; глiальнi промiжнi фшаменти; a-лiпоeва кислота
Neuroprotective effects of a-lipoic acid on the development of oxidative stress and astrogliosis in the brain of STZ-diabetic rats
S. Kyrychenko, I. Prishchepa, V. Lagoda, M. Velika, V. Nedzvetsky
Oles Honchar Dnipropetrovsk National University, Dnipropetrovsk, Ukraine
The aim of this study was to examine whether the antioxidant alpha-lipoic acid protects neurons from diabetic-reperfusion injury. The streptozotocin (STZ) rat model was used to study the glial reactivity and prevention of gliosis by alpha-lipoic acid (alpha-LA) admin-?stration. The expression of glial fibrillary acidic protein (GFAP) was determined, as well as lipid peroxidation (LPO) and glu-tathione (GSH) levels in some brain tissues. We observed significant increasing of lipid peroxidation products in both hippocampus and cortex. Changes of polypeptide GFAP were observed in hippocampus and cortex. Both soluble and filamentous forms of GFAP featured the increase in hippocampus of rat with hyperthyreosis. In the filament fractions, increase in the intensity of 49 kDa polypeptide band was found. In the same fraction of insoluble cytoskeleton proteins degraded HFKB polypeptides with molecular weight in the range of 46-41 kDa appeared. Marked increase of degraded polypeptides was found in the soluble fraction of the brain stem. The intensity of the intact polypeptide -49 kDa, as well as in the filament fraction, significantly increased. It is possible that increasing concentrations of soluble subunits glial filaments may be due to dissociation of own filaments during the reorganization of cytoskeleton structures. Given the results of Western blotting for filament fraction, increased content of soluble intact 49 kDa polypeptide is primarily the result of increased expression of HFKB and only partly due to redistribution of existing filament structures. Calculation and analysis of indicators showed high correlation between the increase in content and peroxidation products of HFKB. These results indicate the important role of oxidative stress in the induction of astroglial response under conditions of diabet encefalopathia. Administration of alpha-LA reduced the expression both of glial and neuronal markers. In addition, alpha-LA significantly prevented the increase in LPO levels found in diabetic rats. GSH levels increased by the administration of alpha-LA. This study suggests that alpha-LA prevents neural injury by inhibiting oxidative stress and suppressing reactive gliosis. All these changes were clearly counteracted by alpha-lipoic acid. The results of this study demonstrate that alpha-lipoic acid provides for protection to the GFAP, as a whole, from diabet -reperfusion injuries.
Keywords: streptozotocin (STZ); alpha-lipoic acid (alpha-LA); glial fibrillary acidic protein; lipid peroxidation
Днтропетровський нащональний утверситет iMemi Олеся Гончара, пр. Гагарта, 72, Днтропетровськ, 49010, Украта Oles Honchar Dnipropetrovsk National University, Gagarin Ave., 72, Dnipropetrovsk, 49010, Ukraine Tel.: +38-095-338-61-79. E-mail: [email protected]
Вступ
Бшки промтжних фiламентiв розглядаються як на-дшш гiстоспецифiчнi маркери. У нервовш тканинi про-мiжнi фшаменти представленi триплетом бiлкiв нейро-фшаменпв та глiальним фiбрилярним кислим бшком (ГФКБ). ГФКБ е головним структурним компонентом пром1жних фiламентiв астроцитарного цитоскелета, розглядаеться як надiйний маркер астроцит1в. Реакц1я астроцит1в на дш факторгв, що ушкоджують нервовi клiтини, супроводжуеться посиленим синтезом ГФКБ й iнтенсивним фiбрилогенезом. 1снують даш про змшу структури пром1жних фiламентiв i фiзико-хiмiчних вла-стивостей цитоскелетних бшшв при патолопях рiзно! етюлоги та ди ушкоджувальних факторiв (Eng et al., 2000). Рiвень ГФКБ використовуеться для оцшки розподiлу глiальних клiтин у ввдповвдь на нейрональне ушкодження. 1снують даш про те, що ГФКБ необхвдний для шдтримання стабшьно! морфологи астроципв, фор-мування глiального рубця та модуляци тально-нейронально! взаемоди в нормi та при нейропапях рiзно! природи (Lepekhin, 2001). ГФКБ залучаеться до реакщ! астроцитiв на нейрональнее ушкодження, що може ввдгравати роль у морфогенезi центрально! нервово! системи (Enns et al., 2007).
