CC BY
74
УДК 57.086.13:612.118
СОХРАНЕНИЕ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ЦЕЛОСТНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА В СРЕДАХ РАЗЛИЧНОЙ ТОНИЧНОСТИ Н.В. Прокопенко, доцент, к.б.н., ХНАДУ
Аннотация. Проанализированы особенности изменения уровня гипертонического гемолиза эритроцитов человека при модификации цитоскелет-мембранного комплекса. Показано существенное повышение устойчивости эритроцитов при обработке производными барбитуровой кислоты (барбиталом, фенобарбиталом).
Ключевые слова: гипертонический гемолиз, эритроцит, цитоскелет-мембранный комплекс, дегидратация, барбитал, фенобарбитал.
ЗБЕРЕЖЕННЯ СТРУКТУРНО-ФУНКЦІОНАЛЬНОЇ ЦІЛІСНОСТІ ЕРИТРОЦИТІВ ЛЮДИНИ В СЕРЕДОВИЩАХ РІЗНОЇ ТОНІЧНОСТІ Н.В. Прокопенко, доцент, к.б.н., ХНАДУ
Анотація. Проаналізовано особливості зміни рівня гіпертонічного гемолізу еритроцитів людини під час модифікації цитоскелет-мембранного комплексу. Показано суттєве збільшення стійкості еритроцитів після обробки похідними барбітурової кислоти (барбіталом, фенобарбіталом).
Ключові слова: гіпертонічний гемоліз, еритроцит, цитоскелет-мембранний комплекс, дегідратація, барбітал, фенобарбітал.
PRESERVATION OF STRUCTURAL-FUNCTIONAL INTEGRITY OF HUMAN’S ERYTHROCYTES IN DIFFERENT TONICITY MEDIA N. Prokopenko, Associate Professor, Candidate of Biological Science, KhNAHU
Abstract. The peculiarities of human's erythrocytes hypertonic haemolysis level change at modification of cytoskeleton-membrane complex are analyzed. A considerable increase of erythrocytes stability at their treatment by the derivatives of barbituric acid (barbital, phenobarbital) is shown.
Key words: hypertonic haemolysis, erythrocyte, cytoskeleton-membrane complex, dehydration, barbital, phenobarbital.
Введение
В настоящее время одним из перспективных методов долговременного хранения биологических объектов является низкотемпературное хранение. Одним из возможных направлений использования данного метода в отношении крови является создание банков собственной крови. В некотором смысле создание такого банка является видом биологического страхования жизни. Потребность в хранении собственной крови связана со сле-
дующим: в критических случаях, требую-
щих переливания крови, возникает серьезный риск, связанный с несовместимостью или зараженностью переливаемых компонентов, далеко не всегда удается вовремя найти для переливания кровь нужной группы, особенно в тех случаях, когда она относится к числу редких.
Банк собственной крови может оказаться жизненно необходим следующим категориям людей:
- тем, кто имеет риски наследственных и приобретенных болезней крови, кардиологических и онкологических заболеваний;
- тем, чья профессиональная деятельность тесно связана с постоянным риском для жизни;
- тем, у кого редкая группа крови;
- тем, кто готовится к обширной операции, при которой возможна большая кровопотеря, например, к протезированию тазобедренного сустава;
- тем, кто занимается травмоопасным спортом;
- тем, кто не хочет переливать донорскую кровь по религиозным убеждениям или каким-то другим соображениям.
Анализ публикаций
Низкотемпературное хранение является перспективным методом долговременного хранения биологических объектов, однако сопровождается зачастую экстремальным воздействием высококонцентрированных растворов, что может сопровождаться разрушением объектов. Гипертонический гемолиз эритроцитов (гипертонический шок) представляет собой разрушение клеток при их переносе в гипертонический раствор (3,04,0 Моль/л №С1) из растворов с физиологической тоничностью (0,15 Моль/л №С1) [1]. При температуре выше 0 °С устойчивость эритроцитов к переносу в гипертоническую среду зависит от их исходного состояния, параметров гипертонической среды (осмо-лярность, температура, рН) и амплитуды изменения осмолярности среды при переходе в новые осмотические условия.
Существует два подхода к повышению сохранности эритроцитов во время перемен осмотических и температурных условий среды. Первый подход связан с модификацией состояния цитоскелет-мембранного комплекса на этапах, предшествующих гипертоническому влияния. Известно, что предыдущее частичное обезвоживание клеток существенно повышает их устойчивость к дальнейшему переносу в высококонцентрированные солевые среды. В основе указанного защитного эффекта лежат процессы, связанные, в первую очередь, с увеличением концентрации белков в объеме внутриклеточного растворителя при обезвоживании клеток. При определенных условиях увеличение числа структурных связей белков цитоскелета с мембраной и между собой становится фактором, стабилизирующим плазматической мембраной.
