CC BY
33
НЕСТАБИЛЬНОСТЬ ПРОСТЫХ ПОВТОРОВ ДНК ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ
КРОВИ КАК ГЕНЕТИЧЕСКИЙ МАРКЕР ПОСЛЕДСТВИЙ РАДИОХИМИОТЕРАПИИ ПО ПОВОДУ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
И.Ю. Стрелкова В.Н. Антипова А.Н. Богомазова2), Е.И.Гурова2), М.Г. Ломаева 1}, Л.А. Фоменко1-1, В.Г. Безлеикин1'3-1 ^Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино;
2)ФГУ «Российский научный центр рентгенорадиологии Росмедтехнологий», Москва;
3)Пущинский Государственный университет, Пущино E-mail: xf2@rambler.ru
Получены результаты, свидетельствующие, что уровень полиморфизма простых повторов ДНК периферической крови, регистрируемый посредством AP-PCR, может быть информативным генетическим маркером химической и радиационной нагрузки на организм пациентов, проходящих лечение по поводу РМЖ.
Введение. Рак молочной железы (РМЖ) - одно из наиболее распространенных онкологических заболеваний у женщин. В последнее время отмечается тенденция возрастания значения лучевой терапией (ЛТ) в лечении больных РМЖ, что обусловлено разработкой широкого спектра методик облучения. Ионизирующая радиация и химические препараты, используемые при лечении больных, поражают как опухолевые клетки, так и нормальные ткани организма. Эффективность лечебных курсов радио- или химиотерапии определяется балансом подавления развития опухоли и благополучным прогнозом посттерапевтической ситуации для отдельных тканей и организма в целом. Однако, частота поздних лучевых повреждений, связанных с возникновением вторичных раков и рецидивов, остается высокой, составляя 15% [5]. Индивидуальные особенности метаболизма цитостатиков, и толерантности организма пациентов к радиационному воздействию могут быть информативными параметрами для оценки допустимых уровней радио-и химиотерапевтической нагрузки в процессе лечения. Возможным маркером, в дополнение к развернутому клиническому анализу крови, будет состояние генома клеток периферической крови (ПК), отражающее уровень поврежденности ДНК кроветворных клеток костного мозга [6]. Быстрым и неинвазийным способом такой оценки может быть определение в ДНК клеток ПК уровня изменчивости (генетической нестабильности) гипервариабельных повторяющихся последовательностей, типа микро- и минисателлитов (МКС и МНС), которые составляют преимущественную часть генома. Предполагают участие МКС и МНС в контроле репликации и клеточного цикла, поэтому их индуцированная нестабильность может быть связана с малигнизацией.
Методы. Объектом исследований были препараты ДНК из клеток ПК пациенток отделения онкопатологии ФГУ «РНЦРР Росмедтехнологий», проходивших курс радио- и химиотерапии (РХТ) по поводу РМЖ (II и III стадии). В качестве контроля использовались образцы крови пациенток Пущинского медицинского центра (НЦБИ РАН в г.Пущино), обратившихся в поликлинику по причинам, не имеющим отношения к РМЖ.
Образцы крови получали за 3-4 дня до начала и спустя 7 дней после завершения сеансов терапии (полихимиотерапия по схеме AC или по схеме CAF); гамма-облучение при средней суммарной очаговой дозе 40 Гр.
