CC BY
59
УДК 579.6
НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ НАПРАВЛЕННОГО БИОЛОГИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА МИЦЕЛИЙ PLEUROTUS OSTREATUS И AGARICUS BISPORUS, А ТАКЖЕ НА РЯД СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ
© 2009 В.Р. Киреев, О.Н. Макурина, С.В. Киреева
Самарский государственный университет, г. Самара
На кафедре биохимии Самарского государственного университета проведен процесс климатического биологического кондиционирования гомогенной и оптимизированной питательной среды для нестерильного культивирования A. bisporus. После третьей волны плодоношения A. bisporus из полученной биомассы компоста был выделен активный симбиотический микробо-ценоз. Проведены исследования влияния этого микробного симбиоза, а так же его метаболитов, на показатели плодовой генерации мицелия съедобных грибов P. ostreatus и A. bisporus, а также на развитие таких сельскохозяйственных культур, как Capsicum annuum, Triticum aestivum и Solanum lycopersicum.
Ключевые слова: мицелий, биологическое воздействие, симбиоз.
ВВЕДЕНИЕ
В мире неуклонно ухудшается ситуации продовольственного обеспечения малообеспеченной категории населения, что ставит перед человечеством задачу поиска новых источников экологически чистых и биологически ценных питательных веществ низкой себестоимости. В данный момент около 80% потребляемой человеком пищи дают растения, однако увеличение ресурсов за счет естественных угодий имеет свои пределы. К тому же попытки увеличения пищевой ресурсной базы за счет продукции генной инженерии ведут к значительным потенциальным рискам снижения среднестатистических показателей здоровья населения, ввиду малой изученности последствий употребления человеком, в долгосрочном режиме, генетически модифицированной пищевой продукции.
Культивирование широкого видового ряда шляпочных грибов, могло бы открыть новые источники разнообразных белков, биологически активных веществ и витаминов. С точки зрения экологической, биологической и фармакологической ценности, товарная биомасса шляпочных грибов значительно превосходит аналогичные показатели пищевой продукции растительного происхождения. Искусственно культивируемые грибы можно выращивать круглогодично, независимо от продолжительности светового дня и климатических условий. К тому же производство грибов практически любого рода и вида, по показателям
Владимир Реональдович Киреев, инженер; Ольга Николаевна Макурина, профессор кафедры биохимии; Светлана Владимировна Киреева, лаборант.
прироста товарной биомассы за единицу времени, и по показателю минимальной себестоимости единицы массы продукта, многократно превосходит любое другое сельскохозяйственное производство, включая производство мяса рыбы и молока.
Согласно современным представлениям, практически весь азот живых организмов имеет своим источником биологическую фиксацию молекулярного азота атмосферы, который впоследствии используется грибами для построения своего мицелия и увеличения биомассы. Поиск эффективных природных азотфиксаторов и биологических редуцентов, продукты жизнедеятельности которых могли бы использовать культивируемые грибы, на данный момент составляет одну из главных задач научных изысканий в направлении фундаментальной и прикладной биологии, а также микологии грибного производства.
Выращивание съедобных грибов в настоящее время выделилось в перспективную, рентабельную и быстроразвивающуюся отрасль сельского хозяйства. Мировое производство грибов за последние два десятилетия резко возросло [1]. Производители грибов и питательных сред для их культивирования в практике часто сталкиваются с появлением конкурентной флоры в субстрате, прошедшем предварительную специальную термическую и бактериальную обработку, именуемую в производственном лексиконе ферментацией. Появление метаболитов этих конкурирующих организмов, представленных в основном различными плесенями, существенно ингибирует жизнедеятельность мицелия культивируемых
грибов, что, как правило, вызывает чрезмерное снижение урожая [2].
Рис. 1. Часть симбиотической культуры под микроскопом (увеличение в 56 раз)
Обобщая сказанное, выделяем, что на данный момент главными проблемами вновь образованной и развивающейся отрасли грибного производства в России являются:
1. Экономическая нестабильность профильных предприятий, вызванная несовершенством традиционно используемого в мире процесса климатического биокондиционирования субстрата перед культивированием на нем грибов.