Антиоксиданти розглядаються як потенцiйнi протек-тори у захисп ввд розвитку оксидативного стресу. Вив-чено властивосп a-лшоево! кислоти як бiологiчного ан-тиоксиданта та пастки для вшьних радикалiв (Detry,
2006). Тканини центрально! нервово! системи та пери-феричних нервiв здатнi поглинати a-лiпоеву кислоту. Продемонстровано антиоксидангний ефект ц1е! кислоти у раа використання таких прооксидантш як гидроксид-радикал, гiпохлорна кислота, перекис водню, синглетний кисень, закис азоту та пероксинприл (Rose, 2006; Bernal,
2007). Недавно запропоновано використання a-лшоево! кислоти як терапевтичного агента-антиоксиданта у лiкуваннi низки нейродегенеративних захворювань (Enns et al., 2007). Мета дано! стати - подальше вивчен-ня антиоксидантних властивостей a-лiпоево! кислоти та И впливу на ршень глiальних маркерiв у мозку шурiв в умовах щоденного споживання протягом 45 дiб пiсля iндукцi! неконтрольованого дiабету.
Матерiал i методи дослвджень
У дослiдженнi використано 45 бших шурiв-самцiв лiнi! Вiстар, масою 190-230 г. Спочатку формували двi групи. Тваринам першо! групи iнгранеригонеально (одноразово) уводили розчинений у натрш-цитратному буферi (рН 4,5) стрептозотоцин (СТЗ) («Sigma», США) у дозi 50 мг/кг маси тварин. Вмiст глюкози визначали за 3 доби тсля iн'екцi!. Для подальшого проведення експе-рименту вiдбирали тварин iз ршнем глюкози понад 250 мг/100 мл. Цих шурiв випадковим чином подшяли на двi групи. Тваринам першо! групи робили щоденнi iнтранеритонеальнi ш'екци a-лiпоево! кислоти в дозi 100 мг/кг (група a-ЛК, n = 15) протягом 6 тижшв, тваринам друго! групи вводили буфер (група СТЗ, n = 15). Тваринам контрольно! групи (n = 15) робили ш'екци
ЗФР. Масу тварин i рiвень розвитку дiабету контролю-вали за 6 тижнiв до завершення експерименту.
П1сля деканiтадi! вилучали головний мозок, охолод-жували та роздшяли на вщдши. 0,2 г тканини (головний мозок загалом, кора великих твкуль, мозочок, середнш мозок) гомогетзували в 4,0 мл 0,025 М трис-буфера (рН 8,0), що мктив 2 мМ ЭДТА, 1 мМ 2-меркапто-етанолу, 0,1 мМ феншметилсульфошлфториду та соевий iнгибiтор трипсину (10 мкг/мл). Гомогенат центрифугува-ли при 30 000 g протягом 60 хв. Супернатант (Si) мстив розчинт бшки. Осад ресуспендували в 0,5 мл те! ж буферно! системи, яка додатково мiстила 4 М сечовину. Супернатант, який отримували пiсля другого центрифу-гування (S2), мiстив нерозчиннi бшки пром1жних фшаменпв. Умiст загального бшка в екстрактах визначали методом Лоурi в модифжаци Мшлера (Miller, 1959). Визначення полшептидного складу глiальних фшаменпв проводили за допомогою iмуноблотингу з використанням полжлонально! моноспедифiчно! антисироватки у розве-деннi 1 : 1 500, як описано ранше. Кiлькiсний аналз ГФКБ проводили за допомогою комп'ютерно! обробки сканованих результапв 1муноблотингу (LabWork 4.0). Рiвень перекисного окислення лшвдв вимiрювали з використанням тест-набору LPO-586 (Oxis, Int. Inc., USA).
Обробку одержаних даних проводили методами ва-рiадiйно! статистики для малих вибiрок. Вщносний вмiст ГФКБ виражали у виглядi середньо! величини ± стандартна похибка середньо! (x ± SE), достовiрну рiзнидю м1ж групами оцiнювали iз застосуванням ^критерш Стьюдента (Р < 0,05) тсля перевiрки гiпотез про нормальнiсть розподшу.
