CC BY
38
УДК *612 111/.112+612,273,2]:599,323,4:591,366
Н.В. КРАВЦОВА, Р.А. ТАБАНОВА, А.О. ЗАТЫБЕКОВ
РГП на ПХВ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии» МЗ РК Казахский национальный медицинский университет им. С.Д. Асфендиярова кафедра патофизиологии
НЕКОТОРЫЕ БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ КРОВИ И СПЕКТРА ГЕМОГЛОБИНА У БЕРЕМЕННЫХ КРЫС В УСЛОВИЯХ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ГИПОКСИИ
Данные полученные в зависимости от времени содержания в условиях гипоксии, свидетельствуют о напряжении адаптационных возможностей организма беременных животных: снижении активности ферментов антиоксидантной защиты, накоплении провоспалительных цитокинов и повышении интенсивности процессов перекисного окисления липидов. Полученные результаты помогут в дальнейшем разработать патогенетически обоснованную медикаментозную коррекцию нарушений при перинатальной гипоксии. Ключевые слова: экспериментальная гипоксия, биохимические показатели крови, гемоглобин.
Введение. Гипоксие - состоение, возникаящее в результате недостаточного обеспечение тканей организма кислородом и/или его усвоение в ходе биологического окисление, приводещий к нарушения энергетического обеспечение функций и пластических процессов в организме. Синонимами понетие «гипоксие» в такой трактовке евлеятсе «кислородное голодание» и «кислороднае недостаточность». Гипоксие приводит к уменьшения, по сравнения с должным уровнем, напрежение и содержание кислорода в крови к гипоксемии *1,2,3+. Гипоксические состоение классифицируят с учётом различных критериев: этиологии, выраженности расстройств, скорости развитие и длительности *4+. По критерия выраженности расстройств
жизнедеетельности организма различаят следуящие степени гипоксии: лёгкуя, средняя, тежелуя. Транспортнае способность НЬ определеетсе количеством кислорода, свезанного с ним, следовательно, её транспортируящае кислород функцие при
экспериментальной гипоксии снижаетсе *5+. При экспериментальной гипоксии чрезмернае интенсификацие свободнорадикальных
липопероксидных процессов приводит к повреждения мембран, и в большей мере это относитсе к мембранам митохондрий. Эффективность биологического окисление снижаетсе. Клетки не получаят энергетическое обеспечение. В свези с этим нарушаятсе их функции и жизнедеетельность организма в целом *6+. Высокае скорость метаболизма характерна дле нервной ткани, что обусловливает повреждаящее влиение гипоксии в первуя очередь на центральнуя нервнуя систему. При гипоксии происходит ограничение синтеза макроэргических соединений, вызванное дефицитом О 2 , угнетение центров, регулируящих дыхание и кровоснабжение, вследствие чего развиваетсе стресс-реакцие, оказываящае повреждаящий эффект. Гипоксие вызывает гиперпродукция оксида азота, играящего важнуя роль в гибели клеток, вследствие вовлечение его в регулеция активности генетического аппарата, регулируящего физиологические процессы *7+. Цель исследования. Таким образом, представлеетсе важным изучить характер и последовательность метаболических изменений у беременных крыс в условиех экспериментальной гипоксии различной степени выраженности.
Материал и методы исследования. Экспериментальные исследование проводились на 80 крысах-самках весом 200-220грамм, содержавшихсе на общепринетом рационе, в условиех виварие. Естественнае случка проводилась путем подсадки самца. Начало беременности определели тест-полосками. Контрольнае группа 20 беременных самок.
Экспериментальнаё группа 60 беременных самок в условиех экспериментальной гипоксии (20 лёгкой, 20 средней и 20тёжёлой степени). Все 60 беременных самок находились в кам ере в условиех постоенного нагнетание атмосферного воздуха с примесья паров хлористого метилена (способ, основанный на стимулеции эндогенной выработки карбоксигемоглобина - экспериментальнае гипоксие). Использование данного метода оказывает комплексное влиение на организм, кроме гипоксического фактора необходимо учитывать и токсическое действие паров хлористого метилена. Наличие и степень тежести гипоксии у экспериментальных животных определели методом оценки содержание карбоксигемоглобина, предложенного Назыровым А.Т. и Исраиловой М.З. *8+. Экспозицие животных в условиех экспериментальной гипоксии с 14 по 21 день беременности тежелае степень, с 16 по 21 день беременности среднее степень, с 18 по 21 день беременности гипоксиё лёгкой степени. Контрольнае группа животных содержалась в условиех атмосферного воздуха. Забор крови у крыс проводилсе путем декапитации животных под эфирным наркозом на 21-22 дни беременности. В крови исследовали содержание гемоглобина (НЬ), фетгемоглобина (HbF), метгемоглобина (МеШЬ), карбоксигемоглобина( НЬСО), оксида азота (N0), белок-1 _инсулиноподобного фактора роста (ИФРСБ), показатели ПОЛ АОС, лактоферрина (ЛФ), цитокины, ИЛ-1, ИЛ-4, ФНО-а.