2. Неоправданные потери (до 60%) общего азота, при приготовлении субстратов и ком-постов культивирования грибов, вызванные несовершенством традиционно используемого в мире процесса биологической инверсии сырьевого питательного композита.
3. Низкий уровень содержания белкового азота в традиционных сырьевых источниках для приготовления питательных сред грибов.
Универсальным инструментом, для снятия обозначенных проблем может стать использование выделенной культуры симбиотиче-ского микробоценоза в процессе приготовления питательных сред культивирования грибов. Данная культура была получена в лаборатории «Прикладная микология и грибоводство» при кафедре «Биохимия» Самарского университета.
Поэтому целью данной работы стало исследование влияния выделенного симбиоти-ческого микробоценоза и его метаболитов на весь спектр показателей развития мицелия съедобных грибов Pleurotus ostreatus и
Agaricus bisporus, а также на развитие отдельных сельскохозяйственных культур.
В рамках поставленной цели решались следующие задачи:
1. Доказательство свойства выделенной симбиотической культуры микробоценоза как эффективного биологического редуцента субстратного и компостного сырьевого питательного композита.
2. Доказательство свойства данной симбио-тической культуры как эффективного биологического фиксатора атмосферного и минерального азота.
3. Изучение свойства биомассы субстратного композита, подвергшегося биологической конверсии, посредством данного микробоцено-за, как удобрения для различных сельскохозяйственных культур, включая грибы.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом исследования служило симбио-тическое сообщество микроорганизмов (выделенное из отработанного шампиньонного компоста) в комплексе с питательной биомассой ими редуцируемой (рис. 1), а также мицелий грибов P. ostreatus, A. bisporus и культурные растения Capsicum annuum, Triticum aestivum и Solanum lycopersicum.
Выращивание посевного мицелия A. bisporus и P. ostreatus. Питательный носитель для посевного мицелия - зерно пшеницы увлажняли путем варки. После слива воды наружную оболочку зерна просушивали посредством горячего воздуха, затем стерилизовали паром в автоклаве. После охлаждения производился засев стерильной питательной среды, посредством заранее приготовленного мицелия первичной культуры грибов.
Питательным носителем для мицелия первичной культуры грибов служили лигноцел-люлозные комплексные субстратные вещества.
Подготовка основы субстрата для выращивания P. ostreatus и A. bisporus. Основой субстрата для грибов служила пшеничная солома. Подготовка субстрата имела следующие стадии:
1) увлажнения сырья;
2) климатического аэробного биологического кондиционирования;
3) охлаждения готового субстрата.
Подготовка питательной основы для
культивирования грибов посредством биологической редукции высококалорийных источников питания. Биологически редуцируемой микробоценозом питательной средой (как и в случае с мицелием грибов) являлось сте-
рилизованное зерно пшеницы, и его подготовка велась аналогичным способом. Степень инверсии питательных веществ зависела от временной экспозиции (инкубации) культуры в термостате. После инкубации исследуемую биомассу, либо стерилизовали, с последующим засевом первичной культуры мицелия грибов (таким образом, получали посевной мицелий улучшенного качества), либо микро-боценоз в питательной биомассе сохраняли, используя последнюю в качестве эффективного биологического препарата для исследования его влияния на рост некоторых высших растений
Рис. 2. Результат биологической конверсии пшеничной соломы
Методика определения эффективности влияния симбиотического микробоценоза на рост грибов в субстрате. Перед посевом мицелия улучшенного (посредством питательной среды подвергшейся биологической конверсии) качества, все зерновки с мицелием разделялись. Далее осуществлялось перемешивание частиц этого мицелия с субстратом с последующей фасовкой субстрата в полиэтиленовые пакеты. Полученные блоки субстрата переносились в термостат (инкубатор). В инкубаторе субстрат зарастал, после чего переносился в зону культивации, в которой был организован специальный микроклимат, что
обеспечивало необходимые условия для роста плодовых тел грибов. По количеству и качеству полученных грибов производилась оценка эффективности влияния изучаемой культуры и ее метаболитов на мицелий.