Согласно другому подходу некоторые химические соединения эффективно влияют на процесс развития гемолиза непосредственно в момент действия гипертонического стресса
[2, 4].
Цель и постановка задачи
Целью работы является проведение анализа развития гипертонического гемолиза эритроцитов человека при переносе в среду 4,0 Моль/л №С1 при температурах 0 °С и 37 °С в условиях различной обработки клеток.
Влияние барбитуратов, лидокаина на уровень гипертонического гемолиза эритроцитов
В ходе инкубации эритроцитов в гипертонической среде обезвоживание клеток приводит к изменению объема и формы клеток, что, в свою очередь, вызывает изменение пространственной структуры цитоскелета и ассоциации его компонентов с мембраной. Нарушение взаимодействия белков с мембраной способно привести к частичному откреплению цитоскелета от мембраны и формированию потенциально нестабильных участков. Другой фактор нестабильности мембраны - это фазовое разделение липидов, развивающееся при охлаждении клеток. В этом случае формируются дефектные зоны в пограничных участках, разделяющих липидные домены, находящиеся в жидкокристаллическом состоянии и состоянии геля. Эти участки можно рассматривать как области мембраны, в которых происходит зарождение и стабилизация пор, проницаемых для ионов, что является дополнительным фактором сенсибилизации клеток к последующим изменениям условий среды. Механизм повреждений клеток, развивающихся при изменении температуры и осмолярности среды, остается во многом невыясненным. Это касается, прежде всего, изменений, развивающихся на начальных стадиях гипертонической инкубации клеток, а также изменений температурной и осмотической чувствительности при действии на клетки модификаторов мембраны и цитоскелета [1].
В табл. 1 представлены данные о зависимости уровня гемолиза эритроцитов при их переносе в 4,0 Моль/л КаС1 из 0,15 Моль/л КаС1 при 0 °С и 37 °С от концентрации фенобарбитала, барбитала и лидокаина.
Таблица 1 Уровень гемолиза эритроцитов человека
Вещество Концентрация, Ммоль/л Уровень гемолиза при переносе при 0 °С (%) Уровень гемолиза при переносе при 37 °С (%)
Фено- барбитал 0 80±4,8 68±3,3
0,5 62±3,1 56±2,73
1 55±2,75 50±2,65
2 30±2,48 42±2,32
5 15±0,75 35±2,5
12,5 7±0,49 28±1,21
Барбитал 0 80±4,2 68±3,1
0,5 68±3,4 65±2,8
1 62±3,1 60±3,0
2 43±2,35 56±2,71
5 28±1,2 55±2,75
12,5 22±1,15 47±2,34
Лидокаин 0 80±4,7 68±3,1
0,5 62±3,0 60±3,11
1 55±2,7 55±2,8
2 33±2,5 52±2,65
5 24±1,2 47±2,31
12,5 15±0,75 36±2,52
Видно, что гемолиз эритроцитов происходит как при 37 °С, так и при 0 °С. Включение в гипертоническую среду фенобарбитала, бар-битала, лидокаина уменьшает степень гемолиза клеток по мере увеличения концентрации анестетиков. При этом выраженное влияние на антигемолитическое действие анестетиков оказывает температура. При одинаковых концентрациях анестетики более эффективно снижают уровень гемолиза при 37 °С и менее эффективное - при 0 °С. Как при 37, так и при 0 °С, наибольшее ингибирующее действие на развитие гипертонического гемолиза оказывает фенобарбитал и наименьшее - барбитал.
Наблюдаемые различия в характере действия анестетиков на гипертонический гемолиз можно объяснить с учетом таких параметров, как коэффициент распределения вещества в мембране, молекулярный объем вещества и объем, занимаемый веществом при его максимальном включении в мембрану. Согласно [5] в исследуемом ряду веществ наиболее высокие значения указанных параметров характерны для фенобарбитала, более низкие -для барбитала. Это означает, что фенобарбитал при его включении в мембрану значительнее увеличивает латеральное давление в ней, что, в свою очередь, снижает вероятность формирования гемолитической поры [3]. Более высокий уровень гемолиза при 0 °С можно объяснить преимущественным включением анестетиков в участки мембра-
ны в жидкокристаллическом состоянии, а не в состоянии геля, что способно увеличить их локальную концентрацию в этих участках до гемолитического уровня [3].
При температуре 37 °С в процессе формирования поры преобладают силы, способствующие увеличению ее размеров до величины, позволяющей выход гемоглобина и, одновременно, при этой же температуре высокая текучесть липидов способствует замыканию поры. При 0 °С для формирования поры, соразмеримой по размерам с молекулой гемоглобина, требуется большая энергия, однако уже сформированная пора является более стабильной. Эти различия определяют неодинаковый характер влияния барбитуратов и лидокаина на уровень гипертонического гемолиза эритроцитов при 37 °С и 0 °С.