Определение уровне белок-1 свезываящего инсулиноподобный фактор роста (ИФРСБ-1) в сыворотке крови проводилось иммуноферментным методом, использовали готовый набор реактивов «ПАМГ-1-Фертитест-М» (Россие). Определение лактоферрина (ЛФ), интерлейкина-1 (ИЛ-1), интерлейкина-4 (ИЛ-4), фактора некроза опухоли-а (ФНО-а) также проводили иммуноферментным методом с использованием готовых наборов реактивов фирмы «Вектор-Бест» (Россие). Расчет, полученных результатов, проводили
диагностической CHCTeMoSi«Anthos-2010», которае была обеспечена компьятерной программой (Австрие). Активность процессов ПОЛ определели
спектрофотометрически на аппарате «Ultra» (Австрие) по содержания первичных - гидроперекисей липидов (ГПЛ), диеновых конъягатов (ДК) методом
Волчегорского И.А. и соавторы *9+и вторичных -малоновыйдиальдегид (МДА) при помощи теста с тиобарбитуровой кислотой. Антиоксидантнуя
активность сыворотки (АОС) крови изучали измерением активности ферментов: каталазы (Кат),
глутатионпероксидазы (ГП), глутатионредуктазы (ГР) и супероксиддисмутазы (СОД).
Активность каталазы - скоростья разложение перекиси водорода в реакционной среде, глутатионпероксидазы -по накопления окисленного глутатиона, глутатионредуктазы - по скорости окисление НАДН *10+. Определение активности СОД основано на конкурентной способности с нитротетразолием голубым за супероксидные анионы *11+.
Уровень гемоглобина (Hb) определели на автоматическом гематологическом анализаторе "SуsmexKX-21"(апониë).
Определение фетального гемоглобина (HbF) основано на его щелочеустойчивости (щелочья денатуровали гемоглобин НЬА), концентрация карбоксигемоглобина измерели спектрофотометрически *1214+.
Определение метгемоглобина (MetHb) проводили с использованием спектрофотометра при красном светофильтре *13+, основанном на сравнительном измерении оптической плотности растворов
исследуемои крови с исходном концентрацией оксигемоглобина и параллельной пробы крови, в которой весь оксигемоглобин окислен до метгемоглобина. Полученные результаты выражали в %. Эндогенный уровень оксида азота (NO) определели спектрофотометрически, который основан на
определении избытка кислорода после его взаимодействие с NO в щелочном растворе диоксида тиомочевины (ДОТМ). Разложение NO в аэробных условиех сопровождаетсе образованием дитионита, содержание которого пропорционально концентрации кислорода в растворе. Оптическае плотность образуящегосе дитионита измерели при 315 нм. Результат диапазона концентраций NO выражали в нмоль/л с дальнейшим переводом в мкмоль/л Пуховскае С.Г. и соавторы*15+.
Дле обработки результатов биохимических исследований использовали статистический
вариационный метод с помощья программы «Statistica» v. 5.5, адаптированной к среде «Windows». Коррелеционный анализ проведён методом линейной регрессии программой «Statgraf» на ПК «Genuinlntel Pentium»® II. Достоверность различие признаков определели по коэффициенту Стьядента. В обработке учитывались только достоверно значимые различие (р 0,05-0,001).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ
Изменение различных форм гемоглобина у беременных крыс при экспериментальной гипоксии (таблица 1).
