CC BY
15
УДК 615.366.15+615.28
НЕКОТОРЫЕ МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ АУТОГЕМОХИМИОТЕРАПИИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ НА ЖИВОТНЫХ
© 2005 г. Ю.С. Сидоренко, Ю.Н. Бордюшков, Е.М. Франциянц, Л.А.Орловская, Н.В. Солдаткина, Е.М. Непомнящая, А.А. Сорокин, Н.К. Гуськова
Binding of a chemotherapeutic agent with erythrocytes during incubation with blood results in its accumulation in the organs of reticulo-endothelial system, deposition in spleen with subsequent gradual withdrawal and prolonged maintenance of agent concentration in blood channel and in tumor. Administration of a chemotherapeutic agent on autblood allows to reduce myelotoxicity.
Несмотря на значительные успехи, достигнутые в области лекарственного лечения злокачественных опухолей, поиск путей повышения эффективности и снижения токсичности химиотерапии продолжает оставаться актуальным [1 -3].
В Ростовском НИИ онкологии разработан и с успехом применяется для лечения злокачественных новообразований различных локализаций ряд оригинальных методик химиотерапии с использованием естественных сред организма в качестве растворителя химиопрепаратов: ауто-лимфа, аутоплазма, аутокровь. Эти методики отличаются высоким противоопухолевым эффектом и низким токсическим воздействием на организм [4-6]. Метод аутогемохимиотерапии, предложенный Ю.С. Сидоренко в 1982 г. и основанный на введении химиопрепаратов на ау-токрови больных, прочно вошел в клиническую практику и доказал свою состоятельность [6-8], однако механизмы его действия не вполне изучены.
В эксперименте на белых беспородных крысах изучали распределение алкилированных производных циклофосфана в органах и тканях животных и морфологические изменения в них в условиях аутогемохимиотерапии и внутривенной химиотерапии.
Эксперименты выполнены в зимне-весенний период на 54 белых беспородных крысах самцах массой 150 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария. В работе использован перевиваемый опухолевый штамм - саркома-45, рост которой вызывали введением под кожу спины суспензии опухолевых клеток (разведение 1:1, объем 0,3 мл). Воздействие начинали при достижении опухоли размеров не менее 0,8 см3. Группы животных для морфологического исследования состояли из 6 крыс. Проведение аутогемохимиотерапии (АГХТ) осуществляли путем реинфузии гепаринизированной крови (1,0 мл), преинкубированной в термостате 45 мин при 37 °С с циклофосфаном в дозе 100 мг/кг, в яремную вену животных.
Внутривенную химиотерапию (ВХТ) осуществляли путем введения в яремную вену цикло-фосфана в дозе 100 мг/кг, растворенного в физиологическом растворе. Распределение цикло-фосфана в органах и тканях животных оценива-
ли по содержанию в них алкилированных производных циклофосфана методом спектрофото-метрии [9].
Контрольной группой являлись животные, не получавшие химиопрепаратов.
Выделение из цельной крови чистых популяций лимфоцитов, нейтрофилов осуществляли в градиенте плотности фиколл-верографин или фиколл-урографин с последующим микроскопическим контролем. Изменения во внутренних органах животных при экспериментальной химиотерапии оценивали по результатам микроскопии срезов селезенки, тимуса, изготовленных по общепринятой методике. Особенности миелопоэза оценивали по результатам микроскопии мазков костного мозга. Крыс умерщвляли методом декапитации. Статистическая обработка результатов исследования проводилась с использованием критерия Стьюдента [10].
Результаты исследования распределения циклофосфана в органах и тканях животных показали, что уже через 1 час после внутривенного введения циклофосфана животным его производные в крови не определяются (табл.1).
Наиболее высокие их концентрации обнаружены в легких и печени (46,9 и 45,8 % соответственно), меньше - в селезенке (7,3 %). Через 1 ч после введения животным циклофосфана, преинкубированного с аутокровью (табл. 1), наиболее высокие концентрации его производных обнаружены в селезенке (43,4 %) и эритроцитах (30,2 %). Меньшая их концентрация обнаружена в печени (17 %) и костном мозге (9,4 %). То есть при внутривенном введении цикло-фосфана его производные быстро исчезают из крови и столь же быстро накапливаются в органах, являющихся депо крови.