Результата та ix обговорення
Уведення стрептозотоцину викликало яскраво вира-жену гшерткемш пор1вняно з контрольною групою щур1в. 1н'екцй a-лiноево! кислоти (100 мг/кг) протягом 45 дб спричинили значне зниження р1вня глюкози порш-няно з СТЗ-дiабетичною групою шурiв. Виявлений р1вень перекисного окислення лшвдв був значно вищим у груш СТЗ-дiабетичних тварин вщносно контрольно! групи (рис. 1), а вмст вщновленого глутатюну був iстотно зниженим у тканинах мозку тварин з шдукованим дабетом вщносно контролю (рис. 2). Однак умiст нродуктiв ПОЛ значно знижувався, а вмiст вщновленого глутатюну у гiнокампi та корi зростав пщ час курсових ш'екцш a-лшоево! кислоти в групi a-лшоево! кислоти щодо групи СТЗ-да-бетичних щур1в. Усе це разом свщчить про виражений антиоксидантний ефект a-лшоево! кислоти за умов гiперглiкемi!, шдуковано! введенням СТЗ.
Рiвень експресй ГФКБ був значно вищим у вс1х до-слщжених вiддiлах мозку у тварин iз групи СТЗ щодо контрольно! групи (рис. 3). Умкт деградованих полшеп-тидiв ГФКБ був також iстотно збшьшеним у вах Ri.Tii-лах мозку щурiв iз дiабетом. Разом iз пщвищенням загального вмюту ГФКБ виявлено також значне зростання вмiсту полшептидних фрагмента ГФКБ в ус1х досль джених вщд лах мозку дiабетичних щур1в (рис. 4). На пiдстаRi отриманих результапв можна припустити, що СТЗ-шдукований дiабет викликае реактивний глiоз, оскшьки обидва бiлки е маркерами активносп глй.
S"
Bmíct продукта перекисного окисления лшццв, нмоль/мг бшка
5' о
g bj
s" s Я
H --1
1
ш
1 1 1 —1
h
-
1 1 1
h
II
h —i
I I H >
системи активуються до пролiферацiï та диференщацц у раз1 механiчних i фiзичних пошкоджень, захворювань pi3HOï природи та хiмiчного iнсульту (Pekny et al., 2004). Можливо припустити позитивний вплив астроглюзу на
виживанiсть нейронiв. Однак вщомо, що акгивованi глiальнi клтини секретують також цитокши, компоненти системи комплементу та вшьт радикали, як1 спричиню-
ють ушкодження нервових клггин.
чят «* щт щт - "5кД"
1 : 3 Ппокаып
I 2 3 Корт Ь л.
1 2 ) m : i : ':ok
12 3 12 3
Гшокамп Кора в. п
12 3 12 3 Писками Кора в. п
ar ~ щ
1 2 3 Мозочок
1 2 3 Мозочок
49 кДа 4бкДа
49кДа 46 кДа
Рис. 4. 1муноблотинг ГФКБ Ï3 мозку щур1в: а - шуноблотинг цитоскелетних фракций ГФКБ, б - шуноблотинг трито-нових фракцiй ГФКБ, в - iмуноблотинг розчинних цитоскелетних фракцш ГФКБ; 1 - контрольна група, 2 - СТЗ-д1абетична група, 3 - СТЗ-д1абетична група щурiв, яю отримували ш'екци a-лiпоево! кислоти (100 мг/кг)
Виявлене зниження вмюту продуктiв ПОЛ у в1дд1лах мозку дiабетичних щур1в в умовах уведення a-лiпоeвоï кислоти дозволяе припустити, по-перше, що введення а-лiпоeвоï кислоти запобтае порушенням обм1ну лiпiдiв при дiабетi i, по-друге, принаймнi часткова протективна дiя а-лшоево" кислоти при гiперглiкемiчному нейро-нальному ушкодженнi реатзуеться за рахунок перехоп-лення вшьних радикатв i антиокисних властивостей. Ц припущення збiгаються з ранiше описаним захисним ефектом кислоти за токсичного нейронального ушкодження за рахунок перехоплення вiльних радикалiв (Song et al., 2005). Уведення а-лшоево" кислоти викликало збiльшення вмiсту вщновленого глутатюну у вщдшах мозку, що дозволяе припустити захисний ефект вщ окисного стресу за рахунок антиокисних властивостей кислоти та збшьшення, у свою чергу, захисного потенцiалу тканин мозку проти 1ндукованого стрептозо-тоцином оксидативного стресу (Baydas et al., 2004).
а-Лшоева кислота може виявитися ефективною при запобпгант та терапй' оксидативного стресу в ряда мо-дельних або клЫчних ситуацш. Так1 антиоксиданти як а-л1поева кислота, глутатюн i вгтамши А, Е, С беруть участь у детоксиф1каци перекису водню, гщроксид- i пероксид-радикал1в, реактивних сполук азоту. Кр1м того, вони акти-вують антиоксидативнi ферменти супероксиддисмутазу та глутатюнпероксидазу. Оксидативний стрес при дабеп спричинюе ушкодження нуклешових кислот, бшюв i лшщв, що супроводжуеться клiтинною дисфункщею i некрозом, а також викликае функцiональну та структурну дегенерацш центрально" нервово" системи (Bruckner, 2002). Таким чином, антиоксиданти можуть знаходити застосування у профiлактицi серцево-судинних i мозкових ускладнень дiабету, знижуючи нагромадження активних форм кисню.