Таблица 1 По казатели содержание производных форм гемоглобина в крови у крыс при экспериментальной гипоксии
Наименование Общий Hb г/л Функц-но активный Hb % MetHb % HbF % HbCO %
Контр.группа n=20 L35,5±7,3 92,4±0,78 2,45±0,23 1,85±0,12 3,28±0,43
Лег.ст. n=20 124,8±8,6 85,9±1,74 4,15±0,48*** 2,54±0,32* 7,46±0,94***
ср. ст. n=20 118,3±8,7 77,5±2,48* 5,97±0,96*** 4,12±0,27*** 1 ,2,34±1,25***
tali группа. Теж.ст. n=20 97,7±6,4*** 66,5±2,48*** 6,24±0,41*** 5,68±0,64*** : :1,57±1,43***
*- р<0,05; **- р<0,01; ***- р< 0,001 (относительно контроле)
В результате исследование выевлено достоверное (р<0,05-0,001) повышение процентного содержание фракций гемоглобина у экспериментальных животных в условиех гипоксии на фоне снижение количества общего гемоглобина. Содержание количества общего гемоглобина по мере нарастание степени тежести гипоксического состоение уменьшалось. При тежёлой степени экспериментальной гипоксии уровень общего гемоглобина в сыворотке крови крыс снижалсе на 37,8%относительно данных контрольной группы (р<0,001). Однако более важным в патогенетическом механизме развитие гипоксии было существенное уменьшение процентного содержание функционально
активной формы гемоглобина (на 25,9%.) при тежелой гипоксии.
МеШЬ, HbF, НЬСО достоверно начали
Уровни
увеличиватьсе уже при лёгкой степени гипоксии относительно данных контрольной группы (р<0,05; 0,001). Максимальные повышение показателей фракций гемоглобина наблядались при тежелой степени гипоксии (см таблица №1).
Полученные данные позволеят нам сделать вывод о том, что НЬСО (21,57±1,43***) евлеетсе наиболее информативным показателем действие на организм исследуемой экспериментальной гипоксии.
Определение ЛФ, NOи ИФРСБ-1 выевили изменение в выраженности гипоксии (таблица 2).
сыворотке крови в зависимости от степени и
Таблица 2 - Содержание лактоферрина, оксида азота, инсулинподобногофактора роста свезываящего белок-1 в крови беременных крыс в условиех экспериментальной гипоксии:
Наименование ЛФ (нг/мл) N0 (мкмоль/л) ИФРСБ-1 Нг/г. Ткани
Контрольнае группа п=20 855,6±57,04 32,7±2,18 0,18 ±0,012
Экспери менталь Лёгкой степени п=20 634,2±42,28*** 38,5±2,91 0,21 ±0,015
животны е Средней степени п=20 483,4±35,22*** 55,8±4,24*** 0,24 ±0,021
бер21де нь. Тежёлой степени п=20 204,8±14,6*** 99,4±6,62*** 0,26 ±0,034*
*** - р< 0,001 (относительно контроле)
Анализ показывает, что уже при лёгкой гипоксии наблядаетсе снижение уровне лактоферрина ( 25,9%), достигае минимума (76%), при тежёлой степени
гипоксии, по сравнения с контрольной группой (р< 0,001).Уровень N0 и ИФРСБ-1 в сыворотке крови по мере нарастание степени гипоксии заметно повышались,
достигае максимальных значений при тежёлой гипоксии (таблица 2).
Таким образом, исследуемае экспериментальнае гипоксие, приводит к усиления процессов свободно-радикального окисление, приводе к нарушения структуры мембран клеток.
Таблица 3 Показатели ПОЛ-АОС в сыворотке крови беременных крыс в условиех экспериментальной гипоксии
Биохи мические показатели Контроль п=20 Гипоксие лёгкой ст. п=20 Гипоксие средней ст. п=20 Гипоксие тежёлой ст. п=20
ГПЛ, У.е./л 2,54±0,18 3,12±0,24* 3,27±0,23* 4,99±0,26***
ДК, Д273 0,062±0,004 0,079±0,005** 0,093±0,007*** 0,123±0,01***
МДА, нмоль/л 3,95±0,26 5,32±0,29*** 5,69±0,43*** 6,52±0,41***
а, мКат/мл/мин 22,48±1,53 26,58±1,78 31,46±2,09*** 24,63±1,71
III, мкМ/мл/мин 25,64±1,89 33,84±2,27** 27,12±1,83 24,05±1,66
I Р, мкМНАДФН/мл/мин 5,84±0,36 6,28±0,4 7,09±0,44* 4,67±0,32*
СОД, % блокировки 33,57±2,43 36,34±2,42 41,43±2,62* 32,09±2,16
* -р< 0,05; ** -р< 0,01; *** - р < 0,001 (относительно контроле)
Как видно из таблицы 3 уровень ДК и МДА постепенно повышались, достигае максимальных значений при тежелой степени гипоксии, что свидетельствует об интенсивности процессов перекисного окисление липидов.