Введение циклофосфана на аутокрови увеличивает время циркуляции в общем кровотоке эритроцитов, несущих алкилированные производные циклофосфана. Через 3 суток после внутривенного введения циклофосфана его ал-килированные производные в органах и тканях животных не обнаружены (табл. 1). В отличие от этого через 3 суток после введения цикло-фосфана на аутокрови концентрация его алки-лированных производных в органах и тканях крыс хотя и уменьшалась, но оставалась относительно высокой (39,2 % - в печени, 27 % - в
селезенке, 6,8 % - в циркулирующих эритроцитах) (табл. 1). В эти же сроки производные цик-лофосфана обнаружены в невысокой концен-
трации в тимусе (7,4 %) и в относительно высокой концентрации в опухоли (19,6 %).
Таблица 1
Содержание алкилированных производных циклофосфана в органах и тканях крыс (у.е./гр.ткани) через 1 час и 3 суток после однократного введения 100 мг/кг препарата
Объект исследования Срок исследования после введения препарата
1 час 3 суток
АГХТ, n = 6 ВХТ, n = 6 АГХТ, n = 6 ВХТ, n = 6
Селезенка 23±2,5 3,5±0,4* 5,5±0,6 0*
Печень 9±0,8 22±1,9* 8±0,7 0*
Костный мозг 5±0,3 0* 0 0
Саркома-45 0 0 4±0,3 0*
Легкое 0 22,5±2,1* 0 0
Тимус 0 0 1,5±0,1 0*
Плазма 0 0 0 0
Эритроциты 16±1,0 у.е./мл 0* 1,4±0,1 у.е./мл 0*
Лимфоциты 0 0 0 0
Нейтрофилы 0 0 0 0
Примечание. * - различия между группами достоверны (Р<0,01).
Таким образом, при введении циклофосфана на аутокрови значительно увеличивается время его циркуляции в кровеносном русле с эритроцитами, в органах ретикулоэндотелиальной системы и в опухоли. В связи с тем, что при инкубации с кровью циклофосфан преимущественно связывается с эритроцитами [4], условно распределение циклофосфана при АГХТ можно считать распределением связанного с эритроцитами химиопрепарата.
Исходя из этого, приходим к выводу, что связывание циклофосфана с эритроцитами приводит к их депонированию в селезенке с последующим постепенным выходом и длительным поддержанием концентрации химиопрепарата в кровеносном русле и в опухоли. Увеличение объема и деформация эритроцитов, связавших химиопрепарат [12], отражается на их способности к циркуляции [11, 12] и приводит к задержке и в других органах ретикулоэндотели-альной системы (печени, тимусе, костном мозге).
Изучение показателей микроскопической картины костного мозга животных на 3 сутки
после внутривенного введения циклофосфана выявило наличие выраженных повреждений ге-мопоэтической ткани (табл. 2). Так, пунктаты костного мозга бедны клеточными элементами. На фоне жировых капель, элементов стромы и остеобластов разрозненно и небольшими группами расположены костномозговые элементы, находящиеся большей частью в состоянии некробиоза, аномальные фигуры митоза и значительно реже - оставшиеся неизмененными эо-зинофильные и нейтрофильные миелоциты, ядерные формы эритрокариоцитов.
Количество ретикулярных клеток составляет 54,3 %о от общего числа миелокариоцитов. Обращали внимание изолированно лежащие крупных размеров (до 20-25 мк) моноцитоидные клетки, характеризующиеся неправильной формой ядра и базофильной цитоплазмой, лишенной первоначальной азурофильной зернистости, т.е. без признаков дифференцировки. Описанные атипические моноциты являются, по-видимому, освободившимися из синцитиальных связей ретикулярными клетками.