Защитное действие анестетиков, наблюдаемое при развитии гипертонического гемолиза эритроцитов, является в значительной мере неспецифическим и отражает их высокую способность включаться в мембрану. В то же время анестетики способны оказывать специфическое и избирательное действие на ферменты и транспортные системы клеток. В частности барбитураты (барбитал и фенобарбитал) обладают способностью ингибировать Ка-К-АТФазу, в то время как местные анестетики (лидокаин) являются активаторами Ка-К-АТФазы [5].
Анестетики могут оказывать влияние как на процессы инициации и формирования, так и на процессы замыкания мембранной поры. Максимальная устойчивость эритроцитов к изменению осмолярности среды проявляется при 0 °С, когда формируется стабильное состояние клеток при их частичной дегидратации в средах, содержащих 0,45-0,6 Моль/л КаС1 и 0,3-0,6 Моль/л сахарозы. При этом барбитураты и лидокаин способствуют формированию стабильного состояния эритроцитов.
Изменения объема клеток вследствие потери внутриклеточной воды приводят к концентрированию цитоплазматического содержимого [2], перераспределению ионов между клеткой и внеклеточной средой, изменению рН цитоплазмы [1] и т.д. Концентрирование цитоплазматических белков приводит к значительным изменениям их функций, что может быть объяснено с помощью теории мак-ромолекулярного кроудинга [2]. При обезвоживании в эритроцитах происходит также изменение активности К/С1 симпорта и Ка+/Н+ обмена. В то же время однонаправленный транспорт ионов К+ и С1", Ка-К+-2С1" котранспорт и Ка/Н+ обмен выступают как факторы регуляции клеточного объема при изменении осмотических параметров среды. Постепенное защелачивание цитоплазмы приводит к активации С1"/НСО"з-обмена [2].
В гипертонических условиях изменяется также взаимодействие между компонентами мембраны и цитоскелета. В частности, концентрирование цитоплазматического содержимого приводит к нарушениям взаимодействия между белком полосы 4.1 и мембраны. Олигомеризация спектрина в условиях дегидратации приводит к повышению устойчивости цитоскелета к механическому сдвигу, и при этом, в условиях сжатия клеток, может происходить открепление цитоскелета от мембраны [4]. Таким образом, могут формироваться зоны потенциальной нестабильности.
Барбитураты и лидокаин оказывают защитное действие, взаимодействуя с мембраной эритроцитов. Встраиваясь в липидную фазу, барбитал, фенобарбитал и лидокаин повышают текучесть мембраны и увеличивают внутримембранное давление, что способст-
вует более быстрой репарации мембранных дефектов и препятствует увеличению трансмембранных пор до критического размера [5]. Кроме того, барбитураты и лидокаин оказывают существенное влияние на транспорт ионов через мембрану [1], что, в свою очередь, влияет на объемные изменения клеток.
Выводы
Уровень сохранности эритроцитов человека в гипертонических условиях зависит как от состояния клеточной мембраны, так и от транспорта веществ через нее. Следовательно, изменяя эти параметры, можно существенно повысить сохранность клеток.
Литература
1. Белоус А.М. Единый механизм поврежде-
ния клетки при термальном шоке, замораживании и постгипертоническом лизисе / А.М. Белоус, В.А. Бондаренко, Л.А. Бабийчук, Т.П. Бондаренко и др. // Криобиология. - 1985. - №3. - С. 25-32.
2. Бондаренко В.А. Эффекты дегидратации в
контроле холодовой и осмотической чувствительности клеток / В. А. Бондаренко, Т.П. Бондаренко, С.В. Руденко // Проблемы криобиологии. - 1992. - №4. -С. 14-25.
3. Cantor R. The lateral pressure profile in mem-
branes: a physical mechanism of general anesthesia / R. Cantor // Biochem. - 1997.
- Vol. 36. - P. 2339-2344.
4. Minetti M. Role of membrane thermotropic
properties on hypotonic hemolysis and hypertonic cryohemolysis of human red blood cells / M. Minetti, M. Ceccarini, AV. Di Stasi // J. Cell Biochem. - 1984. - Vol. 25. -P. 61-72.
5. Seeman Ph. The membrane action of anes-
thetics and tranquilizers / Ph. Seeman // Pharmacological Reviews. - 1972. -
Vol. 24, № 4. - P. 583-660.
Рецензент В.А. Юрченко, профессор, д.т.н., ХНАДУ.
Статья поступила в редакцию 22 октября 2010 г.
