CC BY
43
УДК 57.043.612.111.612.014.465
НЕКОТОРЫЕ ОСОБЕННОСТИ СОХРАННОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА ПРИ ИЗМЕНЕНИИ ТЕМПЕРАТУРНОГО И ОСМОТИЧЕСКОГО ФАКТОРОВ
СРЕДЫ
Н.В. Прокопенко, доцент, к.б.н., ХНАДУ
Аннотация. Проанализированы особенности гипертонического криогемолиза эритроцитов человека при модификации мембраны производными барбитуровой кислоты (барбиталом, фенобарбиталом) илидокаином.
Ключевые слова: эритроцит, гипертонический криогемолиз, барбитал, фенобарбитал.
ДЕЯК1 ОСОБЛИВОСТ1 ЗБЕРЕЖЕННЯ ЕРИТРОЦИТ1В ЛЮДИНИ ЗА ЗМ1НИ ТЕМПЕРАТУРНОГО Й ОСМОТИЧНОГО ФАКТОР1В СЕРЕДОВИЩА
Н.В. Прокопенко, доцент, к.б.н., ХНАДУ
Анотаця. Проанал1зовано особливост1 гтертотчного кр1огемолизу еритроцит1в людини при модифтацп мембрани пох1дними барб1туровог кислоти (барбталом, фенобарбталом) та лг-докатом.
Ключовi слова: еритроцит, гтертотчний кр1огемолиз, барб1тал, фенобарб1тал.
SOME PECULIARITIES OF HUMAN ERYTHROCYTES PRESERVATION AT TEMPERATURE AND OSMOTIC FACTORS OF MEDIUM CHANGE
N. Prokopenko, Associate Professor, Candidate of Biological Sciences, KhNAHU
Abstract. The peculiarities of hypertonic cryohemolysis of human erythrocytes at membrane modification by barbituric acid compounds, lidocaine are analyzed.
Key words: erythrocyte, hypertonic cryohemolysis, barbital, phenobarbital
Введение
В настоящее время автотранспорт является одной из важнейших составляющих транспортной инфраструктуры мегаполисов. Однако увеличение количества автомобилей, грузо- и пассажироперевозок, развитие транспортной системы приводит к увеличению количества дорожно-транспорных происшествий. Так, согласно статистическим данным, в Украине в 2008 погибло около 167 человек на 1 миллион жителей, в России -235 погибших на 1 млн жителей. Ежегодно в результате ДТП получают травмы различной степени тяжести значительное количество
людей, что делает проблему снижения травматизма одной из наиболее важных медико-социальных задач любого государства.
Анализ публикаций
В структуре видов телесных повреждений у несмертельно раненых преобладают ушибы мягких тканей - 35,1±1,2 %, ссадины и кровоподтеки - 19,1±1,03 %, переломы различной локализации - 20,5±1,6 % и раны мягких тканей - 20,2±1,6 %. Лечение таких повреждений часто связано с оперативным вмешательством и необходимостью переливания крови [1]. Поэтому большую проблему пред-
ставляет нехватка донорской крови и необходимость создания банков компонентов крови и плазмы. При этом далеко не всегда удается вовремя найти для переливания кровь нужной группы, особенно в тех случаях, когда она относится к числу редких. На современном этапе доказано, что переливание даже тщательно совмещенной донорской крови сопровождается иммунологическими реакциями, что приводит к угнетению иммунной системы, аллергическим реакциям.
Также никто не может дать 100 % гарантии в том, что в донорской крови полностью отсутствуют возбудители инфекционных заболеваний. Кроме того, в последние годы выявилась недостаточная полнота обследования донорской крови на присутствие возбудителей вирусного гепатита (С, Б, Е), вирусов иммунодефицита человека (ВИЧ) и других заболеваний, которые могут передаваться при переливании крови и ее компонентов.
Во всем мире широко применяется обеспечение нуждающихся донорской и собственной кровью при помощи предварительного замораживания и резервирования в Банках крови. Только Банк крови позволяет длительно (в течение нескольких лет) хранить компоненты крови: плазму, эритроциты, тромбоциты, лейкоциты и даже стволовые клетки. Помимо больших сроков хранения (плазма хранится до 5 лет при темп. - 80 °С, эритроцитарная масса - до 5 лет при температуре хранения минус 80 °С), при использовании размороженных и отмытых клеток крови максимально снижается вероятность передачи с кровью вирусов гемоконтактных инфекций [2].
Развитие методов низкотемпературного хранения биологического материала требует исследования механизмов воздействия изменения температур и осмолярности среды на структурно-функциональную целостность клеток и поиск путей снижения негативного воздействия.