Захисний ефект а-лшоево" кислоти також виражався у зменшенн реактивносп глiï. ОIриманi данi уперше де-монструють зниження експресiï тальних i нейронального маркер1в у рiзних вщдшах мозку д1абетичних шурiв в умовах уведення a-лiпоевоï кислоти. Унаслщок
позитивно" асоцiацiï м1ж ргвнем маркергв i вагою вражен-ня це зниження можна розглядати як позитивну тенденцш до вщновлення порушеного при дабеп функцюнування нервово" системи. Gonzalez-Perez et al. (2002) знайшли зниження реактивного глюзу в моделi тромбоемболiчного шсульту у щур1в при введеннi а-л1поево" кислоти та вiтам1ну Е внаслвдок "х антиоксидантно" активностi. Можливий одночасний вне-сок декшькох ушкоджувальних агент1в у реакцiю астроципв при дабеп, одним 1з них служить атака центрально!' нервово" системи вшьними радикалами (Yang et al., 2010). У данш працi показано пряму в1дпов1дь астроцит1в на оксидативний стрес, яка супроводжуеться пщвищенням експрес1ï тальних маркер!в при г1перглiкем1ï та iï зниженням у разi уведення антиокси-данта (а-л1поево" кислоти). Кр1м того, зниження експреси нейрон-специф1чно" енолази у раз1 уведення кислоти може вказувати на ïï захисний ефект за ушкодження нейрошв в умовах гшерткеми. Кр1м антиоксидантних властивостей а-лшоева кислота може бути нейропротек-тором in vivo за рахунок пригн1чення надмрно" реактивносп гли, що ускладнюе нейропатш при дабет! Уведення кислоти може викликати подв1йний протектор-ний ефект при д1абетичн1й нейропагiï за рахунок зниження як оксидативного стресу, так i реактивносп гли.
Останшм часом активно досл1джуються властивосп а-лшоево" кислоти як нетоксичного природного антиок-сиданта (Bonnefont-Rousselot, 2004). Тканини центрально! нервово" системи та периферичних нерв1в здатн швидко поглинати а-лшоеву кислоту. Продемонстрова-но антиоксидантний ефект ще" кислоти п1д час застосування таких прооксиданпв як пдроксид-радикал, гшохлорна кислота, перекис водню, синглетний кисень, закис азоту та пероксинприл. Недавно запропоновано використання а-лшоево" кислоти як терапевтичного агента - антиоксиданта для лшування низки нейродеге-неративних захворювань (Poon et al., 2005).
Дегенераця та загибель нейрошв при д1абет1 можуть бути пов'язат з активащею утворення вшьних радикал1в
а
6
в
через порушення функцюнування м1тохондр!й i антиоксидантно! системи (Gandhi, 2010).
Представлен результата свщчать про те, що активтсть глальних клтгин мае виршальне значения для репараци иейроиальиих ушкоджень р1зно1 природи. У той самий час надмрно штенсивний розвиток астроглюзу може бути не тшьки корисним, а i в окремих випадках перешкоджати репарацii через формування тально-мезодермaльного рубця. 1снують дат, що гтпертрофоват астроцити, яш утворюють тальний рубець у вщиовщь на хiмiчиий шсульт, можуть гальмувати проростання нейрипв. Таким чином, антиоксиданти виявляють нейро-протекторну дю не лише через безпосередне гальмування окисного стресу, а й завдяки зниженню надмрно iитенсивноl астрогтальнох вщиовщ.
Висновки
При експериментальному стрепозотоцин-щдуковано-му д1абеп вщбуваеться суттеве щдвищення вмюту ТБК-реактивних иродукпв у вщдшах мозку шур1в порiвияно з контрольною групою та зниження ршня глутатюну. Визначено збшьшення вмкту астроцитарного цитоске-летного маркера ГФКБ та полшептидного складу у мозку щур1в експеримеитальноl групи, як! корелюють 1з вмктом ТБК-реактивних иродукг!б. Уведення а-л1поево1 кислоти (100 мг/кг) протягом 45 д1б сирияло статистично достов1рному зниженню вм1сту иродукг1Б перекисного окиснення nininiB, а також пiдвищению вм1сту в1дновле-ного глутатiоиу в гшокамт га кор1 великих п1вкуль порь вняно з СТЗ-д1абетичною групою та суттевому зниженню вм1сту деградованих полшептидних фрагмеитiБ ГФКБ. Значн1 зм1ни вмсту та полiиеитидиого складу ГФКБ свщ-чать про 1нтенсивн1 цитоскелетн1 перебудови та пригт-чення астрогл1озу уведенням а-л1иоево1 кислоти.
