CC BY
104
ЗДОРОВЬЕ СРЕДЫ
УДК 575.22;575.224
НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА
Е.Ю. Крысанов, К.Г. Орджоникидзе1
В статье рассмотрены современные методы оценки генетического гомеос-таза животных. Подробно рассмотрены такие методы как тест ДНК-комет, микроядерный тест, хромосомные аберрации и сестринские хроматидные обмены. Рассмотрены вопросы чувствительности данных методов и особенности их применения и проведена сравнительная оценка их недостатков и преимуществ для оценки генетического гомеостаза в естественных популяциях животных.
Ключевые слова: генетический гомеостаз, микроядерный тест, хромосомные аберрации, сестринские хроматидные обмены.
CERTAIN ASPECTS OF CYTOGENETIC MONITORING
E.Yu. Krysanov1, K.G. Ordzhonikidze1,2 1 A.N. Severtsov Institute of Ecology and Evolution 2 Vavilov Institute of General Genetics
The article gives the reader some information on modern assessment methods of genetic homeostasis of animals. The authors explain in detail such methods as comet assay (single cell gel electrophoresis assay), micronucleus test, chromosome aberration and sister chromatid exchanges. The authors also discuss the sensitivity level of the abovementioned tests as well as certain aspects of their application. Further on, the article compares advantages and disadvantages of the methods mentioned from the point of view of genetic homeostasis assessment in natural surroundings.
Keywords: micronucleus test, chromosome aberration, sister chromatid exchanges.
Организм на протяжении всего своего развития подвергается воздействию весьма разнообразных факторов как внешних, так и внутренних. Одной из главных особенностей живого организма - является способность к поддержанию гомеостаза, как
1 Крысанов Евгений Юрьевич - к.б.н., зав. лабораторией экологического мониторинга регионов АЭС и биоиндикации Института проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН (ИПЭЭ), krysanov@sevin. ru; Орджоникидзе К.Г. - м.н.с. группы мутагенеза и репарации Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН (ИОГЕН) и лаборатории экологического мониторинга регионов АЭС и биоиндикации ИПЭЭ, chiris.ordj@ gmail.com.
Жизнь Земли 40(4) 2018 403-407
403
2018, том 40, № 4
на уровне целого организма, так и отдельных его составляющих. В нормальных условиях организм реагирует на воздействие среды посредством сложной физиологической системы буферных гомеостатических механизмов. Эти механизмы поддерживают оптимальное протекание процессов развития. Под воздействием неблагоприятных условий эти механизмы могут быть нарушения [2].
Изменения гомеостаза отражают базовые изменения функционирования живых существ и находят выражение в процессах, протекающих на разных уровнях, от молекулярного до организменного, и соответственно, могут быть оценены по различным параметрам с использованием различных методов. Способность поддерживать относительное постоянство и целостность генетических систем можно назвать генетическим гомеостазом.
Существуют разнообразные методы оценки генетического гомеостаза организма от молекулярных до цитогенетических. В настоящем обзоре мы попытаемся рассмотреть ограниченный набор цитогенетических методов оценки генетического гомеостаза, ориентируясь в основном на их приложение к естественным популяциям животных на разных стадиях онтогенеза. Прямого или опосредованного химико-токсикологического анализа биологического образца недостаточно для понимания возможной опасности для живых организмов тех или иных воздействий. Необходима комплексная оценка реакции организма на разных уровнях его организации на те или иные токсические воздействия.
К основным цитогенетическим методам такого рода можно отнести анализ частот повреждений ДНК, визуализируемых в виде ДНК комет, микроядер, хромосомных аберраций и сестринских хроматидных обменов [3].
В настоящее время наиболее распространены тест ДНК-комет и микроядерный тест, тогда как анализ хромосомных аберраций и сестринских хроматидных обменов встречается сравнительно редко.
Являясь чувствительным тестом на наличие или отсутствие общего генотоксиче-ского эффекта, метод ДНК-комет, однако, ничего не говорит о специфичности выявляемых повреждений. Как правило, в системе комплексной оценки генотоксических эффектов он используется в сочетании с такими методами, как микроядерный тест или анализ частот хромосомных аберраций в костном мозге. В таблице рассмотрены основные преимущества и недостатки рассмотренных в обзоре тестов, используемых для оценки генетического гомеостаза.
Наиболее существенные повреждения ДНК на молекулярном уровне, эффективно детектируемые методом ДНК комет - разрывы, приводящие к образованию хромосомных аберраций в случае отсутствия или некорректного протекания процессов репарации в клетке. Хромосомные аберрации и потери могут привести к клеточной гибели, что в свою очередь порождает развитие патофизиологических состояний. Если разрывы ДНК не репарировались, то в соматических клетках возможно развитие канцерогенеза, а в случае клеток генеративного ряда - влияние на фертильность индивида и вероятность передачи нарушений потомству. Вместе с тем, необходимо отметить, что на ранних стадиях мейоза у самцов в подобных клетках с достаточной вероятностью блокируется деление и они не дают начала гаметам [1]. Наличие хромосомных аберраций в период эмбриогенеза тесно взаимосвязано со спонтанными абортами, гибелью эмбрионов на разных стадиях и возникновением морфологических аномалий.