Повреждение эритроцитов человека после предварительной инкубации в гипертоническом растворе при постоянной температуре и последующим охлаждении до температуры ниже 13 °С, но выше температуры образования кристаллов льда, называется гипертоническим криогемолизом [3]. Этот процесс изучают давно, однако до сих пор полностью
не объяснены механизмы чувствительности эритроцитов к воздействию неблагоприятных факторов, защиты от повреждений. Установлено, что основную роль в поддержании жизнеспособности эритроцитов играет плазматическая мембрана. Изменение температуры и осмолярности среды инкубации влияет на физические характеристики мембраны в целом и различные ее компоненты (конформационные состояния белков, фос-фолипидов), в результате нарушаются взаимодействия компонентов мембраны, «цито-скелет-мембрана», а также изменяются соотношение объем-площадь поверхности [4], значит и биологические функции мембраны, в частности, транспортной и барьерной [5].
Цель и постановка задачи
Цель работы - изучение особенностей чувствительности эритроцитов к гипертоническому криогемолизу и постгипертоническому лизису при внесении в среду инкубации соединений, модифицирующих мембрану (бар-битала, фенобарбитала).
Анализ изменений уровня гипертонического криогемолиза при внесении в среду инкубации соединений, модифицирующих мембрану эритроцитов
Особенности изменения уровня гипертонического гемолиза эритроцитов при внесении барбитуратов в среду инкубации
Важную роль в повреждении клеток при воздействии изменений температуры и осмо-лярности среды играют осмотическая дегидратация эритроцитов и нарушение взаимодействия цитоскелета с мембраной клеток [35]. Степень нарушений взаимодействий различна - это могут быть локальные нарушения, которые при отсутствии значительных изменений температуры и осмолярности могут не проявиться существенным образом, и генерализованные нарушения, которые при значительных изменениях параметров среды инкубации могут привести к лизису эритроцитов.
Изменения температуры также могут вызвать нарушения цитоскелет-мембранного комплекса. Фосфолипиды, входящие в состав мембраны эритроцитов, имеют различные температуры фазовых переходов, поэтому
при изменении температуры среды инкубации в мембранах образуются области с фос-фолипидами, находящимися в состоянии жидкого кристалла, состоянии геля и переходные области. Такое разделение фосфоли-пидов способствует нестабильности мембраны.
При изменении температуры и осмолярности среды инкубации не все эритроциты подвергаются лизису. Степень повреждения клеток определяется исходным состоянием эритроцитов до изменения параметров среды инкубации, воздействиями, которым подверглись клетки перед изменениями параметров, скоростью и диапазоном изменений, влиянием химических соединений на различных этапах изменения температурного и осмотического параметра. Часть эритроцитов может адаптироваться к изменившимся условиям среды инкубации, а часть гемолизирует.
Измерения были проведены в средах, содержащих 0,86 Моль/л сахарозы, 0,86 Моль/л сахарозы +0,12 Моль/л Na2S04, 0,86 Моль/л сахарозы +0,15 Моль/л NaCl. На рис. 1 представлены данные о зависимости уровня гипертонического криогемолиза от концентрации барбитала, фенобарбитала и лидокаина при инкубации эритроцитов в гипертонической сахарозной среде (рис. 1, а) либо в сахарозной среде с добавлением электролитов (рис. 1, б, в).
Степень чувствительности клеток к охлаждению и гипертонии зависит от состава среды инкубации, наличия или отсутствия электролитов в среде инкубации, т.е. от ее ионной силы.
При внесении в среду производных барбитуровой кислоты и лидокаина наблюдается изменение уровня гипертонического криогемо-лиза. Как следует из представленных на рисунке 1 данных, для использованных в работе соединений характерно уменьшение степени гемолиза при внесении в концентрациях 2,5-12,5 мМоль/л для барбитала (рис. 1, кривые 2) и фенобарбитала (рис. 1, кривые 1) и 0,25-12,5 мМоль/л для лидокаина (рис. 1, кривые 3). Наблюдается различие в характере изменения уровня криогемолиза при внесении в среду барбитуратов и лидокаина, но общая направленность влияния веществ на криогемолиз не изменяется при внесении в среду электролитов. При внесении барбитуратов наблюдается уменьшение уровня гемолиза с увеличением концентрации фенобарбитала в среде. В наибольшей степени защитное действие выражено для фенобарбитала - в концентрации 12,3 мМоль/л он понижает уровень гемолиза примерно в 3 раза по сравнению со значениями, наблюдаемыми при отсутствии фенобарбитала в средах, содержащих сахарозу (рис. 1, а, кривая 1) и сочетание сахарозы и сульфата (Р<0,05) (рис. 1, в, кривая 1), в 1,5 раза в среде, содержащей сахарозу и хлорид (Р<0,05) (рис. 1, в, кривая 1). Защитная эффективность барбитала значительно ниже, чем у фенобарбитала. Барбитал снижает уровень гипертонического криогемолиза в 1,4 раза в сахарозной среде и среде, содержащей сахарозу и сульфат (Р<0,05) (рис. 1, а, 1 в, кривые 2), но практически не изменяет уровень гемолиза в среде, содержащей 0,15 Моль/л №С1 (рис. 1, б, кривая 2).