Влияние микробоценоза на рост и развитие культурных растений. Данное исследование проводилось в течение 3 месяцев. Сообщество микроорганизмов вместе с измененной питательной биомассой добавляли в небольшом количестве в заведомо бедную почву, основу которой (95%) составлял песок. Контрольная группа растений выращивалась в открытом грунте - в богатой плодородной почве.
Определение содержания азота в зерне.
Содержание азота в зерне, подвергшемся биологической конверсии проводилось в г. Кинель в Поволжском НИИ РАСХН селекции и семеноводства им. П.М. Константинова по методу Кьельдаля (табл. 1).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
При культивировании микробоценоза в стерильном зерне пшеницы с влажностью 50% и пшеничной соломе с влажностью 75% через 2 недели появлялся запах аммиака. Через 6 месяцев солома превратилась в вязкую текучую жидкость темно-коричневого цвета с запахом аммиака (рис. 2), а в зерне наряду с усилением запаха аммиака, количество крахмала снижалось до минимальных значений (около 5%). При этом количество общего азота в субстрате возрастало до 38%, относительно исходного показателя.
По-видимому, микробоценоз не только активно связывает азот, но и расщепляет целлюлозу, лигнин и крахмал субстрата, о чем свидетельствует запах аммиака и разжижение субстрата соломы, с одной стороны, и присутствие запаха аммиака и минимальная реакция раствора йодида калия на крахмал в зерне, после его инверсии - с другой. Кроме того, переход субстрата в жидкую фазу при отсутствии запаха сероводорода свидетельствует о низкой требовательности культуры к содержанию кислорода, т.е. данный микро-боценоз можно назвать факультативным анаэробом. Содержание общего азота, так же как и сырого протеина, через 3 месяца увеличилось на 6%, а через 6 месяцев - на 38%, относительно аналогичных показателей в контрольных образцах зерна, не подвергавшегося биологической инверсии. Учитывая тот факт, что в среду не вносились дополни-
тельные источники азота, можно говорить об интенсивном процессе азотфиксации симбио-тическим микробоценозом.
Таблица 1
Результаты определения показателей общего азота и сырого протеина по методу Кьельдаля
Наименование образца Воздушно-сухая навеска
% общего азота % сырого протеина
Контроль (вареное зерно) 2,36±0,03 13,52±0,34
Опытный обр. (3 мес.) 2,51±0,05 14,33±0,26
Опытный обр. (6 мес.) 3,83±0,07 21,88±0,43
Субстрат, минимально освоенный симбио-тической культурой, практически не поражался конкурирующими грибами. После введения в традиционный субстрат грибов-ксилотрофов 5% весовой нормы стерилизованной зерновой биомассы микробоценоза в течение 1,5 месяцев, кроме мицелия высших грибов, ни одна споровая форма конкурентов не смогла прорасти и освоить его. Даже при посеве минимальной нормы 1,5% культивируемого мицелия грибов в субстрате в течение всего времени инкубации не обнаруживалось признаков контаминаций - гриб постепенно полностью осваивал субстрат. Зерновой субстрат, влажностью 50%, ферментированный микробоценозом при температуре 10оС в течение 3 месяцев, впоследствии стерилизовался и засевался мицелием грибов -вешенки и шампиньона. Начало колонизации такого субстрата мицелием грибов проходила не сразу (табл. 2), что говорит о сильной метаболической защите микробоце-ноза, которую, например, мицелий шампиньона, имеющий более широкий набор ферментов, чем Мисог, смог преодолеть только через 3 недели после посадки.Кроме метаболического механизма, подавление микроскопических конкурентов микробоценозом может осуществляться и за счет быстрого роста самой культуры, а также и за счет более полного освоения субстрата с использованием дополнительного источника азота и, следовательно, за счет скорости белкового синтеза. Грибы (в том числе Мисог) более приспособлены, чем бактерии, в особенности анаэробные, так как они имеют более широкий набор ферментов, в том числе разрушающих целлюлозу, белковые вещества и другие биополимеры до мономеров и могут приготовить стартовое питание (оптимизированное) для азотфиксирующих организмов. Кроме того, в результате своей жизнедеятельности он по-
требляет О2, избыток которого подавляет активность нитрогеназной системы Clostridium и P. ostreatus. Отмершие клетки плесневого гриба имеют стабильный питательный состав, который использует азотфиксирующая бактерия. Azotobacter также нуждается в повышенной влажности, а после переработки грибами рода Mucor влажность субстрата увеличивается от 50% до 75% за счет высвобождения биологически связанной воды. Содержание азотфиксирующих бактерий рода Clostridium sp. в симбиотическом микробоценозе также увеличивает скорость накопления азота в культуре. Azotobacter активно поглощает из среды кислород, создавая его низкое парциальное давление, необходимое для Clostridium. В то же время Clostridium образует органические кислоты, которые использует Azotobacter. Clostridium является кислотооб-разователем, а Azotobacter образует щелочные продукты. Таким образом, устраняются скачки рН. Предположительно, создается сильная метаболическая защита биоценоза, наиболее вероятно, что это гуминовые вещества, так как субстрат накапливает до 4-5% N.