Микроядерныий тест также показывает нарушения, образовавшиеся в процессе клеточных делений из фрагментов, возникших при разрыве хромосом (кластогенный 404
Таблица. Преимущества и недостатки тестов, используемых для оценки генетического гомеостаза
Тест Преимущества Недостатки
Тест ДНК-комет Возможность применять модификации метода для широкого спектра видов, органов, тканей. Относительно невысокая стоимость и трудоёмкость. Высокая чувствительность. Возможность выявлять различные эффекты (репарация, апоптоз и др.) и нарушения (одно /двунитевые разрывы). Возможность выполнять часть исследования в полевых условиях. Comet Assay занимает промежуточное положение между молекулярными и цитогенетическими методами. Необходимость подбирать специфические условия для работы на различных тканях или с целью выявления тех или иных эффектов (апоптоз, окислительный стресс и пр.). Субъективность в оценке результатов в случае отсутствия автоматизированных систем обсчёта параметров ДНК-комет. Регистрируются только потенциальные нарушения.
Микроядерный тест Простота, надежность и невысокая стоимость. Возможность использовать любые пролиферирующие ткани. Легко выполнять в полевых условиях. Нет необходимости умерщвлять животных. Можно выявлять как кластогенные, так и анеугенные эффекты. Невысокая спонтанная частота. Большая видовая, индивидуальная, физиологическая и сезонная изменчивость. Необходимы большие выборки.
Аберрации хромосом, мутации генома, сестринские хроматид- ные обмены (СХО) Высокая чувствительность, особенно при использовании методов дифференциального окрашивания хромосом. Достаточная простота при выявлении анеуплоидных и полиплоидных клеток. Возможность работы в полевых условиях и на разных стадиях онтогенеза. Невозможность автоматизации. Высокая трудоемкость. Высокая стоимость, особенно при использовании флуоресцентных методов анализа. Субъективность в оценке результатов, как следствие квалификации оператора. Трудности при работе с природными образцами (мелкие хромосомы у рыб и их большое число, невысокая митотиче-ская активность и сезонная динамика). Необходимость предварительной предобработки в случае изучения СХО.
эффект) или отстающих хромосом (анеугенныий эффект) в зависимости от исследуемого мутагена. Кроме того, более высокая доля положительных результатов для микроядерного теста может быть обусловлена генотоксическим и цитотоксическим эффектом мутагенов одновременно.
Тем не менее, исследователи отмечают довольно высокую взаимосвязь результатов исследований воздействия различных мутагенов на биологические объекты, полученных методами ДНК-комет, оценкой частоты хромосомных аберраций и микроядерным тестом [7, 5]. Различными комбинациями описываемых методик оценивались генотоксические эффекты пестицидов, промышленных химикатов, а также применялись в биомониторинговых исследованиях и ряде медицинских приложений, например, при исследовании причин нарушения сперматогенеза у мужчин разного возраста. Однако отмечается более высокое согласие между методом ДНК-комет и
¿¿fâu&iû SetMUii-
2018, том 40, № 4
хромосомных аберраций, чем между методом ДНК-комет и микроядерным тестом [5]. В некоторых случаях сочетание двух методик (ДНК-кометы и микроядерныий тест) даёт положительный результат для одного теста и отрицательный для второго, что является следствием того, что для проведения теста ДНК-комет стадия клеточного цикла, на которой формируется нарушение, не является таким определяющим фактором, как для микроядерного теста. Как правило, в целом исследователями отмечается более высокая (или, по крайней мере, не меньшая) чувствительность метода ДНК-комет по сравнению с общепринятыми цитогенетическими методами.
Однако из-за некоторых ограничений и неоднозначных трактовок результатов, полученных методом ДНК-комет, для получения выводов признаётся необходимость сочетания генотоксических и экотоксикологических подходов.
Рассмотренные выше достоинства и недостатки методов, применяемых для оценки генетического гомеостаза, показывают, что применение только одного из них не позволяет получить адекватной оценки состояния организма. Поэтому, на наш взгляд, необходимым является применение как минимум двух из вышеприведённых методов, а в идеале всех возможных.
Следует также отметить, что работ, в которых применяются цитогенетические методы при анализе воздействия антропогенных факторов на природные популяции, не так много. В первую очередь это связано с комплексным воздействием разнообразных по природе факторов на геном. В подавляющем числе работ используется анализ микроядер и/или тест ДНК-комет.
При анализе цитогенетических нарушений в природных популяциях следует учитывать, что вызывать их могут не только присутствующие в окружающей среде эко-токсиканты, например, повышенный радиационный фон, но и разнообразные естественные факторы, как абиотической, так и биотической природы. Это могут быть резкие колебания температуры, кислотности, популяционный стресс, вирусные инфекции, паразитарные инвазии, гормональные нарушения и пр. Кроме того, известно, что в процессе онтогенеза может изменяться частота цитогенетических нарушений, например, аберраций хромосом [6].
