CC BY
11
© Коллектив авторов, 2022
Хасанова Е.М., Ганковская Л.В., Греченко В.В.
Неоднозначная роль факторов врожденного иммунитета в нарушении фертильной функции у мужчин при варикоцеле
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 117997, г. Москва, Российская Федерация
Резюме
Введение. Проблема мужского бесплодия, вызванного варикоцеле, особенно актуальна, поскольку данная патология наиболее распространена у мужчин. Частота ее встречаемости, по данным разных авторов, достигает 10-30 %, а возникающие на этом фоне отклонения параметров спермограммы от нормы наблюдаются более чем у 40 % больных. Изучение механизмов системы врожденного иммунитета, участвующих в развитии патологического процесса при варикоцеле, представляет собой актуальную задачу и привлекает внимание все большего числа ученых в мире.
Цель исследования - изучение роли факторов врожденного иммунитета при мужском бесплодии, вызванном варикоцеле.
Материал и методы. В исследование были включены 60 доноров эякулята. Основную группу составили 27 пациентов с диагнозом «варикоцеле». Группу сравнения составили 33 здоровых донора.
Полученный биоматериал разделяли на фракции сперматозоидов и семенной жидкости методом центрифугирования в градиенте плотностей, из сперматозоидов выделяли нуклеиновые кислоты и методом полимеразной цепной реакции в реальном времени определяли уровень экспрессии генов ТЬК2, ТЬК4, И8Р60, И8Р70, И8Р90, 1Ь1Б, 1Ь18, ТЫШ. Концентрацию пептида ЖР70 в семенной жидкости определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа, концентрацию цитокинов ИЛ-1Р, ИЛ-18 и ФНОа - методом мультиплексного иммунофлуоресцентного анализа.
Результаты. В ходе комплексного анализа показателей системы врожденного иммунитета в сперматозоидах и семенной жидкости пациентов с варикоцеле было продемонстрировано повышение уровней экспрессии генов ТЬЯ2 и ТЬЯ4 в сперматозоидах пациентов с варикоцеле в 6,9 и в 4,18 раза соответственно, гиперэкспрессия генов белков теплового шока И8Р60, И8Р70 и И8Р90 - лигандов ТЬЯ2/4, увеличение уровней экспрессии генов цитокинов ТЫЕА, 1Ь1Б, 1Ь18 и содержание их белковых продуктов в семенной жидкости по сравнению с группой здоровых доноров эякулята. Продемонстрировано, что дисбаланс факторов врожденного иммунитета в эякуляте мужчин с варикоцеле коррелирует с нарушениями функциональных параметров сперматозоидов.
Заключение. В ходе исследования выявлена неоднозначная роль факторов врожденного иммунитета в эякуляте мужчин при варикоцеле. То11-подобные рецепторы сперматозоидов необходимы для распознавания патогенов и обеспечения локальной иммунной защиты, а белки теплового шока выполняют множество функций, обеспечивающих сперматогенез и оплодотворение. Однако гиперэкспрессия этих факторов ассоциирована со снижением как фертильных свойств сперматозоидов, так и их количества в эякуляте. В результате проведенного комплексного анализа системы врожденного иммунитета в эякуляте можно идентифицировать новые диагностические маркеры и мишени для тар-гетной терапии.
Ключевые слова: врожденный иммунитет; мужское бесплодие; варикоцеле; сперматозоиды; подвижность сперматозоидов; количество сперматозоидов
Статья получена 09.12.2021. Принята в печать 17.01.2022.
Для цитирования: Хасанова Е.М., Ганковская Л.В., Греченко В.В. Неоднозначная роль факторов врожденного иммунитета в нарушении фертильной функции у мужчин при варикоцеле. Иммунология. 2022; 43 (1): 61-70. БО!: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-1-61-70
Для корреспонденции
Хасанова Елена Минсалимовна -аспирант, ассистент кафедры иммунологии МБФ ФГАОУ ВО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: joimolino@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-6735-4693
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Ганковская Л.В.; сбор и обработка материала -Хасанова Е.М.; Греченко В.В.; статистическая обработка - Хасанова Е.М.; написание текста - Хасанова Е.М.; редактирование - Ганковская Л.В.
Khasanova E.M., Gankovskaya L.V., Grechenko V.V.
Сontroversial role of innate immunity factors in impaired fertility in men affected by varicocele
N.I. Pirogov Russian National Research Medical University (RNRMU) of the Ministry of Health of the Russian Federation, 117997, Moscow, Russian Federation
Abstract
Introduction. The problem of male infertility caused by varicocele is currently of great medical and social significance, since this pathology is the most common reproduction disease among men, the frequency of which reaches 10-30 %, and deviations from the norm in spermogram parameters that occur against this background are observed in more than 40 % of patients. The study of the mechanisms of the innate immune system involved in the development of the pathological process in varicocele is an urgent task, and attracts the attention of an increasing number of scientists around the world.
The aim of this study was to examine the role of innate immunity factors in male infertility caused by varicocele.
Material and methods. The study included 60 ejaculate donors. The main group consisted of 27 patients diagnosed with varicocele. The comparison group consisted of 33 healthy donors. The obtained biomaterial was separated to fractions of spermatozoa and seminal fluid by density gradient centrifugation, nucleic acids were isolated from spermatozoa, and the expression level of TLR2, TLR4, HSP60, HSP70, HSP90, IL1B, IL18, and TNFA genes was determined by real-time polymerase chain reaction. The concentration of the HSP70 peptide in seminal fluid was determined by enzyme-linked immunosorbent assay, while the concentration of cytokines IL-ip, IL-18 and TNFa was determined by multiplex immunofluorescence analysis.
Results. In the course of a comprehensive analysis of the indicators of the innate immunity system in the spermatozoa and seminal fluid of patients with varicocele, we demonstrated: an increase in the expression levels of genes of recognizing receptors TLR2 and TLR4 in the spermatozoa of patients with varicocele by 6.9 times and 4.18 times, respectively; overexpression of heat shock protein genes HSP60, HSP70 and HSP90 - TLR2/4 ligands; an increase in the levels of expression of the genes of cytokines TNFA, IL1B, IL18 and the concentration of their protein products in seminal fluid in comparison with a group of healthy ejaculate donors. It has been demonstrated that an imbalance of innate immune factors in the ejaculate of men with varicocele correlates with impaired functional parameters of spermatozoa.
Conclusion. In this study, we revealed the ambiguous role of innate immunity factors in the ejaculate of men with varicocele. Toll-like receptors of spermatozoa are necessary for pathogen recognition and local immune protection, while heat shock proteins perform many functions that ensure spermatogenesis and fertilization. However, overexpression of these factors is associated with a decrease in both the fertile properties of spermatozoa and their number in the ejaculate. As a result of a comprehensive analysis of the innate immune system in the ejaculate, new diagnostic markers and targets for targeted therapy can be identified.
Keywords: innate immunity; male infertility; varicocele; spermatozoa; sperm motility; total spermatozoa number
Received 09.12.2021. Accepted 17.01.2022.
For citation: Khasanova E.M., Gankovskaya L.V., Grechenko V.V. Controversial role of innate immunity factors in impaired fertility in men affected by varicocele. Immunologiya. 2022; 43 (1): 61-70. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-1-61-70 (in Russian)
Funding. The study had no sponsor support.
Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
Authors' contribution. Concept and design of study - Gankovskaya L.V.; laboratory processing - Khasanova E.M.; Grechenko V.V.; data analysis - Khasanova E.M.; text writing - Khasanova E.M.; text editing - Gankovskaya L.V.
For correspondence
Elena M. Khasanova -Post-Graduate Student, Assistant of the Immunology Chair, MBF of N.I. Pirogov RNRMU of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: joimolino@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-6735-4693
Введение
Репродуктивная и иммунная системы находятся в тесной и динамичной взаимосвязи. Факторы врожденного иммунитета, широко представленные в мужском репродуктивном тракте, обеспечивают множество процессов: распознавание различных патогенных микроорганизмов, развитие и регуляцию воспаления, поддержание иммунопривилегированного статуса семенников и толерантности к многочисленным антигенам сперматозоидов [1]. Важной задачей врожденного иммунитета в обеспечении мужской фертильной функции является защита сперматозоидов как в процессе их созревания в семенниках, так и после эякуляции в женском репродуктивном тракте [2]. Однако в ряде случаев факторы врожденного иммунитета играют двойственную роль и становятся участниками патофизиологического процесса, поэтому в последние годы внимание ученых сфокусировано на их роли в патогенезе различных заболеваний, в том числе при мужском бесплодии, вызванном варикоцеле.
В структуре бесплодного брака наблюдается тенденция к росту встречаемости мужского фактора, а к нарушению мужской фертильной функции способно привести множество факторов [3-5]. На сегодняшний день известно, что в ~50 % случаев бесплодия в паре выявляются нарушения со стороны мужской репродуктивной системы и негативные изменения параметров спермо-граммы. Первое место среди причин развития мужской репродуктивной дисфункции занимает варикоцеле: среди бесплодных мужчин доля лиц с этой патологией составляет 35-40 % [6].
Ведущим патофизиологическим механизмом, лежащим в основе бесплодия при варикоцеле, считается варикозное расширение вен гроздевидного сплетения. При этом нарушается основная функция этого сплетения - теплообмен, обеспечивающий оптимальную температуру для протекания сперматогенеза - 35-36 °С [7]. Помимо локального повышения температуры, при ва-рикоцеле наблюдаются и другие патологические процессы, негативно сказывающиеся на фертильности мужчины: повышение уровня окислительного стресса, гормональный дисбаланс и увеличение интенсивности апоптоза сперматозоидов [8]. Перечисленные процессы являются факторами стресса, которые, действуя на клетку, могут стимулировать выработку эндогенных сигналов опасности (DAMP - danger-associated molecular pattern), в частности белков теплового шока [9, 10].
Белки теплового шока млекопитающих представляют собой высококонсервативную группу молекулярных шаперонов, принимающих участие в сборке белков [11]. Протеомный анализ сперматозоидов млекопитающих продемонстрировал высокое содержание в этих клетках белков HSP60, HSP70, HSP75 и HSP90 [12-14]. Индуцированные стрессом HSP обеспечивают рефолдинг денатурированных белков, предотвращая неблагоприятные метаболические эффекты, возникающие из-за накопления неправильно собранных белков, и протеотоксичес-кую гибель клеток путем запуска апоптоза [15].
Кроме того, выступая в роли эндогенных сигналов опасности, вырабатывающихся в ответ на повреждающее воздействие, белки теплового шока способны активировать паттерн-распознающие рецепторы врожденного иммунитета семейства TLR, согласно модели «опасность/повреждение» [10]. Показано, что на клеточной мембране сперматозоидов представлены рецепторы TLR2 и TLR4, которые обеспечивают функцию локальной защиты [16]. Известно, что в качестве эндогенных лигандов для рецептора TLR2 выступают белки теплового шока HSP70 и HSP90, а для TLR4 - HSP60 и HSP70, продукция которых может увеличиваться при варикоцеле вследствие гипертермии [8, 9]. Распознавание лигандов Toll-подобными рецепторами TLR2/4 ведет к активации МуБ88-зависимого сигнального пути и формированию ответа клетки на воздействие фактора стресса [17]. Кроме того, существуют единичные данные, свидетельствующие о том, что активация TLR на сперматозоидах снижает подвижность этих клеток вследствие нарушения мембранного потенциала митохондрий [18].
Однако точные механизмы нарушения фертильных свойств сперматозоидов вследствие нарушения баланса в системе врожденного иммунитета до сих пор изучены недостаточно, поэтому целью данного исследования стало изучение роли факторов врожденного иммунитета при мужском бесплодии, вызванном варикоцеле.
Материал и методы
Пациенты. Исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» (WMA Declaration of Helsinki - Ethical Principles for Medical Research Involving Human Subjects, 2013). Исследование было одобрено локальным этическим комитетом при ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пиро-гова Минздрава России (протокол заседания № 192 от 27 января 2020 г.). В установленном порядке пациенты подписывали информированное согласие на участие в исследовании и согласие на обработку персональных данных, после чего были получены образцы эякулята.
В исследование были включены 60 человек. В основную группу вошли 27 пациентов с диагнозом «варикоцеле» (24-39 лет). Группу сравнения составили 33 здоровых донора эякулята репродуктивного возраста (25-37 лет).
Критерии включения в основную группу: мужской фактор бесплодия при варикоцеле, отсутствие инфекционных процессов со стороны урогенитального тракта, подписание информированного согласия на участие в исследовании, репродуктивный возраст участников (24-39 лет).
Критерии исключения из основной группы: наличие острых хронических заболеваний или их обострения, гидроцеле, варикоцеле, паховой грыжи и других заболеваний, негативно влияющих на репродуктивную функцию, установленный женский фактор бесплодия в паре, употребление алкоголя и курение.
Таблица 1. Последовательности праймеров для исследования экспрессии генов TLR2, TLR4, HSP60, HSP70, HSP90, TNFA, IL1B, IL18
Название гена Прямая последовательность Обратная последовательность
TLR2 GAGTGGTGCAAGTATGAACTGGA TCCCAACTAGACAAAGACTGGTCT
TLR4 CCCTGAGGCATTTAGGCAGCTA AGGTAGAGAGGTGGCTTAGGCT
HSP60 TGCCAATGCTCACCGTAAGCCT AGCCTTGACTGCCACAACCTGA
HSP70 GACCAAGGACAATAACCTGCTGG GGCGTCAATGTCGAAGGTAACC
HSP90 CAAGTCTGGGACCAAAGCGTTC CTTTCTCAGCAACCAAATAAGCAG
TNFA CTCTTCTGCCTGCTGCACTTTG ATGGGCTACAGGCTTGTCACTC
IL1B CCACAGACCTTCCAGGAGAATG GTGCAGTTCAGTGATCGTACAGG
IL18 GATAGCCAGCCTAGAGGTATGG CCTTGATGTTATCAGGAGGATTCA
ACTB CACCATTGGCAATGAGCGGTTC AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT
В группу сравнения включали доноров с нормальными параметрами спермограммы, без каких-либо нарушений со стороны репродуктивной системы, соматических заболеваний, острых или обострения хронических заболеваний на момент участия в эксперименте.