Вариабельность МКС повторов ДНК определялись с применением технологии ПЦР с одиночным «случайно выбранным» праймером (AP-PCR) по уровню полиморфизма размеров набора амплифицированных продуктов, который обозначается в литературе термином «мультилокусный генетический маркер» (МГМ). В качестве праймеров использовали 5 разных олигонуклеотидов. Описание условий ПЦР с указанием оригинальных источников приведено ранее [1]. Продукты ПЦР-амплификации разделяли электрофорезом в полиакриламидном
геле и визуализировали окраской азотнокислым серебром. Далее изображения переводили в цифровой формат и обрабатывали с помощью специально разработанного программного средства [2]. Каждая дорожка электрофореграммы содержит индивидуальный набор полос - продуктов амплификации, которые соответствуют месту посадки праймера на ДНК-матрице. Программное обеспечение позволяет вычислять и сравнивать величины электрофоретической подвижности амплифицированных фрагментов ДНК разных людей. Различные по своим электрофоретическим подвижностям полосы обозначены как полиморфные. Доля полиморфных полос относительно их общего количества выражается как процент полиморфизма, и является важным оцениваемым параметром. Результаты и обсуждение. Полагают, что в AP-PCR амплифицируются преимущественно простые повторы типа МКС и МНС. Скорость спонтанного мутирования для этих локусов на два порядка превышает такой параметр для генов, кодирующих белки, и достигает значений от 10-4 до 10-2 на локус на поколение [3]. Широкое представительство МКС в геноме и их природная гипервариабельность позволяет надеяться на возможность обнаружения незначительных изменений в ДНК клеток, подвергавшихся воздействию генотоксических факторов, и делает этот тип генетических маркеров чрезвычайно привлекательным для исследований в радиационной генетике и генотоксикологии. Для группы из 8 больных РМЖ после химиотерапии выявлена тенденция повышения вариабельности повторов по количеству амплифицированных в AP-PCR продуктов по сравнению с периодом между постановкой диагноза РМЖ и началом терапии. Дополнительных изменений этого параметра после радиационной нагрузки выявить не удалось. Анализ вариабельности общей ДНК клеток ПК по доле полиморфных продуктов (доля от суммарного количества продуктов амплификации) при сравнении образцов ДНК, полученных из крови больных до начала курса химиотерапии и после его окончания, показывает достоверные различия в 3 случаях из 8. Изменения уровня полиморфизма, оцененного по двум указанным параметрам, в ранний период (через 7 суток) после РХТ существенно различались у разных пациенток, но имели качественно сходный характер в случае применения разных праймеров на одной ДНК-матрице. При использовании 2 праймеров из 5 обнаружено снижение доли полиморфных продуктов, тогда как в реакции с остальными тремя праймерами наблюдали увеличение этого показателя для ДНК пациенток, прошедших курс РХТ. Эти наблюдения согласуются с данным наших собственных исследований [4], а также с результатами работы Уорделл и соавтр. [5], где у пациентов, подвергшихся РХТ, была выявлено повышенное содержание делетированной мтДНК в клетках ПК и в мышцах. Повышенная частота делеций рассматривается как одно из проявлений индуцированной генотоксическим воздействием вариабельности ДНК соматических клеток. Для группы из 5 паценток, курс лечения которых включал хирургическое вмешательство и радиотерапию (но не химиотерапию), результаты AP-PCR-анализов (по параметру доли полиморфных продуктов) были рассчитаны как нормированные изменения доли полиморфных продуктов, амплифицированных в реакции с праймером 5'-AAAGGCGAGGACTTTGTCAA-3'. Расчет нормированных изменений был выполнен по формуле d = | ((Аобл - Акон) / Аср)| х100% , где Аср = (Аобл + Акон ) / 2. При этом Аобл и Акон - значения параметров для каждой из пациенток до начала радиотерапии и спустя неделю после завершения курса, соответственно.
2,5
1,5
0,5
А В С О Е
условный индекс пациента
2
1
0
□ нормированные величины
Рис.1. Изменение величины нормированных показателей уровня полиморфизма повторов в ДНК ПК больных РМЖ. Нормирование проводилось для 1-й (забор крови для анализа, перед курсом РХТ) и 3-й (забор крови спустя 7 дней после ЛТ) временных точек в курсе лечения.
Результаты, представленные на рис.1, демонстрируют повышение полиморфизма простых повторов ДНК (модуль относительного нормированного изменения) при наличии существенных индивидуальных различий. Ранжирование пациентов по уровню полиморфизма повторов ДНК после радиотерапии выявляет качественно сходный характер изменения этого параметра у этих пациентов до начала лечения и в процессе терапии (рис.2).