Таблица 2
Процесс колонизации мицелием грибов P. ostreatus и A.bisporus
Название Начало освоения Полн. освоение
гриба субстрата субстрата
Через 21 день после 56 дней после
A. bisporus посадки посадки
Через 5 дней после 30 дней после
P. ostreatus посадки посадки
Понятие дружности плодоношения означает единовременность образования плодовых тел грибов P. ostreatus на доступной наружному воздуху поверхности одновременно во всех прорезях полиэтиленовых мешков, что составляют суммарную поверхность плодоношения. В практике грибного производства зачастую используется посевной мицелий, имеющий средние показатели физиологического состояния (состояния готовности к генеративным процессам). При внесении такого мицелия в субстрат (практически в любой процентной концентрации), по истечении периода инкубации, единовременное образование плодовых тел грибов занимает лишь от 30% до 60% поверхности плодоношения. Если же посевной мицелий того же качества засевать в субстрат, в который предварительно был внесен стерилизованный симбиотиче-ский микробоценоз (то есть содержащий его
метаболиты), то дружность плодоношения затели урожайности во втором случае были составляет 100%. При этом остальные пока- так же более предпочтительными (табл. 3).
Таблица 3
Плодоношение Pleurotus ostreatus в субстрате, имеющем метаболиты симбиотического микробоценоза
Характеристика субстрата Дружное плодоношение, % от суммарной открытой поверхности Урожай 1-й волны плодоношения, % от массы субстрата Время начала плодоношения 1-й волны
Обычная солома 30-60% 17 18-24-й день инкубации
Солома с метаболитами 100% 17-18 14-й день инкубации
Полученная в итоге биомасса гриба остается практически та же, что говорит о полном использовании мицелием гриба питательных веществ субстрата. При этом распределение питательных веществ в субстратном блоке в первом случае неоднородно - в тех местах, где их меньше, образование плодов наступает позже. Во втором случае они равномерно распределены по субстрату, в результате чего время сбора урожая с одного мешка сокращается в среднем в 2 раза. По-видимому, благодаря влиянию метаболитов микробоце-ноза, биологическая конверсия субстрата посредством мицелия гриба идет более эффективно, в результате питательные вещества субстрата располагаются более однородно, и гриб быстрее генерирует свои плодовые тела. Кроме того, возможно, метаболиты симбио-тического микробоценоза, возвращают мицелий P. ostreatus в активную (генеративную) фазу, стимулируя способность гриба к образованию плодов.