Материал для исследования был получен из клиники репродуктивной медицины «ВитроКли-ник» (руководитель сети центров репродукции, врач-репродуктолог, к.м.н. П.А. Базанов), где пациенты консультировались или участвовали в программах вспомогательных репродуктивных технологий по причине бесплодия.
Лабораторные исследования. Образцы спермы были получены на 2-6-й день воздержания. После разжижения эякулята была проведена оценка параметров спермограммы: объем, концентрация (млн/мл), подвижность (%) и морфология сперматозоидов - в соответствии с рекомендациями Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) по исследованию и обработке эякулята [19]. Показатель подвижности сперматозоидов складывается из процентного количества клеток категории А, передвигающихся по поступательной траектории с высокой скоростью, и клеток категории Б, также двигающихся прямолинейно, но с меньшей скоростью; согласно рекомендациям ВОЗ, в норме этот показатель составляет 50 %. Концентрацию сперматозоидов оценивали с помощью камеры Маклера, в норме этот показатель превышает 20 млн/мл [19]. В соответствии с рекомендациями, описанными в Руководстве ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека, с использованием коммерческого набора SPERMGRAD™ (Vitrolife Sweden AB) методом центрифугирования эякулята в градиенте плотностей отделяли фракции подвижных сперматозоидов от округлых клеток, лейкоцитов, дегенерирующих половых клеток и клеточного дебриса [2, 19].
После определения параметров спермограммы и разделения эякулята на фракцию сперматозоидов и семенную жидкость биоматериал в течение часа транспортировали в лабораторию кафедры иммунологии МБФ РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, где определяли экспрессию целевых генов и содержание их белковых продуктов в семенной жидкости. Выделение нуклеиновых кислот из полученной фракции
сперматозоидов проводили с использованием набора реактивов для выделения ДНК/РНК методом аффинной сорбции на частицах силикагеля «АмплиПРАИМ Рибо-сорб» (ИнтерЛабСервис, Россия) строго в соответствии с протоколом производителя. Полученные образцы хранили при -70 °С.
Для исследования уровня экспрессии целевых генов проводили реакцию обратной транскрипции (ОТ) с использованием «Набора для проведения реакции обратной транскрипции» («Синтол», Россия) для синтеза копий кДНК на основе выделенной матричной РНК. Затем полученную кДНК использовали в постановке по-лимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени (РВ). Реакционную смесь готовили из реактивов «Набора для проведения ПЦР-РВ в присутствии ин-теркалирующего красителя SYBR Green I» («Синтол», Россия), согласно рекомендациям фирмы-производителя. ПЦР проводили в амплификаторе Rotor-Gene Q (QIAGEN Hiden, Германия). Необходимые для реакции праймеры были синтезированы фирмой «Синтол» (Россия). Последовательности праймеров представлены в табл. 1.
Уровень экспрессии генов TLR2, TLR4, HSP60, HSP70, HSP90, TNFA, IL1B, IL18 оценивался по методу 2AACt в единицах относительно уровня экспрессии гена домашнего хозяйства ACTB, кодирующего ß-актин [20].
Определение концентрации белка HSP70 в семенной жидкости проводили с использованием коммерческого набора реагентов для количественного определения белка теплового шока HSP70 методом твердофазного иммуноферментного анализа (HSP70, кат. № ADI-EKS-715, Enzo Life Science Inc., Lauson, Швейцария). Анализ проводили в соответствии с методикой, описанной в инструкции. Результаты учитывали на микропланшетном фотометре Anthos 2020 (Biochrom, Великобритания) при длине волны 450 нм. Диапазон детекции концентрации для HSP70 составлял 0,20-12,5 нг/мл, минимальная определяемая концентрация для данного набора - < 0,09 нг/мл. Образцы предварительно разводили в 4 раза, согласно рекомендациям производителя.
В образцах семенной жидкости пациентов определяли содержание цитокинов ИЛ-lß, ИЛ-18 и ФНОа методом мультиплексного иммунофлуоресцентного ана-
э
ÊS b
20-,
15-
10-
5-
p < 0,001 Г
X
Ï
э
p < 0,01
p < 0,01 Г
X.
□ Пациенты с варикоцеле
□ Группа сравнения
800-,
600-
400-
§ 200«
p < 0,001
г
Ï
HSP60 HSP70 HSP90
Рис. 1. Гиперэкспрессия генов белков теплового шока HSP60, HSP70, HSP90 в сперматозоидах и увеличение концентрации HSP70 в семенной жидкости пациентов с варикоцеле.
А - гиперэкспрессия генов HSP60, HSP70 и HSP90 в сперматозоидах больных варикоцеле; Б - концентрация белка HSP70 в семенной жидкости мужчин с варикоцеле и доноров группы сравнения. Здесь и далее: данные представлены в виде Mean ± SD. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимали p < 0,05.
0
0
лиза на панели Bio-Plex Pro Human Cytokine Screening 48-plex (Bio-Rad, США) в соответствии с протоколом производителя. При помощи устройства Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader получали данные о концентрации исследуемого аналита (пг/мл) [21]. Концентрация цитокинов представлена в пг/мл.
Статистическая обработка данных проведена с использованием программного обеспечения Microsoft Excel 2016, STATISTICA 10.0 (StatSoft, USA) и GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, USA). Данные были проверены на нормальность распределения, определены их дисперсии. Сравнение исследуемых групп проводили с использованием непараметрического £/-критерия Манна-Уитни. Для анализа взаимосвязи нескольких переменных использовали коэффициент корреляции Спирмена. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимали p < 0,05.
Результаты
На первом этапе исследования в сперматозоидах бесплодных мужчин, страдающих варикоцеле, оценивали экспрессию генов белков теплового шока HSP60, HSP70, HSP90 и концентрацию HSP70 в семенной жидкости, являющихся эндогенными сигналами опасности при клеточном повреждении (рис. 1 А).
Достоверное увеличение экспрессии генов всех 3 агонистов Toll-подобных рецепторов выявлено в группе пациентов с варикоцеле. Так, в сравнении с группой здоровых доноров экспрессия гена HSP60 увеличена в 7,8 раз (р < 0,001), гена HSP70 - в 3,1 раза (р < 0,01), гена HSP90 - в 9 раз (р < 0,01).
Также мы исследовали уровень концентрации белка HSP70 в семенной жидкости больных варикоцеле. В сравнении с донорами эякулята группы сравнения концентрация белка в семенной жидкости мужчин с варико-целе была повышена в 2,75 раза (р < 0,001) (рис. 1Б).
b
20-,
15-
10-
5-
p < 0,001
г
p < 0,001
Г
i
TLR2
□ Пациенты
с варикоцеле
□ Группа сравнения
b
15—.