Таблица 2
Клеточный состав костного мозга животных при различных методах химиотерапии, %о
Вид клеток Исследуемая группа
АГХТ (n = 6) ВХТ (n = 6) Контроль (n = 6)
Ретикулярные клетки 68,5±4,7 *п 54,1±3,6 * 2,6±0,2
Миелобласты 0,8±0,09 *п 1,5±0,17 * 3,8±0,4
Промиелоциты 1,5±0,13 * 1,7±0,2 * 4,1±0,3
Миелоциты 2,1±0,20 * 2,9±0,30 * 6,8±0,5
Метамиелоциты 3,0±0,26 * 3,9±0,36 * 11,2±0,5
Палочкоядерные 3,1±0,28 * 2,9±0,28 * 10,8±0,6
Сегментоядерные 5,0±0,46 * 4,3±0,45 * 16,3±1,3
Эозинофилы 0,7±0,05 *п 10,2±0,98 * 7,0±0,8
Базофилы 0,1±0,02 *п 0,8±0,07 * 0,5±0,1
Лимфоциты 3,7±0,36 *п 5,8±0,52 * 10,7±1,1
Моноциты 0,2±0,01 *п 0,8±0,07 1,1±0,2
Плазматические клет. 0,2±0,03 *п 1,1±0,16 1,5±0,2
Эритроидный росток 11,2±1,20 * 10,0±1,10 * 22,86±1,9
Базофильные нормоциты 0,8±0,09 * 0,6±0,08 * 1,0±0,1
Полихроматофильные нормоциты 6,0±0,06 * 5,8±0,61 * 10,96±0,69
Оксифильные нормоциты 4,4±0,05 *□ 3,6±0,05 * 10,9±1,1
Лейкоэритробластический индекс 1,8:1 2,57:1 3:1
Индекс созревания нейтрофилов 0,81 1,18 0,82
Примечание. * - различия с группой контроля достоверны (Р<0,01); □ - различия между группами АГХТ и ВХТ достоверны (Р<0,01).
Индекс созревания нейтрофилов при внутривенной химиотерапии (1,18) больше такового в контрольной группе (0,82), что свидетельствует о задержке созревания гранулоцитов в костном мозге и, следовательно, малоэффективном гемопоэзе. Значение лейкоэритробластического индекса (2,57:1), близкое к контролю (3:1), обусловлено эозинофиль-ной реакцией и значительным сужением эритроидно-го ростка кроветворения.
Характерной особенностью гемопоэтической ткани при АГХТ той же дозой циклофосфана является островковая гиперплазия костного мозга на фоне гипопластичных участков. Как и при ВХТ отмечались признаки угнетения процессов пролиферации и дифференцировки миелоидного и эритроидного ростков кроветворения (табл. 2). Имели место дегенеративные формы и разрушенные клетки. Однако общее число миелокариоцитов после АГХТ превышало их содержание после ВХТ. Заметно больше и количество ретикулярных клеток (68,5 %о), среди которых обращали внимание крупные субгигантские нейтро-филы, палочкоядерные формы. Обнаруженные (как и при ВХТ) крупные ретикулярной природы моноци-тоидные клетки при АГХТ характеризовались наличием в цитоплазме азурофильной грануляции и увеличением числа митотических фигур, что свидетельствует об их дифференцировке в крупные промиело-циты и далее - в нейтрофильные метамиелоциты.
Дифференцировка ретикулярных клеток в направлении эритроидных элементов, отмеченная у большинства экспериментальных животных после АГХТ, подтверждалась наличием эритрокариоцитов, сохранивших заостренность цитоплазмы, свойственную ретикулярным клеткам. Индекс созревания ней-трофилов при АГХТ (0,81) не отличается от такового у животных контрольной группы (0,82).
Лейкоэритробластический индекс (1,8:1) свидетельствует об умеренной аплазии костного мозга на 3-и сутки после АГХТ. После АГХТ имели место ранние признаки регенерации гемопоэза: восстановление миелопоэза происходило за счет размножения и дифференцировки моноцитоидных (ретикулярной природы) клеток.
Морфологическое исследование селезенки проводили в связи с тем, что она является одним из центральных органов в системе иммуногенеза, где осуществляются межклеточные кооперации и сложная интеграция иммунокомпетентных клеток при клеточном и гуморальном иммунитете.
На 3-и сутки после внутривенного введения 100 мг/кг циклофосфана в селезенке были обнаружены изменения, свидетельствующие об угнетении лим-фоидной ткани органа химиопрепаратом: уменьшение размеров и количества лимфоидных фолликулов,
числа лимфоидных элементов в них, отсутствие в них делящихся клеток и герминативного центра фолликулов (рис. 1).
Рис. 1. Селезенка крыс после ВХТ. Гипоплазия белой пульпы. Гиперплазия ретикулоэндотелиальных элементов красной пульпы. Окраска гематоксилином и эозином. х 160
На 3-и сутки после введения той же дозы цикло-фосфана на аутокрови в селезенке крыс обнаружены изменения, говорящие о возможном повышении функциональной активности Т-зависимых зон лим-фоидной ткани на фоне угнетения В-зависимых зон. Имелось увеличение в размерах периартериальной, мантийной и краевой зоны фолликулов с выраженной плазматизацией, гиперплазия ретикулярных и миелоидных элементов в красной пульпе и фолликулах, отсутствие герминативного центра фолликулов (рис. 2).