Как оказалось в ходе исследований, мицелий, имеющий ярко выраженные генеративные свойства, более требователен к содержанию кислорода - обычно это хорошо проявляется на высокопитательных средах, где мицелий более активно функционирует. Мицелий, не имеющий выраженных генеративных свойств, находясь в равных температурных условиях (0+20С) и даже при более высокой температуре (около 100С) практически полностью сохраняет свою жизнеспособность, что свидетельствует о его меньшей требовательности к содержанию кислорода. При этом морфологические отличия в мицелии гриба в этих двух фазах учеными-микологами не найдены (что подтверждают исследования Л.М. Краснопольской). Можно сделать предположение, что эти две фазы роста гриба отличаются количественным со-
отношением различных, особенно специализированных на генерацию клеток.
Рис. 3. Рост Triticum aestivum в грунте, содержащем симбиотическую культуру (слева), и без нее (справа)
Процесс азотфиксации также интересен для применения к другим сельскохозяйственным культурам - уже после 3 месяцев (а лучше 6) нахождения микробоценоза на зерне или соломе данный субстрат может использоваться не только для грибов, но и как удобрение для других сельскохозяйственных культур. При добавлении (в небольшом количестве) данного сообщества организмов в заведомо бедную почву (речной песок) и выращивании на ней перца овощного (^ annuum) в условиях лабораторного помещения, и соответственно, в условиях сокращенного светового дня, плоды растения созрели на 1,5 месяца раньше, чем контроль-
ная группа в открытом традиционном садовом грунте и неограниченном дневном освещении. А в контрольной группе находящейся в песке, и имеющей аналогичные ограничения, но без биологической добавки С. аппиит попросту перестал развиваться. Влияние микробоценоза на рост Т. aestivum также было доказано экспериментальным путем (рис. 3). За период эксперимента опытные растения значительно превосходили растения контрольной группы по массе листьев, их длине, качеству корневой системы, количеству листьев и их площади.
Жидкость, полученная при длительном культивировании симбиотического микробо-ценоза на соломистом субстрате, оказалась прекрасным удобрением. При поливе комнатного лимонника, садового винограда, рассады томатов они росли более интенсивно и на них не образовывались больные листья. Таким образом, можно говорить об азотсодержащих метаболитах симбиотической культуры как о биологическом удобрении -альтернативе нитратам, широко применяемым в сельском хозяйстве.
ВЫВОДЫ
1. Симбиотический микробоценоз, выделенный из отработанного шампиньонного компоста, является ингибитором конкурентов P. ostreatus и A. bisporus и способствует колонизации мицелием этих грибов питательных сред (субстратов и компостов), а также улучшению показателей дружности и равномерности плодоношения грибов.
2. Выделенный симбиотический микробо-ценоз является активным азотфиксатором, о чем свидетельствует увеличение содержания азота в зерне на 38%, относительно контрольных образцов, и в грибных субстратах до 45%.
3. Симбиотический микробоценоз является хорошим удобрением: использование его метаболитов сокращает время сбора урожая P. ostreatus с единицы площади в среднем в 2 раза, С. annuum - на 1,5 месяца; растения T. aestivum развиваются в 2 раза более интенсивно, чем контрольные.
ЛИТЕРАТУРА
1. Выращивание грибов в домашних условиях // Сборник статей. Донецк, 2000.
2. Сычев П. А. Экофизиология высших грибов. Донецк: Кассиопея, 2000.
SOME ASPECTS OF THE DIRECTED BIOLOGICAL INFLUENCE ON MYCELIUM OF PLEUROTUS OSTREATUS AND AGARICUS
BISPORUS AND ALSO ON A NUMBER OF AGRICULTURAL PLANTS
© 2009 V.R. Kireev, O.N. Makurina, L.M. Kavelenova, S.V. Kireeva
Samara State University, Samara
In the city of Samara on faculty of biochemistry of the state university a process of climatic biological air-conditioning of the homogeneous and optimized nutrient medium for unsterile cultivating A. bisporus is lead. After the third wave of fructification A. bisporus from the received biomass substrate has been allocated active symbiotic microbocenoses. Researches of influence of this microbic symbiosis, and as it metabolites, on parameters of fruit generation mycelium edible fungi P. ostreatus and A. bisporus, and also on development of such agricultural crops, as Capsicum annuum, Triticum aestivum and Solanum lycopersicum are carried out Key words: mycelium, biological influence, symbiosis.