10-
5-
p < 0,001 Г~
i
p < 0,001 p < 0,01 I г
TLR4
IL1B
i
TNFA IL18
□ Пациенты
с варикоцеле
□ Группа сравнения
Рис. 2. Гиперэкспрессия генов TLR2 и TLR4 в сперматозоидах больных варикоцеле и доноров группы сравнения
Рис. 3. Гиперэкспрессия генов IL1B, TNFA и IL18 в сперматозоидах пациентов с варикоцеле и доноров группы сравнения
0
0
« s
3
3
I
£
60 -,
40-
20-
0
p < 0,001
□ Пациенты
с варикоцеле
□ Группа сравнения
i
ц н
£
25-,
20-
15-
10-
5-
0
p < 0,01
□ Пациенты
с варикоцеле
□ Группа сравнения
Рис. 4. Концентрация ФНОа в семенной жидкости у пациентов с варикоцеле и доноров группы сравнения
Рис. 5. Концентрация ИЛ-lß в семенной жидкости у пациентов с варикоцеле и доноров группы сравнения
300-,
200-
100-
0
p < 0,001
□ Пациенты
с варикоцеле
□ Группа сравнения
i
Рис. 6. Концентрация ИЛ-18 в семенной жидкости у пациентов с варикоцеле и доноров группы сравнения
Далее оценивали экспрессию генов паттерн-рас-познающих рецепторов врожденного иммунитета TLR2 и TLR4, представленных на клеточной поверхности сперматозоидов, у мужчин с варикоцеле и доноров группы сравнения. Продемонстрировано увеличение экспрессии генов TLR2 и TLR4 в сперматозоидах больных варикоцеле в 6,9 (р < 0,001) и в 4,18 раза (р < 0,001) соответственно по сравнению с группой здоровых доноров эякулята (рис. 2).
Известно, что активация TLR2 и TLR4 индуцирует синтез провоспалительных цитокинов, в связи с этим на следующем этапе нашего исследования мы изучали экспрессию генов эффекторных цитокинов IL1B, IL18 и TNFA в сперматозоидах и их белковых продуктов в семенной жидкости пациентов с варикоцеле (рис. 3). Обнаружено, что среди мужчин, страдающих варико-целе, экспрессия гена IL1B увеличена в 6 раз (р < 0,001), экспрессия гена TNFA повышена в 14 раз (р < 0,001), а экспрессия гена IL18 увеличена в 8,8 раза (р < 0,01) в сравнении со здоровыми донорами эякулята.
При анализе концентрации этих цитокинов в семенной жидкости пациентов с варикоцеле выявлено увеличение уровня ФНОа в 6,8 раза (р < 0,001), уровня ИЛ-1Р - в 10,4 раза (р < 0,01), уровня ИЛ-18 - в 5,8 раз (р < 0,001) по сравнению с группой здоровых доноров (рис. 4-6).
Особой задачей нашего исследования стал корреляционный анализ выявленных изменений в системе врожденного иммунитета и имеющихся у пациентов отклонений в параметрах спермограммы. В табл. 2 представлены молекулярно-генетические и функциональные характеристики сперматозоидов мужчин исследуемых групп - показатель подвижности сперматозоидов (%) и их количество в эякуляте (млн/мл). Показатель подвижности сперматозоидов доноров группы сравнения находится в пределах нормы и составлял 43-50 %. Подвижность сперматозоидов группы пациентов с варикоцеле составляла 27-39 %, что достоверно отличается от уровня подвижности сперматозоидов в группе сравнения и соответствует астенозооспермии средней степени тяжести. Количество сперматозоидов в эякуляте пациентов с варикоцеле также достоверно, в 2,2 раза, снижено по отношению к этому показателю в группе сравнения.
Корреляционный анализ взаимосвязи уровня концентрации HSP70 в семенной жидкости и подвижности сперматозоидов в эякуляте выявил умеренную отрицательную корреляцию по шкале Чеддока (R = -0,44; р < 0,01). При анализе взаимосвязи уровня концентрации ФНОа в семенной жидкости и количества сперматозоидов в эякуляте выявлена умеренная отрицательная корреляция (R= -0,53; p < 0,01). Анализ взаимосвязей между уровнем концентрации ИЛ-lß в семенной жидкости и подвижностью сперматозоидов в эякуляте продемонстрировал заметную отрицательную корреляцию (R= -0,68, р < 0,05) и сильную отрицательную корреляцию при анализе связи уровня концентрации ИЛ-18 в семенной жидкости и подвижностью сперматозоидов (R = - 0,81; p < 0,05).
Обсуждение
Проблема мужского бесплодия, вызванного варико-целе, имеет большую медико-социальную значимость [22]. На сегодняшний день имеются разрозненные данные об изучении влияния факторов врожденного иммунитета на фертильные свойства сперматозоидов и параметры спермограммы при мужском бесплодии,
Таблица 2. Корреляция функциональных параметров сперматозоидов пациентов с варикоцеле и здоровых доноров эякулята с показателями врожденного иммунитета в семенной жидкости
Параметр Группа пациентов с варикоцеле Группа сравнения Р
Подвижность сперматозоидов, % 33 ± 6,8 47,9 ± 3,7 < 0,001
Количество сперматозоидов, • 106/мл 63,3 ± 30,8 136,9 ± 51,8 < 0,0001
Концентрация И8Р70, пг/мл 616,6 ± 271,15 224,03 ± 106,06 < 0,01 R= -0,441
Концентрация ИЛ-ф, пг/мл 12,3 ± 8,5 1,2 ± 0,9 < 0,05 R= -0,681
Концентрация ИЛ-18, пг/мл 169,1 ± 95,2 29,1 ± 21,2 < 0,05 R= -0,81
Концентрация ФНОа, пг/мл 41,2 ± 8,05 6,8 ± 2,4 < 0,01 R= -0,532
1 - корреляция с уровнем подвижности сперматозоидов в эякуляте;2 - корреляция с количеством сперматозоидов в эякуляте.
вызванном варикоцеле. В настоящем исследовании был предложен комплексный анализ показателей врожденного иммунитета в сперматозоидах и семенной жидкости мужчин, страдающих варикоцеле, систематизирующий выявляемые изменения, который включает:
1) изучение экспрессии генов (И8Р60, И8Р70, И8Р90) и белков (ЖР70) теплового шока, являющихся лигандами То11-подобных рецепторов, в сперматозоидах и семенной жидкости пациентов с варикоцеле;
2) определение экспрессии генов ТЬК2 и ТЬК4 в сперматозоидах;
3) анализ экспрессии генов эффекторных цитокинов 1Ь1Б, 1118 и ТЫЕА в сперматозоидах пациентов, и определение концентрации их белковых молекул в семенной жидкости;
4) проведение корреляционного анализа между выявленными изменениями в системе врожденного иммунитета с изменением функциональных параметров сперматозоидов, отраженных в спермо-граммах пациентов.
Актуальность изучения сопутствующих патофизиологических механизмов при варикоцеле объясняется тем, что на сегодняшний день оно является наиболее распространенным среди мужчин репродуктивным заболеванием. Частота его встречаемости, по данным разных авторов, достигает 10-30 %, а возникающие на этом фоне отклонения параметров спермограммы от нормы наблюдаются более чем у 40 % пациентов [23, 24].
Среди патофизиологических механизмов, негативно сказывающихся на репродуктивной функции мужчины, особое место занимает варикозное расширение вен гроздевидного сплетения, ведущее к нарушению кровотока [25, 26]. В результате наблюдается локальное повышение температуры в семенниках и нарушение оптимальных условий, необходимых для протекания сперматогенеза, активация митохондри-ального пути апоптоза и снижение количества сперматозоидов в эякуляте [27]. Также известно, что гипертермическое воздействие на клетки индуцирует в них повышение продукции белков теплового шока, что является механизмом гомеостаза, направленным на восстановление баланса между синтезом и деградацией белка [28].