Морфологические изменения тимуса животных, которым циклофосфан вводили на аутокрови, выражались в интенсивной пролиферации малых лимфоцитов с увеличением количества плазматических клеток, гиперплазии ретикулярных элементов (рис. 4). Эти процессы свидетельствуют, по-видимому, о некотором повышении функциональной активности органа в сравнении с внутривенным введением цик-лофосфана.
Рис. 2. Селезенка крыс после АГХТ. Гиперплазия белой пульпы, ретикулярных и миелоидных элементов красной пульпы. Окраска гематоксилином и эозином. х 160
При морфологическом исследовании тимуса крыс, получавших ВХТ той же дозой циклофосфана, обнаружили уменьшение количества лимфоцитов в корковом и мозговом слое, замещение лимфоидной ткани коркового вещества жировой клетчаткой, т.е. отмечено угнетение лимфоидной ткани органа хими-опрепаратом (рис. 3).
Рис.3. Тимус крыс после ВХТ. Гиперплазия ретику-лоэпителиальных клеток мозгового и коркового слоя.Окраска гематоксилином и эозином. х 160
Рис.4. Тимус крыс после АГХТ. Увеличение количества лимфоцитов, плазмоцитов и ретикулоцитов. Окраска гематоксилином и эозином. х 160
Таким образом, на 3-и сутки после ВХТ, когда циклофосфан уже полностью выведен из организма, наблюдается депрессия гемопоэза с умеренной аплазией костного мозга на фоне выраженного аллергического компонента, морфологические изменения селезенки и тимуса могут свидетельствовать об угнетении В- и Т-зависимых зон лимфоидной ткани этих органов химиопрепаратом.
В те же сроки после АГХТ в органах и циркулирующих в общем кровотоке эритроцитах наблюдается достаточно высокая концентрация производных циклофосфана. При этом на фоне умеренной аплазии костного мозга обнаруживается его очаговая гиперплазия с начальными признаками физиологической регенерации за счет ретикулярных клеток. Морфологические изменения селезенки и тимуса указывают на некоторое повышении функциональной активности Т-зависимых зон лимфоидной ткани.
Таким образом, результате проведенных исследований установлено, что связывание химиопрепара-та преимущественно с эритроцитами во время инкубации с кровью приводит к накоплению их в органах ретикулоэндотелиальной системы, депонированию в селезенке с последующим постепенным выходом и длительным поддержанием концентрации химиопре-парата в кровеносном русле и в опухоли. Связанный с клетками крови химиопрепарат обладает меньшим повреждающим и некоторым стимулирующим влия-
нием на органы кроветворения и иммунологической защиты.
Литература
1. Гершанович М.Л. и др. // Проблемы современной онкологии. Ростов н/Д, 1995. Т. 2. С. 306-308.
2. Поддубная И.В. // Рус. мед. журн.. 1998. Т. 6. № 10. С. 621-627.
3. Чиссов В.И. // Рос. онкол. журн. 1999. № 4. С.50-54.
4. Владимирова Л.Ю. Неоадъювантная химиотерапия на естественных средах организма с применением пептида эпифиза эпиталамина в комплексном лечении местно-распространенного рака молочной железы: Дис. ... канд. мед. наук. Ростов н/Д, 2000.
5. Сидоренко Ю.С. и др. // Тез. докл. II съезда онкологов стран СНГ. Киев, 2000. С. 1061.
6. Сидоренко Ю.С. и др. // Материалы V Все-рос. съезда онкологов. Ростов н/Д, 2000. Т.2. С. 153-156.
7. Малейко М.Л. Аутогемохимиотерапия распространенных форм рака желудка: Дис. ... канд. мед. наук. Ростов н/Д, 1998.
8. Орловская Л.А. и др. // Тез. докл. II съезда онкол. стран СНГ. Киев, 2000. С. 628.
9. Hans J.C.F. Nolls, Subhash C. Alry, J.E.Slushelmer. // Anal. Chem. 1982. Vol. 54. Р. 213-216.
10. Урбах В.Ю. Статистический анализ в биологических и медицинских исследованиях. М., 1975.
11. Скороход А.А. и др. // Вопр. онкол. 1999. Т. 45. № 4. С. 374-379.
12. Генинг Т.П., Колкер И.И., Жумадилов Ж.Ш. // Антибиотики и химиотерапия. 1988. Т. 33. № 11. С. 867-871.
Ростовский научно-исследовательский онкологический институт
20 декабря 2004 г.