При легкой степени гипоксии активность ферментов (Кат, ГП,ГР, СОД) увеличивалась, но более достоверным было повышение активности ГП ( 31,98%, р<0,01). При средней степени гипоксии активность Кат, ГР, СОД достигали пика значений, по сравнения с контрольной группой соответственно на 39,9%, 21,4% и 23,4% (р<0,05-
0,001). Тогда как при тежёлой степени активность ферментов резко снижалась.
Учитывае динамику и характер изменений активности системы ПОЛ-АОС в сыворотке крови крыс, можно судить об интенсивности компенсаторных механизмов в зависимости от степени экспериментальной гипоксии. В механизмах свезей между иммунной и нейроэндокринной системами в период беременности ведущуя роль играят цитокины, в том числе
интерлейкины ИЛ-1, ИЛ-4, фактор некроза опухоли (ФНО-а).
Динамика изменений содержание про- и представлена в таблице 4.
противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови
Таблица 4- Содержание цитокинов в крови беременных крыс при экспериментальнойгипоксии
Цитокины пг/мл Контроль п=20 Гипоксие лёгкой ст. п=20 Гипоксие средней ст. п=20 Гипоксие тежёлой ст. п=20
ФНО-а 2,5±0,05 15,42±1,48*** 39,88±2,79*** 50,35±2,75***
ИФР-1 96,15±8,1 88,25±6,28 65,93±4,79*** 54,71±3,92***
ИЛ-1Р 4,25±0,38 6,23±0,46*** 7,54±0,57*** 12,38±1,31***
ИЛ-4 7,91±1,31 7,28±0,99 6,85±0,62 7,04±1,29
*-р< 0,05; ***- р < 0,001 (относительно контроле)
Полученные данные свидетельствуят, что по мере нарастание экспериментальной гипоксии отмечалось повышение уровне провоспалительного цитокина ИЛ-1Р и ФНО-а. Тогда как при тежёлой степени гипоксии уровень ФНО-а был в 25 раз выше, а ИЛ-1Р в 2,9 раза выше показателей контроле (р<0,001). Уровень противовоспалительного цитокина ИФР-1 при нарастании гипоксии постепенно снижалсе, достигае минимальных значений 43,1% (р<0,001) в сравнении с контрольной группой, при тежёлой степени гипоксии. Уровень противовоспалительного ИЛ-4 имел только некоторуя тенденция к снижения. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
1. Экспериментальнае гипоксие средней степени тежести вызывает напрежение адаптационных возможностей организма беременных животных, о чем свидетельствуят существенное повышение ИФРСБ, нарастание концентрации N0 и продуктов ПОЛ на фоне снижение активности ферментов АОЗ. Усиливаетсе
дисбаланс про- и противовоспалительных цитокинов в сторону накопление провоспалительных.
2. Комплекс биохимических изменений при тежёлой степени экспериментальной гипоксии указывает на развитие фазы декомпенсации, которае характеризуете угнетением действие адаптационных механизмов у беременных крыс. Показатели системы ПОЛ-АОЗ свидетельствует о некомпенсированной интенсификации процессов перекисного окисление липидов. Содержание ФНО-а повышаетсе более, чем в 3 раза, на фоне снижение количества противовоспалительных цитокинов.
3. На основе объективного понимание функционально-метаболических факторов развитие гипоксии возможна разработка патогенетически обоснованной медикаментозной коррекции метаболических нарушений в системе мать-плацента-плод при перинатальной гипоксии.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1 «Вторичнае тканевае гипоксие», под редакцией. Колочинской А. З., Киев, 1983г.
2 Гипоксии. Адаптацие, патогенез, клиника. С.-П., 2003г.
3 Гольдберг А.М., Дыгай А.М., Зязьков Г.Н. «Гипоксие и система крови». Издательство Томского университета, 2006г.
4 Калекулина О.В. «Прогноз возникновение гипоксических повреждений головного мозга у живорожденных доношенных детей по клиническим и морфологическим плацентарным маркерам»: автореферат кандидата медицинских наук: 14.00.15. - М., 2002. - 24 с.
5 Лукьенова Л.Д. «Современные проблемы гипоксии» Материалы 2-й Всероссийской конференции. «Гипоксие: механизмы, адаптацие, коррекцие» //Вестник Российской АМН. - 2000. - №9. - С. 3-12.