Взаимосвязь между тепловым стрессом и снижением фертильной функции была показана в многочис-
ленных работах зарубежных авторов. В нашей работе было исследовано влияние механизмов врожденного иммунитета на фертильные свойства сперматозоидов -их подвижность и количество в эякуляте. Мы обнаружили достоверное повышение экспрессии генов HSP60, HSP70 и HSP90 в сперматозоидах мужчин с варикоцеле по сравнению со здоровыми донорами эякулята (см. рис. 1).
В работе H. Hassanpour и соавт. в экспериментальной модели хирургически индуцированного варикоцеле также продемонстрировано повышение экспрессии гена HSP70 в сравнении с контролем, что согласуется с полученными нами результатами [29]. Однако в данной модели авторы выявили снижение экспрессии гена HSP90, в то время как в нашем исследовании в группе мужчин с варикоцеле экспрессия HSP90 была увеличена в 9 раз в сравнении со здоровыми донорами (см. рис. 1).
A. Ferlin и соавт. выявили повышение уровня различных белков теплового шока, в частности HSP90, в группе мужчин с варикоцеле и олигозооспермией [30]. Нами тоже была выявлена умеренная отрицательная корреляция при анализе взаимосвязи повышения уровня концентрации HSP70 в семенной жидкости и снижения подвижности сперматозоидов в эякуляте больных варикоцеле. Полученные данные в совокупности свидетельствуют о том, что изменение продукции этих молекулярных шаперонов негативно сказывается на фертильных параметрах эякулята, а именно на подвижности сперматозоидов и их количестве.
Поскольку выбранные нами для исследования белки теплового шока HSP60, HSP70 и HSP90 являются эндогенными лигандами TOll-подобных рецепторов TLR2 и TLR4, одной из задач нашего исследования стало изучение экспрессии их генов в сперматозоидах мужчин с варикоцеле.
TLR принадлежат семейству паттерн-распознаю-щих рецепторов и представляют собой основное звено системы распознавания врожденного иммунитета [9]. Стимуляция TLR их лигандами ведет к передаче акти-вационного сигнала в ядро и модуляции клеточного ответа на воздействие стрессорного фактора. Известно, что избыточная активация Toll-подобных рецепторов способна привести к снижению функциональных показателей сперматозоидов. Так, предполагается, что в условиях стерильного воспаления при варикоцеле
и чрезмерной активации Toll-подобных рецепторов и продукции ФНОа, взаимодействующего со своими рецепторами TNFR I типа, в сперматозоидах произойдет индукция апоптоза, что может привести к снижению их количества в эякуляте [31].
Нами впервые было проведено изучение экспрессии генов TLR2 и TLR4 в сперматозоидах мужчин с вари-коцеле. Показано, что уровни экспрессии генов TLR2 и TLR4 достоверно повышены в сравнении с группой здоровых доноров эякулята (см. рис. 2).
В исследовании X. Zhu было показано, что при действии на сперматозоиды человека и мыши агонистами TLR2 и TLR4 - зимозаном и ЛПС - снижался мембранный потенциал митохондрий и уровень АТФ в клетках в результате активации MyD88-PI3K-GSK3 а-зависимого пути, и такие сперматозоиды демонстрировали значительное снижение уровня подвижности [18]. Поскольку стимуляция определенных TLR как эндогенными, так и экзогенными лигандами ведет к активации единых внутриклеточных сигнальных каскадов, мы можем утверждать, что повышение концентрации белков теплового шока в семенной жидкости пациентов с варикоцеле ведет к гиперактивации TLR2 и TLR4 и снижению подвижности клеток эякулята.
Воспаление при варикоцеле носит стерильный характер, и активация TLR клеток мужского репродуктивного тракта, в том числе лейкоцитов, также присутствующих в эякуляте и чувствительных к белкам теплового шока, ведет к образованию ядерного фактора NF-kB, продукции провоспалительных цитокинов, таких как ФНОа, HT-1ß и ИЛ-18, и повышению их концентрации в семенной жидкости. Мы обнаружили, что в семенной жидкости мужчин с варикоцеле концентрация ФНОа выше в 6,8 раза, HT-1ß - в 10,4 раза, ИЛ-18 -в 5,8 раз по сравнению с донорами здоровой группы (см. рис. 4-6).
M. Zeinali и соавт. также установили, что в группе пациентов с варикоцеле повышается содержание ИЛ-18 в семенной жидкости [32]. Они предположили, что уровни других провоспалительных цитокинов в семенной жидкости пациентов с варикоцеле могут быть повышены, что было подтверждено в нашей работе при изучении концентрации ФНОа и HT-1ß.
M. Huleihel и соавт. выявили, что сперматозоиды способны продуцировать и секретировать ИЛ-1. Предполагается, что данный цитокин может оказывать влияние на физиологические функции сперматозоидов и регуляцию сперматогенеза как аутокринным, так и паракринным путем [33]. Нами, в свою очередь, было
■ Литература
1. Hedger M.P. Immunology of the Testis and Male Reproductive Tract. Comprehensive Toxicology. 2010; 189-230. DOI: https://www.doi. org/10.1016/B978-0-08-046884-6.01112-X
2. Хасанова Е.М., Ганковская Л.В., Греченко В.В., Свитич О.А. Значение пептидов семейства ß-дефензинов в снижении мужской репродуктивной функции. Иммунология. 2021; 42 (5): 470-9. DOI: https://www.doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-5-470-479
продемонстрировано повышение уровней экспрессии генов ШШ, TNFA и Ш18 в группе пациентов с варикоцеле (см. рис. 3).
Данные о влиянии ФНОа на фертильную функцию сперматозоидов в настоящее время противоречивы. В работе, проведенной А. Рег&сЬка и соавт., было показано, что при инкубации сперматозоидов в возрастающих концентрациях ФНОа подвижность и количество сперматозоидов снижались в зависимости от дозы и времени, аналогичный результат продемонстрирован в нашей работе [34]. Сходный результат был получен в работе I Ыап и соавт. [35].
Проапоптотический эффект ФНОа может объяснить развитие олигозооспермии у пациентов с варикоцеле, демонстрирующих его повышенные уровни в семенной жидкости. В нашем исследовании при анализе взаимосвязей повышения уровня концентрации ФНОа в семенной жидкости и снижением количества сперматозоидов в эякуляте пациентов с варикоцеле также была выявлена отрицательная корреляция. Однако I. Косак и со-авт. сообщали, что уровни ФНОа имели отрицательную корреляцию с подвижностью и морфологией сперматозоидов, но не с их количеством в эякуляте [36]. Таким образом, вопрос о влиянии ФНОа на функциональные параметры сперматозоидов остается дискуссионным и требует дальнейшего изучения.
Заключение
Таким образом, в ходе нашего исследования выявлена неоднозначная роль факторов врожденного иммунитета в эякуляте мужчин при варикоцеле. То11-подобные рецепторы сперматозоидов необходимы для распознавания патогенов и обеспечения локальной иммунной защиты, а белки теплового шока выполняют множество функций, обеспечивающих сперматогенез и оплодотворение. Однако мы показали, что гиперэкспрессия этих факторов ассоциирована со снижением как фертильных свойств сперматозоидов, так и их количеством в эякуляте. Несмотря на достигнутые успехи в изучении данной патологии некоторые молекулярные аспекты все еще имеют противоречивый характер, что требует дальнейшего изучения и привлечения большего внимания к проблеме.