2 3 4 i 6 7 8 9 10 II 12 13 Концентрация икона. мМоль/л
I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 II 12 13 Концентрация вещества, мМоль/л
9 I 2 3 4 5 6 7 S 9 10 II 12 13 Коцен-фацня вешестеа, мМоль/л
Рис. 1 Степень гипертонического криогемолиза эритроцитов при различных концентрациях лидокаина, барбитала и фенобарбитала в среде инкубации: а - 0,86 Моль/л сахарозы; б) 0,86 Моль/л сахарозы + 0,15 Моль/л №С1; в - 0,86 Моль/л сахарозы + 0,12 Моль/л №2804; 1 - фенобарбитал; 2 - барбитал; 3 - лидокаин
При гипертоническом криогемолизе повреждение эритроцитов определяется фазовым разделением липидов мембраны и формированием дефектов липидного бислоя на границе этих фаз. Устойчивость формировавшегося дефекта увеличивается, если он стабилизируется периферическими белками цитоскелета. Согласно литературным данным, важной зоной инициации дефектов является микроокружение интегральных белков мембраны (в частности белка полосы 3).
Стабилизация мембраны эритроцитов в условиях криогемолиза может быть связана со взаимодействием химических агентов с ли-пидной фазой и созданием условий для уменьшения нарушений упаковки липидов на границе доменов, находящихся в различном фазовом состоянии, стабилизацией липидно-го микроокружения интегральных белков, откреплением периферических белков от ли-пидов мембраны.
Зависимость уровня криогемолиза от концентрации барбитуратов в среде свидетельствует о количественных параметрах встраивания веществ в мембрану. Согласно литературным данным, барбитал, фенобарбитал взаимодействуют с фосфолипидами мембраны эритроцитов. Так, они взаимодействуют с фосфолипидами аннулярных областей белка полосы 3 - переносчика анионов. Перевод этих фосфолипидов в состояние жидкого металла, вероятно, оказывает влияние на транспорт анионов, что может обусловить устойчивость эритроцитов к гипертоническому криогемолизу при внесении барбитала, фенобарбитала, лидокаина в среду инкубации.
Изменения объема клеток вследствие потери внутриклеточной воды приводят к концентрированию цитоплазматического содержимого [4], перераспределению ионов между клеткой и внеклеточной средой, изменению рН цитоплазмы и т.д. Концентрирование ци-топлазматических белков приводит к значительным изменениям их функций, что может быть объяснено с помощью теории макромо-лекулярного кроудинга. При обезвоживании в эритроцитах происходит также изменение активности К/С1 симпорта и Ка+/Н+ обмена. В то же время однонаправленный транспорт ионов К+ и СГ, Ка+-К+-2С1" котранспорт и №/Н+ обмен выступают как факторы регуляции клеточного объема при изменении ос-
мотических параметров среды. Постепенное защелачивание цитоплазмы приводит к активации СГ/НСО"3 -обмена [5].
Повреждение клеток, помещенных в гипертоническую среду, связано с выходом внутриклеточной воды через мембрану [6]. В результате потери внутриклеточных электролитов (С1 и К) и дегидратации эритроцитов происходит нарушение белковых взаимодействий, в частности взаимодействия белков цитоскелета и трансмембранного белка полосы 3. В случае нарушения выхода аниона С1 барбиталом, фенобарбиталом, лидокаином происходит удержание некоторой части воды, выход которой обусловлен выходом электролита.
Блокирование выхода внутриклеточного аниона С1 и К препятствует росту внутриклеточного рН. Оптимальный уровень взаимодействия цитоплазматического домена белка полосы 3 и анкирина наблюдается при значении рН около 7,2, повышение внутриклеточного рН приводит к нарушению взаимодействия белков цитоскелета и белка полосы 3. Так, повышение рН до 9,2 приводит к полной потере способности анкирина связываться с белком полосы 3. Сохранение физиологического или близкого к нему значения внутриклеточного рН позволяет сохранить нормальный уровень взаимодействия указанных белков [8].