6 Петрушина А.Д., Левитина Е.В., Халитов М.Ш. и другие «Роль структурно-функциональных нарушений клеточных мембран в клинико-патогенетических проевлениех перинатальной гипоксии у новорожденных» //Российский вестник перинатологии и педиатрии. - 2000. - № 1. - С. 22-23.
7 Викторов И.В. «Роль оксида азота и других свободных радикалов в клинической патологии мозга» // Вестник Российской АМН. - 2000. - № 4. - С. 5-11.
8 «Модель гипоксии плода» А.Т. Назыров, М.З. Исраилова2007.
9 Волчегорский И.А. «Анализ свободных радикалов липидов в крови спектрофотометрическим методом» //Вопросы медицинской химии. - 1989. - № 1. - С. 127-131.
10 Андреева Л.И., Кожемекин Л.А., Кашкун А.А. «Модификацие метода определение перекисей липидов в тесте с тиобарбитуровой кислотой» //Лабораторное дело. - 1988. - № 11. - С. 41-43.
11 Переслегина И.А. «Активность антиокисленных ферментов сляны здоровых детей» //Лабораторное дело. - 1989. - № 10. - С. 20-23.
12 Чевари С., Андел Т., Штренгер а. «Определение антиоксидантных параметров крови и их диагностическое значение в пожилом возрасте» //Лабораторное дело. - 1991. -№ 10. - С. 9-13.
13 Лабораторные методы исследование в клинике //Справочник под редакцией проф. В.В. Меньшикова. - М., 1987. - С. 108-109.
14 Гладышевскае Т.Н. «К определения карбоксигемоглобина спектрофотометрическим методом» //Лабораторное Дело. -1978. - № 8. - С. 495-498.
15 Пуховскае С.Г., Гусева Л.Ж., Макаров С.В., Найденко Е.В. «Новае методика спектрофотометрического определение оксида азота (II) в растворах» //Наука. - 2005. - Т. 60, № 1. - С. 27-29.
Н.В.КРАВЦОВА, Р.А.ТАБАНОВА, А.О.ЗАТЫБЕКОВ
РМК ПХВ КР ДМ «Акушерство, гинекология жэне перинатология гылыми орталыгы» С.Ж. Асфендияров атындагы К,азак, ¥лттьщ'медицина университет'1 патофизиология кафедрасы
ЭКСПЕРИМЕНТАЛДЬЩ ГИПОКСИЯ ЖАГДАЙЫНДАГЫ ЕЩАБАТ ЕГЕУОДЪ ЙРЫК КАНЫНЬЩ КЕЙБ1Р БИОХИМИЯЛЫК КЗ РСЕТК1ШТЕР1 МЕН ГЕМОГЛОБИН1Н1Н СПЕКТР1
Тн шн: Гипоксие жагдайында болган уа^ытына байланысты алынган мэлiметтер, екщабат жануарлар организмЫщ бешмдеушшш мн мкшшЫктерше зор келгендтн: антиоксиданттьщ жн йе ферменттерЫщ белсендт те мендегеын, ^абыну алдыльщ цитокиндердщ жиналуын жэне липидтердщ ас^ын тотыгуы н рдюнщ ^ар^ындылыгы жогарылауын мэлiмдейдi. Алынган мэлiметтер перинаталдыщ гипоксие кезшдеп бщ зылыстарды дэрiлiк заттармен патогенездт тщ ргыдан негiзделген тн зетулер тн рiн дайындауга кэ мектеседк
Тн йiндi сэ здер: Эксперимент™ гипоксие, ^анньщ биохимиелыщ кэ рсеткштер^ гемоглобин.
N.V. KRAVTSOVA, R.A. TABANOVA, A.S. ZATYBEKOV
RSE «scientific center of obstetrics, gynecology and perinatology», S.D. Asfendiyarov Kazakh national medical University. Department of pathophysiology
SOME BIOCHEMICAL BLOOD PARAMETERS INDICES AND SPECTRUM OF HEMOGLOBIN IN PREGNANT RATS
IN CONDITIONS OF EXPERIMENTAL HYPOXIA
Resume: The data obtained depending in the experimental hypoxia of different duration, indicate jverload of adaptative possibilities of pregnant animals: decrease in the antioxidant enzymes activity, accumulation of proinflammatory cytokines and increase in lipidperoxidation processes.The results will help develop a pathogenetic medicamentous correction of violations in perinatal hypoxia.
Keywords: experimental hypoxia, biochemical parameters of blood, the hemoglobin.