Благодарность. Авторы выражают благодарность Центру высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России (руководитель центра д-р биол. наук Д.В. Ребриков) за возможность использования молекулярно-генетических технологий.
3. Лебедев Г.С., Голубев Н.А., Шадеркин И.А., Шадеркина В.А., Аполихин О.И., Сивков А.В., Комарова В.А. Мужское бесплодие в Российской Федерации: статистические данные за 2000-2018 годы. Экспериментальная и клиническая урология. 2019; 4: 4-12. DOI: https://www.doi.org/10.29188/2222-8543-2019-11-4-4-12
4. Agarwal A., Mulgund A., Hamada A., Chyatte M.R. A unique view on male infertility around the globe. Reproductive Biology and Endocri-
nology. 2015; 13: 37. DOI: https://www.doi.org/10.1186/s12958-015-0032-1
5. Гамидов С.И., Иремашвили В.В., Тхагапсоева Р. А. Мужское бесплодие: современное состояние проблемы. Фарматека. 2009; 9: 12-17.
6. Fang Y., Su Y., Xu J., et al. Varicocele-Mediated Male Infertility: From the Perspective of Testicular Immunity and Inflammation. Front Immunol. 2021; 12: 729539. DOI: https://www.doi.org/10.3389/fimmu.2021.729539
7. Masson P., Brannigan R.E. The varicocele. Urol Clin North Am. 2014; 41 (1): 129-44. DOI: https://www.doi.org/10.1016/j.ucl.2013.08.001.
8. Chan C.C., Sun G.H., Shui H.A., Wu G.J. Differential Spermato-zoal Protein Expression Profiles in Men With Varicocele Compared to Control Subjects: Upregulation of Heat Shock Proteins 70 and 90 in Varicocele. Urology. 2013; 81 (6): 1379.e1-8. DOI: https://www.doi.org/10.1016/j. urology.2013.01.031
9. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Мешкова Р.Я. Клиническая иммунология и аллергология с основами общей иммунологии. Москва : ГЭОТАР-Медиа, 2014. ISBN: 978-5-9704-1974-8.
10. Понасенко О.А., Ганковская Л.В., Свитич О.А. Роль белка теплового шока 70 в патогенезе сердечно-сосудистой патологии. Медицинская иммунология. 2019; 21 (2): 201-8. DOI: https://www.doi. org/10.15789/1563-0625-2019-2-201-208
11. Mayer M.P., Bukau B. Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism. Cell Mol Life Sci. 2005; 62 (6): 670-84. DOI: https://www.doi.org/10.1007/s00018-004-4464-6.
12. Baker M.A., Aitken R.J. Proteomic insights into spermatozoa: critiques, comments and concerns. Expert Rev Proteomics. 2009; 6: 691-705. DOI: https://www.doi.org/10.1586/epr. 09.76
13. Martinez-Heredia J., Estanyol J.M., Ballesca J.L., Oliva R. Pro-teomic identification ofhuman sperm proteins. Proteomics. 2006; 6: 4365-9. DOI: https://www.doi.org/10.1002/pmic.200600094
14. Oliva R., Martinez-Heredia J., de Mateo S., et al. Proteomics of human spermatozoa, protamine content and assisted reproduction outcome. Soc Reprod Fertil Suppl. 2007; 65: 527-30. PMID: 17644990.
15. Naaby-Hansen S., Herr J.C. Heat shock proteins on the human sperm surface. J Reprod Immunol. 2010; 84 (1): 32-40. DOI: https://www. doi.org/10.1016/j.jri.2009.09.006.
16. Saeidi S., Shapouri F., Amirchaghmaghi E., Hoseinifar H., Sab-baghian M., Sadighi Gilani M.A., Pacey A.A., Aflatoonian R. Sperm protection in the male reproductive tract by Toll-like receptors. Andrologia. 2014; 46 (7): 784-90. DOI: https://www.doi.org/10.1111/and.12149.
17. Kawai T., Akira S. TLR signaling. Semin Immunol. 2007; 19 (1): 24-32. DOI: https://www.doi.org/10.1016/j.smim.2006.12.004.
18. Xingxing Z., Dongyan S., Xiaoqian L., Weijuan G., Fengjiao W., Xuejiang G., Hui X., Lixin L., Hong Z. TLR signalling affects sperm mito-chondrial function and motility via phosphatidylinositol 3-kinase and gly-cogen synthase kinase-3a, Cellular Signalling. 2016; 28 (3): 148-56. DOI: https://www.doi.org/10.1016/j.cellsig.2015.12.002
19. Руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека. 5-е изд., Москва : Капитал-Принт, 2012. 292 c. ISBN: 978-5905106-09-05.
20. Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю., Семенов П. А., Са-вилова А.М., Кофиади И. А., Абрамов Д.Д. ПЦР в реальном времени. Москва : Бином. Лаборатория знаний, 2009. 223 с. ISBN: 978-5-00101-085-2.
21. Bio-Rad: Bio-Plex Pro Human Cytokine Assays. Instr. Manual. 23 c.
22. Hassanin A.M., Ahmed H.H., Kaddah A.N. A global view of the pathophysiology of varicocele. Andrology. 2018; 6 (5): 654-61. DOI: https://www.doi.org/10.1111/andr.12511. PMID: 29978951.
23. Pastuszak A.W., Wang R. Varicocele and testicular function. Asian J Androl. 2015; 17 (4): 659-67. DOI: https://www.doi.org/10.4103/1008-682X.153539. PMID: 25926610. PMCID: PMC4492060.
24. Schoor R.A., Elhanbly S.M., Niederberger C. The pathophysiology of varicocele-associated male infertility. Curr Urol Rep. 2001; 2 (6): 432-6. DOI: https://www.doi.org/10.1007/s11934-001-0035-7.
25. Kimura M., Nagao K. Role of varicocele repair for male infertility in the era of assisted reproductive technologies. Reprod Med Biol. 2014; 13: 185-92. DOI: https://www.doi.org/10.1007/s12522-014-0181-5
26. Fang Y., Su Y., Xu J., Hu Z., Zhao K., Liu C., Zhang H. Varico-cele-Mediated Male Infertility: From the Perspective of Testicular Immunity and Inflammation. Front Immunol. 2021; 31; 12: 729539. DOI: https:// www.doi.org/10.3389/fimmu.2021.729539.
27. Santoro M.G. Heat shock factors and the control of the stress response. Biochem Pharmacol. 2000; 59 (1): 55-63. DOI: https://www.doi. org/10.1016/s0006-2952(99)00299-3
28. Li W., Wu Z.Q.,Zhao J., Guo S.J., Li Z., Feng X., Ma L., Zhang J.S., Liu X.P., Zhang Y.Q. Transient protection from heatstress induced apop-totic stimulation by metastasis associated protein 1 in pachytene spermato-cytes. PLoS One. 2011; 6 (10): e26013. DOI: https://www.doi.org/10.1371/ journal.pone.0026013
29. Hassanpour H., Bigham Sadegh A., Karimi I., Heidari Khoei H., Karimi A., Edalati Shaarbaf P., Karimi Shayan T. Comparative Expression Analysis of HSP70, HSP90, IL-4, TNF, KITLG and KIT-receptor Gene between Varicocele-Induced and Non-Varicocele Testes of Dog. Int J Fertil Steril. 2017; 11 (3): 148-55. DOI: https://www.doi.org/10.22074/ ijfs.2017.5020. PMID: 28868836. PMCID: PMC5582142.