Бiблiогрaфiчнi посилання
Baydas, G., Donder, E., Kiliboz, M., Sonkaya, E., Tuzcu, M., Yasar, A., Nedzvetskii, V.S., 2004. Neuroprotection by а-lipoic acid in streptozotocin-induced diabetes. Biochemistry (Moscow) 69(9) 1233-1238. Bernal, J., Nunez, J., 1995. Thyroid hormones and brain development. Eur. J. Endocrinol. 133(4), 390-398.
Bonnefont-Rousselot, D., 2004. The role of antioxidant micro-nutrients in the prevention of diabetic complications. Treat Endocrinol. 3(1), 41-52.
Bruckner, I., Bustan, C., Adamescu, E., Dobjanschi, C., 2002. Diabetic neuropathy-choices of treatment. Rom. J. Intern. Med. 40(1-4), 53-60.
Eng, L.F., 2000. Glial fibrillary acidic protein: GFAP-thirty-one years (1969-2000). Neurochem. Res. 25(9-10), 1439-1451.
Gandhi, G.K., Ball, K.K., Cruz, N.F., Dienel, G.A., 2010. Hy-perglycaemia and diabetes impair gap junctional communication among astrocytes. ASN Neuro 15(2), e00030.
Gonzalez-Perez, O., Gonzalez-Castaneda, R.E., Huerta, M., Luquin, S., Gomez-Pinedo, U., Sanchez-Almaraz, E., Navarro-Ruiz, A., Garcia-Estrada, J., 2002. Beneficial effects of alpha-lipoic acid plus vitamin E on neurological deficit, reactive gliosis and neuronal remodeling in the penumbra of the ischemic rat brain. Neurosci. Lett. 321(1-2), 100-104.
Graham, D.G., 1999. Neurotoxicants and the cytoskeleton. Curr. Opin. Neurol. 12(6), 733-737.
Lepekhin, E.A., Eliasson, C., Berthold, C.H., Berezin, V., Bock, E., Pekny, M., 2001. Intermediate filaments regulate astrocyte motility. J. Neurochem. 79(3), 617-625.
O'Callaghan, J.P., Jensen, K.F., Miller, D.B., 1995. Quantitative aspects of drug and toxicant-induced astrogliosis. Neuro-chem. Int. 26(2), 115-124.
Panickar, K.S., Jayakumar, A.R., Rama Rao, K.V., 2007. Down-regulation of the 18-kDa translocator protein: Effects on the ammonia-induced mitochondrial permeability transition and cell swelling in cultured astrocytes. Glia 55(16), 1720-1727.
Pekny, M., Pekna, M., 2004. Astrocyte intermediate filaments in CNS pathologies and regeneration. J. Pathol. 204(4), 428-437.
Poon, H.F., Farr, S.A., Thongboonkerd, V., Lynn, B.C., Banks, W.A., Morley, J.E., Klein, J.B., Butterfield, D.A., 2005. Pro-teomic analysis of specific brain proteins in aged SAMP8 mice treated with alpha-lipoic acid: Implications for aging and age-related neurodegenerative disorders. Neurochem. Int. 46(2), 159-168.
Rose, C., 2006. Effect of ammonia on astrocytic glutamate uptake/release mechanisms. J. Neurochem. 97, 11-15.
Song, K.H., Lee, W.J., Koh, J.M., Kim, H.S., Youn, J.Y., Park, H.S., Koh, E.H., Kim, M.S., Youn, J.H., Lee, K.U., Park, J.Y., 2005. alpha-Lipoic acid prevents diabetes mellitus in diabetes-prone obese rats. Biochem. Biophys. Res. Commun. 326(1), 197-202.
Yang, Z., Li, K., Yan, X., Dong, F., Zhao, C., 2010. Amelioration of diabetic retinopathy by engrafted human adipose-derived mesenchymal stem cells in streptozotocin diabetic rats. Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 2, 345-349.
Hadiumna do редкоnегu 12.07.2014