В связи с этим, при выполнении цитогенетических исследований в природных популяциях необходимо работать с большими выборками, выровненными хотя бы по половому и возрастному составу. В дальнейшем это будет способствовать корректному статистическому анализу. Кроме того, следует по возможности применять методы, исключающие травматические последствия для животных.
В качестве природных объектов для оценки цитогенетических их показателей среди позвоночных можно рекомендовать представителей рыб, амфибий и мелких млекопитающих, широко распространённых в регионе исследования. Для анализа аберраций хромосом наиболее пригодны виды, имеющие наименьшее число диплоидных хромосом. В случае применения методов подсчёта микроядер и ДНК-комет можно использовать любые широко распространённые в данном регионе виды животных. При анализе мейоза следует помнить, что в средних широтах он имеет сезонную выраженность (разные фазы мейоза могут быть достаточно тесно связаны с сезонами года).
Среди приведённых выше методов наиболее доступным и простым в техническом отношении является метод подсчёта микроядер. Для исследования микроядер могут быть использованы различные органы и ткани. Следует лишь учитывать, что они могут обладать разной чувствительностью к экотоксикантам. Метод не требует умерщвления животного и, кроме того, позволяет взять пробы от значительного коли-406
чества экземпляров, что упрощает последующие статистические расчеты. Кроме того, возможно использование видов разных систематических групп, что повышает объективность оценки. Поэтому в качестве первоначального сканирования выбранной территории мы предлагаем использовать именно его. Необходимо, лишь учитывать, что чувствительность данного метода ниже, чем, например, теста ДНК комет.
Для уточнения и детализации данных, полученных при скрининге природных популяций, необходимо проведение лабораторных экспериментов. Они позволяют использовать ряд методов, таких как тест ДНК-комет, анализ нарушений в мейозе, анализ аберраций хромосом и сестринских хроматидных обменов, которые трудно применить в полевых исследованиях.
ЛИТЕРАТУРА
1. Богданов Ю.Ф., Коломиец О.Л. Синаптонемный комплекс - индикатор динамики мейо-за и изменчивости хромосом. М.: КМК, 2007. 358 с.
2. Захаров В.М. Гомеостатические механизмы биологических систем: постановка проблемы // Онтогенез. 2014. Т. 45(3). С.137.
3. Орджоникидзе К.Г., Демидова Т.Б., Крысанов Е.Ю. Способы оценки цитогенетического гомеостаза в природных популяциях животных на разных этапах онтогенеза // Онтогенез. 2014. Т. 45(3). С. 170-179.
4. Hartmann A., Piappert U., Poetter F. et al. Comparative study with the alkaline Comet assay and the chromo some aberration test // Mutation Research. Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 2003. V. 536. No 1. P. 27-38.
5. Hartmann A., Elhajouji A., Kiskinis E. et al. Use of the alkaline comet assay for industrial genotoxicity screening: comparative investigation with the micronucleus test // Food and chemical toxicology. 2001. V. 39. No 8. P. 843-858.
6. Krysanov E.Y. Aneuploidy in postnatal ontogenesis of fishes // Acta Zool. Fennica. 1992. V. 191. Р. 177-182.
7. Shelby M.D., Witt K.L. Comparison of results from mouse bone marrow chromosome aberration and micronucleus tests // Environ. Mol. Mutagen. 1995. V. 25. P. 302-313.
REFERENCES
1. Bogdanov Yu.F. and Kolomiets O.L. Synaptonemal Complex - An Indicator of the Dynamics of Meiosis and Chromosomal Variability. 358 p. (Moscow: KMK, 2007) (in Russian).
2. Zakharov V.M. and Trofimov I.E. Homeostatic mechanisms of biological systems. Russian journal of developmental biology. 45 (3), 105-116 (2014).
3. Ordzhonikidze C., Demidova T., Krysanov E. Evaluation of genetic homeostasis in animals at different stages of ontogenesis in the environment. Russian journal of developmental biology. 45 (3), 134-142 (2014).
4. Hartmann, A., Piappert U., Poetter F. et al. Comparative study with the alkaline Comet assay and the chromo some aberration test. Mutation Research. Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 536 (1), 27-38 (2003).
5. Hartmann A., Elhajouji A., Kiskinis E. et al. Use of the alkaline comet assay for industrial genotoxicity screening: comparative investigation with the micronucleus test. Food and chemical toxicology. 39 (8), 843-858 (2001).
6. Krysanov, E.Y. Aneuploidy in postnatal ontogenesis of fishes. Acta Zool. Fennica. 191, 177-182(1992).
7. Shelby M.D., Witt K.L. Comparison of results from mouse bone marrow chromosome aberration and micronucleus tests. Environ. Mol. Mutagen. 25, 302-313 (1995).