30. Ferlin A., Speltra E., Patassini C., Pati M.A., Garolla A., Caret-ta N., Foresta C. Heat shock protein and heat shock factor expression in sperm: relation to oligozoospermia and varicocele. J Urol. 2010; 183 (3): 1248-52. DOI: https://www.doi.org/10.1016/jjuro.2009.11.009.
31. Fujita Y., Mihara T., Okazaki T., Shitanaka M., Kushino R., Ike-da C., Negishi H., Liu Z., Richards J.S., Shimada M. Toll-like receptors (TLR) 2 and 4 on human sperm recognize bacterial endotoxins and mediate apoptosis. Hum Reprod. 2011; 26 (10): 2799-806. DOI: https://www.doi. org/10.1093/humrep/der234. PMID: 21775336. PMCID: PMC3174031.
32. Zeinali M., Hadian Amree A., Khorramdelazad H., Karami H., Abedinzadeh M. Inflammatory and anti-inflammatory cytokines in the seminal plasma of infertile men suffering from varicocele. Androlo-gia. 2017; 49 (6). DOI: https://www.doi.org/10.1111/and.12685. PMID: 27709650.
33. Huleihel, M., Lunenfeld, E., Horowitz, S., Levy, A., Potashnik, G., & Glezerman, M. Production of interleukin-1-like molecules by human sperm cells. Fertility and Sterility. 2000; 73 (6): 1132-7. DOI: https://www. doi.org/10.1016/s0015-0282(00)00499-4
34. Perdichizzi A., Nicoletti F., La Vignera S., Barone N., D'Agata R., Vicari E., Calogero A.E. Effects of Tumour Necrosis Factor-a on Human Sperm Motility and Apoptosis. Journal of Clinical Immunology. 2007; 27 (2): 152-62. DOI: https://www.doi.org/10.1007/s10875-007-9071-5
35. Bian J., Guo X., Xiong C., Li J., Tian Y., Ma H., Zhang Y., Nie Y., Yu L., Xiao L. Experimental study of the effect of rhTNF-alpha on human sperm mitochondrial function and motility in vitro. Zhonghua Nan Ke Xue. 2004; 10 (6): 415-9. PMID: 15267202.
36. Kocak I., Yenisey C., Dundar M., Okyay P., Serter M. Relationship between seminal plasma interleukin-6 and tumor necrosis factor alpha levels with semen parameters in fertile and infertile men. Urol Res. 2002; 30: 263-7. DOI: https://www.doi.org/10.1007/s00240-002-0269-y
■ References
1. Hedger M.P. Immunology of the Testis and Male Reproductive Tract. Comprehensive Toxicology. 2010; 189-230. DOI: https://www.doi. org/10.1016/B978-0-08-046884-6.01112-X
2. Khasanova E.M., Gankovskaya L.V., Grechenko V.V., Svitich O.A. Relevance of the p-defensin family in reduction of male reproductive function. Immunologiya. 2021; 42 (5): 470-9. DOI: https://doi. org/10.33029/0206-4952-2021-42-5-470-479 (in Russian)
3. Lebedev G.S., Golubev N.A., Shaderkin I.A., Shaderkina V.A., Apolikhin O.I., Sivkov A.V., Komarova V.A. Male infertility in the Russian Federation: statistical data for 2000-2018. Experimental and clinical urology. 2019; 4: 4-12. DOI: https://doi.org/10.29188/2222-8543-2019-11-4-4-12 (in Russian)
4. Agarwal A., Mulgund A., Hamada A., Chyatte M. A unique view on male infertility around the globe. Reproductive Biology and Endocrinology. 2015; (13): 37. DOI: https://doi.org/10.1186/s12958-015-0032-1
5. Gamidov S.I., Iremashvili V.V., Tkhagapsoeva R.A. Male infertility: current state of the problem. Farmateka. 2009; 9: 12-7. (in Russian)
6. Fang Y., Su Y., Xu J., et al. Varicocele-Mediated Male Infertility: From the Perspective of Testicular Immunity and Inflammation. Front Immunol. 2021; 12: 729539. DOI: https://doi.org/10.3389/fim-mu.2021.729539
7. Masson P., Brannigan R.E. The varicocele. Urol Clin North Am. 2014; 41 (1): 129-44. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ucl.2013.08.001. PMID: 24286772.
8. Chan C.-C., Sun G.-H., Shui H.-A., Wu G.-J. Differential Spermato-zoal Protein Expression Profiles in Men With Varicocele Compared to Control Subjects: Upregulation of Heat Shock Proteins 70 and 90 in Varicocele. Urology. 2013; 81 (6): 1379.e1-8. DOI: https://doi.org/10.1016/10.1016/j. urology.2013.01.031
9. Kovalchuk L.V., Gankovskaya L.V., Meshkova R.Ya. Clinical immunology and allergology with the basics of general immunology. Moscow : GEOTAR-Media, 2014. ISBN: 978-5-9704-1974-8 (in Russian)
10. Gankovskaya L.V., Ponasenko O.A., Svitich O.A. Role of heat shock protein 70 in pathogenesis of cardiovascular pathology, Medical Immunology. Meditsinskaya Immunologiya. 2019; 21 (2): 201-8. DOI: https://doi.org/10.15789/1563-0625-2019-2-201-208 (in Russian)
11. Mayer M.P., Bukau B. Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism. Cell Mol Life Sci. 2005; 62 (6): 670-84. DOI: https://doi.org/10.1007/s00018-004-4464-6.
12. Baker M.A., Aitken R.J. Proteomic insights into spermatozoa: critiques, comments and concerns. Expert Rev Proteomics. 2009; 6: 691705. DOI: https://doi.org/10.1586/epr.09.76
13. Martinez-Heredia J., Estanyol J.M., Ballesca J.L., Oliva R. Proteomic identification of human sperm proteins. Proteomics. 2006; 6: 4365-9. DOI: https://doi.org/10.1002/pmic.200600094
14. Oliva R., Martinez-Heredia J., de Mateo S., et al. Proteomics of human spermatozoa, protamine content and assisted reproduction outcome. Soc Reprod Fertil Suppl. 2007; 65: 527-30. PMID: 17644990.
15. Naaby-Hansen S., Herr J.C. Heat shock proteins on the human sperm surface. J Reprod Immunol. 2010; 84 (1): 32-40. DOI: https://doi. org/10.1016/j.jri.2009.09.006.
16. Saeidi S., Shapouri F., Amirchaghmaghi E., Hoseinifar H., Sabbaghian M., Sadighi Gilani M.A., Pacey A.A., Aflatoonian R. Sperm protection in the male reproductive tract by Toll-like receptors. Andrologia. 2014; 46 (7): 784-90. DOI: https://doi.org/10.1111/and.12149.