Рис. 2 Ранжирование пациентов по уровню полиморфизма повторов ДНК. В качестве исходного рангового критерия выбран уровень полиморфизма повторов в ДНК из ПК пациентов после РХТ. Рассматриваются 3 точки, характеризующие различные моменты течения заболевания: до проведения процедур, в процессе лечения и после окончания радиотерапии.
Другой способ оценки - расчет относительных среднегрупповых значений доли полиморфных продуктов. Вычисляются значения полиморфизма (доли полиморфных продуктов) для каждого из пациентов относительно всей группы и далее определяют значение средней величины для группы. При таком способе вычислений значения полиморфизма для группы из 5 пациенток, определенные до начала облучения и через 7 дней после окончания радиотерапии, составляют, 50% и 47% соответственно, тогда как для контрольной группы - 27%. Индивидуальные реакции на облучение при этом, естественно, не учитываются, и не выявляется
реакция на облучение. Но обнаружены существенные различия в группах здоровых людей и страдающих РМЖ. Результаты, полученные на образцах ДНК из ПК малой группы (5 человек) пациентов следует рассматривать как предварительные. Тем не менее, совокупность полученного фактического материала подчеркивает необходимость учета индивидуального анализа генетических изменений в клетках ПК в процессе лечения для оптимизации назначаемых курсов РХТ. Что касается механизмов, лежащих в основе проявления наблюдаемой изменчивости, то имеются данные, что в результате химиотерапии в ПК примерно в 5-15 раз возрастает количество стволовых клеток ПК [6]. Не исключено, что регистрируемые изменения уровня полиморфизма обусловлены этими изменениями. С другой стороны, известно, что апоптоз играет ведущую роль в росте и агрессивности опухоли. [7]. Можно предположить, что фрагменты генома апоптозных клеток опухоли, попадая в плазму крови [8], вносят вклад в регистрируемый повышенный уровень полиморфизма. Существуют данные об экспансии простых повторов в генах, ассоциированных с малигнизацией тканей, в частности и при РМЖ (см. обзор [9]).
Заключение. Представленные результаты позволяют полагать, что уровень полиморфизма, регистрируемого посредством AP-PCR, может быть информативным генетическим маркером химической и радиационной нагрузки на организм человека. Дальнейшие исследования полиморфизма МКС-ассоциированных повторов с расширением выборки обследуемых будут способствовать разработке метода оценки состояния организма пациентов, проходящих курс РХТ по случаю РМЖ, для конкретизации индивидуальных назначений доз цитостатиков и гамма-радиации.
Авторы выражают глубокую признательность руководителю отделения онкологии. РНЦРР д.м.н. Кешелава В.В. за внимание к работе и представление возможности проведения исследований на образцах ПК пациенток отделения.
Работа частично поддержана грантами программы Президиума РАН ФНМ-2007 и РФФИ № 06-04-49418.
1. Vasil'eva G.V. et al. // Mutat. Res.2001. V.485, P.133-141.
2. Skosyrev V.S. et al. // In: Proceedigs of The 3rd International Scientific Conference and Training School Medbiotech "Modern Issues of Innovation Activity in Biolology and Medicine" M., JSC "Aviaizdat". 2006. - P.182-183.
3. Weber J.L., Wong C. // Hum Mol Genet. 1993. V.2, P.1123-28.
4. Малахова Л.В. и др. // Вопросы онкологии. 2006. Т.52, С.398-403.
5. Wardell T.M. et al. // Mutat Res. 2003. V. 525, P.19-27.
6. Arslan O, Moog R. // Transfus Apher Sci. 2007. V.37, P.179-85. Epub 2007 Nov 5.
7. Боженко В.К., и др. (2005) // http:vestnik.rncrr.ru/vestnik/v4/papers/bozhen_v4.htm
8. Плошница А. И. и др. (2006) // http:vestnik.rncrr.ru/vestnik/v6/papers/plosh_v6.htm
9. Haberman et al. Trends Genet. (2008) // V.24, P.14-8. Epub 2007 Dec 4.