В гипертонических условиях изменяется также взаимодействие между компонентами мембраны и цитоскелета. В частности, концентрирование цитоплазматического содержимого приводит к нарушениям взаимодействия между белком полосы 4.1 и мембраны. Олигомеризация спектрина в условиях дегидратации приводит к повышению устойчивости цитоскелета к механическому сдвигу, и при этом в условиях сжатия клеток может происходить открепление цитоскелета от мембраны [8]. Таким образом, могут формироваться зоны потенциальной нестабильности. Взаимодействие между мембраной и ци-тоскелетом также зависит от характера распределения липидов в плоскости мембраны, плотности упаковки и фазового состояния липидов. Дегидратация и изменения температуры среды способны привести к изменениям во взаимодействии белков и липи-дов и возрастанию нестабильности цитоске-лет-мембранного комплекса [9].
Барбитураты и лидокаин оказывают защитное действие, взаимодействуя с мембраной эритроцитов. Встраиваясь в липидную фазу барбитал, фенобарбитал и лидокаин повышают текучесть мембраны и увеличивают внутримембранное давление, что способствует более быстрой репарации мембранных дефектов и препятствует увеличению трансмембранных пор до критического размера. Кроме того, барбитураты и лидокаин оказывают существенное влияние на транспорт ионов через мембрану [10], что, в свою очередь, влияет на объемные изменения клеток.
Защитное действие анестетиков при переносе эритроцитов в гипертонические среды связано с влиянием анестетиков как на состояние липидов, так и на состояние белков. Известно, что увеличение площади мембраны при включении в нее анестетиков примерно в 10 раз больше, чем площадь, занимаемая анестетиками при их включении в мембрану. Подобная особенность связана с влиянием анестетиков на белки, что приводит к изменению их пространственной структуры, в результате чего меняется и площадь мембраны [10].
Выводы
Низкотемпературная консервация крови является достаточно эффективным способом ее хранения, позволяющим сохранять структурно-функциональные качества форменных элементов.
Степень повреждения эритроцитов, вызванная изменениями температуры и осмолярно-сти среды, зависит от состава среды, исходного состояния клеток, а также от модификации мембраны химическими агентами.
Производные барбитуровой кислоты (барбитал, фенобарбитал) существенным образом повышают устойчивость эритроцитов к изменениям температуры и осмолярности среды, что позволяет говорить о возможности их использования для повышения сохранности клеток в условиях низкотемпературного хранения.
Литература
1. Кулеша Н. В. Медико-социальная и экспертная оценка дорожно-транспортного травматизма в современных условиях.
(на примере Амурской области) : автореферат дис. ... канд. мед. наук: 14.00.33 / Кулеша Наталья Васильевна; ГОУ ВПО «Дальневосточный государственный медицинский университет». - Хабаровск, 2006. - 19 с.
2. http://www.bloodbank.ru
3. Гордиенко Е. А. Биофизическая модель
явления гипертонического криогемолиза / Е. А. Гордиенко, С. Е. Коваленко // Проблемы криобиологии. - 1996. - № 4.
- С. 24-32.
4. Белоус А. М. Единый механизм поврежде-
ния клетки при термальном шоке, замораживании и постгипертоническом лизисе / А. М. Белоус, В. А. Бондаренко, Л. А. Бабийчук // Криобиология. - 1985.
- № 3. - С. 25-32.
5. Бондаренко В. А. Эффекты дегидратации в
контроле холодовой и осмотической чувствительности клеток / В. А. Бонда-ренко, Т. П. Бондаренко, С. В. Руденко // Проблемы криобиологии. - 1992. - № 4.
- С. 14-25.
6. Glaser R., Donath J. Stationary ionic states in
human red blood cells / R. Glaser, J. Donath // Bioelectrochem. Bioenerg. - 1984.
- Vol. 13. - P. 71-83.
7. Wessels J. M. C., Veekamp J. H. Some as-
pects of the osmotic lysis of erythrocytes. Differenses in osmotic behaviour of erythrocytes after treatment with electrolyte and non-electrolyte solution / J. M. C. Wessels, J. H. Veekamp // Biochim. Biophys. Acta.
- 1973. - Vol. 291. - P. 178-189.
8. Гордиенко Е. А. О механизме осмотиче-
ского лизиса клеток / Е. А. Гордиенко, О. И. Гордиенко // Криобиология. -1986. - №2. - С. 23-25.
9. Minetti M., Ceccarini M., Stasi A. Role of
membrane thermotropic propeties on hypotonic hemolysis and hypertonic cryohemolysis of human red blood cells / M. Minetti, M. Ceccarini, A. Stasi // J. Cell Biochem. -1984. - Vol. 25. - P. 61-72.
10. Seeman Ph. The membrane action of anes-
thetics and tranquilizers / Ph. Seeman // Pharmacological Review. - 1972. - Vol. 24,
- № 4. - Р. 583-660.
Рецензент: В.А. Юрченко, профессор, д.т.н., ХНАДУ.
Статья поступила в редакцию 10 ноября 2009 г.