17. Kawai T., Akira S. TLR signaling. Semin Immunol. 2007; 19 (1): 24-32. DOI: https://doi.org/10.1016/j.smim.2006.12.004.
18. Xingxing Z., Dongyan S., Xiaoqian L., Weijuan G., Fengjiao W., Xuejiang G., Hui X., Lixin L., Hong Z. TLR signalling affects sperm mitochondrial function and motility via phosphatidylinositol 3-kinase and glycogen synthase kinase-3а. Cellular Signalling. 2016; 28 (3): 148-56. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cellsig.2015.12.002
19. World Health Organization. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. 5th ed. Moscow: Capital-Print, 2012. 292 p. ISBN: 978-5-905106-09-05.
20. Rebrikov D.V, Samatov G.A., Trofimov D.Yu., Semenov P.A., Savilova A.M., Kofiadi I.A., Abramov D.D. PCR v realnom vremeni. Moscow: BINOM. Knowledge laboratory, 2009: 215 p. ISBN: 978-500101-085-2. (in Russian)
21. Bio-Rad: Bio-Plex Pro Human Cytokine Assays. Instr. Manual. 23 p.
22. Hassanin A.M., Ahmed H.H., Kaddah A.N. A global view of the pathophysiology of varicocele. Andrology. 2018; 6 (5): 654-61. DOI: https://doi.org/10.1111/andr.12511. PMID: 29978951.
23. Pastuszak A.W., Wang R. Varicocele and testicular function. Asian J Androl. 2015; 17 (4): 659-67. DOI: https://doi.org/10.4103/1008-682X.153539. PMID: 25926610. PMCID: PMC4492060.
Сведения об авторах
Хасанова Елена Минсалимовна - аспирант, ассистент каф. иммунологии МБФ ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: joimolino@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-6735-4693
Ганковская Людмила Викторовна - д-р мед. наук, проф., проф. каф. иммунологии МБФ ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, Москва, Российская Федерация
E-mail: lvgan@yandex.ru https://orcid.org/0000-0003-1271-3078
Греченко Вячеслав Владимирович - канд. мед. наук, доцент каф. иммунологии МБФ ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пиро-гова Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: v.grechenko@gmail.com https://orcid.org/0000-0003-2582-3372
24. Schoor R.A., Elhanbly S.M., Niederberger C. The pathophysiology of varicocele-associated male infertility. Curr Urol Rep. 2001; 2 (6): 4326. DOI: https://doi.org/10.1007/s11934-001-0035-7.
25. Kimura M., Nagao K. Role of varicocele repair for male infertility in the era of assisted reproductive technologies. Reprod Med Biol. 2014; 13: 185-92. DOI: https://doi.org/10.1007/s12522-014-0181-5
26. Fang Y., Su Y., Xu J., Hu Z., Zhao K., Liu C., Zhang H. Varicocele-Mediated Male Infertility: From the Perspective of Testicular Immunity and Inflammation. Front Immunol. 2021; 31; 12: 729539. DOI: https://doi. org/10.3389/fimmu.2021.729539.
27. Santoro M.G. Heat shock factors and the control of the stress response. Biochem Pharmacol. 2000; 59 (1): 55-63. DOI: https://doi. org/10.1016/s0006-2952(99)00299-3
28. Li W., Wu Z.Q., Zhao J., Guo S.J., Li Z., Feng X., Ma L., Zhang J.S., Liu X.P., Zhang Y.Q. Transient protection from heatstress induced apoptotic stimulation by metastasis associated protein 1 in pachytene spermatocytes. PLoS One. 2011; 6 (10): e26013. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0026013
29. Hassanpour H., Bigham Sadegh A., Karimi I., Heidari Khoei H., Karimi A., Edalati Shaarbaf P., Karimi Shayan T. Comparative Expression Analysis of HSP70, HSP90, IL-4, TNF, KITLG and KIT-receptor Gene between Varicocele-Induced and Non-Varicocele Testes of Dog. Int J Fertil Steril. 2017; 11 (3): 148-55. DOI: https://doi.org/10.22074/ijfs.2017.5020. PMID: 28868836. PMCID: PMC5582142.
30. Ferlin A., Speltra E., Patassini C., Pati M.A., Garolla A., Caret-ta N., Foresta C. Heat shock protein and heat shock factor expression in sperm: relation to oligozoospermia and varicocele. J Urol. 2010; 183 (3): 1248-52. DOI: https://doi.org/10.1016/jjuro.2009.11.009.
31. Fujita Y., Mihara T., Okazaki T., Shitanaka M., Kushino R., Ike-da C., Negishi H., Liu Z., Richards J.S., Shimada M. Toll-like receptors (TLR) 2 and 4 on human sperm recognize bacterial endotoxins and mediate apoptosis. Hum Reprod. 2011; 26 (10): 2799-806. DOI: https://doi. org/10.1093/humrep/der234. PMID: 21775336. PMCID: PMC3174031.
32. Zeinali M., Hadian Amree A., Khorramdelazad H., Karami H., Abedinzadeh M. Inflammatory and anti-inflammatory cytokines in the seminal plasma of infertile men suffering from varicocele. Andrologia. 2017; 49 (6). DOI: https://doi.org/10.1111/and.12685. PMID: 27709650.
33. Huleihel M., Lunenfeld E., Horowitz S., Levy A., Potashnik G., Glezerman M. Production of interleukin-1-like molecules by human sperm cells. Fertility and Sterility. 2000; 73 (6): 1132-7. DOI: https://doi. org/10.1016/s0015-0282(00)00499-4
34. Perdichizzi A., Nicoletti F., La Vignera S., Barone N., D'Agata R., Vicari E., Calogero A. Effects of Tumour Necrosis Factor-a on Human Sperm Motility and Apoptosis. Journal of Clinical Immunology. 2007; 27 (2): 152-62. DOI: https://doi.org/10.1007/s10875-007-9071-5
35. Bian J., Guo X., Xiong C., Li J., Tian Y., Ma H., Zhang Y., Nie Y., Yu L., Xiao L. Experimental study of the effect of rhTNF-alpha on human sperm mitochondrial function and motility in vitro. Zhonghua Nan Ke Xue. 2004; 10 (6): 415-9. PMID: 15267202.
36. Kocak I., Yenisey C., Dundar M., Okyay P., Serter M. Relationship between seminal plasma interleukin-6 and tumor necrosis factor alpha levels with semen parameters in fertile and infertile men. Urol Res. 2002; 30: 263-7. DOI: https://doi.org/10.1007/s00240-002-0269-y
Authors' information
Elena M. Khasanova - Post Graduate Student, Assistant of the Immunology Chair, MBF, N.I. Pirogov RNRMU, MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: joimolino@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-6735-4693
Lyudmila V. Gankovskaya - MD, PhD, Prof., Prof. of the Immunology Chair, MBF, N.I. Pirogov RNRMU, MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: lvgan@yandex.ru https://orcid.org/0000-0003-1271-3078
Vyacheslav V. Grechenko - PhD, Associate Prof. of the Immunology Chair, MBF, N.I. Pirogov RNRMU, MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: v.grechenko@gmail.com https://orcid.org/0000-0003-2582-3372
