CC BY
55
ВЕСТНИК НОВЫХ МЕДИЦИНСКИХ ТЕХНОЛОГИИ - 2016 - Т. 23, № 3 - С. 130-135 JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2016 - V. 23, № 3 - P. 130-135
УДК: 616.8-091.81 DOI:10.12737/21758
НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ МОРФОЛОГИИ НЕРВНОЙ ТКАНИ ГОЛОВНОГО МОЗГА ПОСЛЕ ОСТРОГО НАРУШЕНИЯ МОЗГОВОГО КРОВООБРАЩЕНИЯ
С.П. СЕРГЕЕВА*, Л.М. ЕРОФЕЕВА**, Л.В. ШИШКИНА***, П.Ф. ЛИТВИЦКИЙ*,
Е.В. ВИНОГРАДОВ***
*ГБОУ ВПО ПМГМУ им. И.М. Сеченова Минздравсоцравития, Трубецкая улица, 8, Москва, 119048, Россия, e-mail: svetlanapalna@mail.ru
**ФГБНУ НИИ Морфологии человека, ул. Цюрупы, 3, Москва, 117418, Россия, e-mail: gystology@mail.ru ***ФГБУ НИИ нейрохирургии им. ак. Н.Н. Бурденко, 4-я Тверская-Ямская ул., 16, Москва, 125047, Россия, e-mail: lshishkina@nsi.ru
Аннотация. Изучение морфологических особенностей нервной ткани головного мозга после острого нарушения мозгового кровообращения является важной задачей не только с точки зрения фундаментальной науки, но и практической неврологии, так как позволяет приблизиться к разработке новых стратегий ведения пациентов с данным заболеванием. Цель исследования: изучить особенности морфологии нервной ткани головного мозга после острого нарушения мозгового кровообращения в ипси- и контрлатеральном очагу полушариях. Исследовали образцы ткани головного мозга 9 умерших в результате ишемического инсульта в бассейне левой средней мозговой артерии человек из 3 областей: 1 - прилежащая непосредственно к очагу некротически измененной ткани, 2 - отдаленная на 5-10 см от предыдущей, 3 - область контрлатерального полушария симметричная очагу. Выявляли белки p53, нейроспецифическая енолаза, глиальный фибриллярный кислый белок непрямым иммунопероксидазным иммуногистохимическим методом. Также использовали методику окрашивания по Нисслю, гематоксилином и эозином. Выводы: При остром нарушении мозгового кровообращения возникает усиленная пластическая реакция нейронов не только в зоне поражения, но также в отдаленных регионах ипси- и контрлатерального полушария. Острое нарушение мозгового кровообращения сопровождается повышением числа реактивно измененных нейронов и астроцитов в пе-рифокальной области, а также в отдельных участках ипси- и контрлатерального полушария. Апоптоз клеток нервной ткани наиболее выражен в перифокальной области, при этом он также имеет место в определенных участках отдаленных областей ипси- и контрлатерального полушария.
Ключевые слова: острое нарушение мозгового кровообращения, нейроны, астроциты, морфология.
SOME ASPECTS OF THE MORPHOLOGY OF NERVE TISSUE BRAIN AFTER
ACUTE ISCHEMIC STROKE
S.P. SERGEEVA*, L.M. EROFEEVA**, L.V. SHISHKINA***, P.F. LITVITSKY*, E.V. VINOGRADOV***
*I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Trubetskaya Street 8, Moscow, 119048, Russia, e-mail: svetlanapalna@mail.ru **Research Institute of Human Morphology, Cjurupy Street 3, Moscow, 117418, Russia, e-mail: gystology@mail.ru
'"N.N. Burdenko Scientific Research Neurosurgery, 4-ya Tverskaya-Yamskaya str., 16, Moscow, 125047, Russia, e-mail: lshishkina@nsi.ru
Abstract. The study of the morphological features of the brain nervous tissue after acute stroke is an important issue not only in terms of fundamental science but also practical neuroscience. The purpose of this research was to investigate the main features of the morphology of the brain nervous tissue after acute stroke. Left middle cerebral artery ischemic stroke died persons (n=9) brain tissue samples from 3 areas (the 1st - contiguous to the tissue necrotic damage site zone, the 2nd - 5-10 cm distant from the previous one, the 3rd - the damage site symmetrical zone of the contralateral hemisphere) were investigated. p53, NSE, GFAP were identified by immunoperoxidase immune-histochemistry. Also, the samples were Nissl and Hematox-ylin-Eosin stained. Local cerebral ischemia appeared an increased number of neurons and astrocytes reactive
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2016 - V. 23, № 3 - P. 130-135
changes in perifocal zone as well as in the individual zones ipsi- and contralateral hemisphere. Nervous tissue cells apoptosis is most pronounced in the perifocal zone, while it also takes place in remote areas of ipsi-and contralateral hemisphere. These results suggest the nervous tissue plastic response strengthening not only in the affected area, but also in remote regions of ipsi- and contralateral hemisphere.
Key words: stroke, apoptosis, neurons, astrocytes, morphology.
Острое нарушения мозгового кровообращения согласно международным эпидемиологическим исследованиям в большинстве стран занимает 2-3-е место в структуре общей смертности. В последние годы наблюдается «омоложение» инсульта с увеличением его распространенности у лиц трудоспособного возраста, одновременно в развитых странах отмечается дальнейшее повышение средней продолжительности жизни, что приводит к росту числа случаев этого заболевания в старших возрастных группах [2]. Следовательно, с течением времени все более увеличивается актуальность поиска новых подходов к лечению и реабилитации пациентов, перенесших инсульт. В свою очередь успех этой работы зависит от знания механизмов развития и восстановления после инсульта, о которых можно судить, изучая морфологическую структуру пораженного мозга. Таким образом, изучение морфологических особенностей нервной ткани головного мозга после острого нарушения мозгового кровообращения является важной задачей не только с точки зрения фундаментальной науки, но и практической неврологии.
Цель исследования - изучить особенности морфологии нервной ткани головного мозга после острого нарушения мозгового кровообращения в ипси- и контрлатеральном очагу полушариях.
Материалы и методы исследования. Исследовали полученные при аутопсии образцы ткани головного мозга 9 человек, умерших в результате острого нарушения мозгового кровообращения по ишемическому типу в бассейне левой средней мозговой артерии. Аутопсийный материал получали в патологоанатомическом отделении ГКБ №36. Вскрытие производилось не позднее 24 часов с момента смерти. Работа, в рамках которой проводилось данное исследование, одобрена Межвузовским этическим комитетом. В каждом случае производился забор образцов из 3 областей головного мозга: 1 - область, прилежащая непосредственно к очагу некротически измененной ткани, 2 - область,
отдаленная на 5-10 см от предыдущей, 3 - область контрлатерального полушария симметричная очагу. Образцы тканей головного мозга фиксировали в 10% забуференном формалине. После отмывания фиксатора в проточной воде проводили стандартную гистологическую проводку образцов путем обезвоживания в этиловом спирте. Затем кусочки ткани пропитывали парафином, заливали в парафиновые блоки. Срезы толщиной 5 мкм изготавливали на ротационном микротоме Leica RM2125RT (Германия) и растягивали их на предметных стеклах с полилизиновым покрытием Vision biosystems plus slides (Великобритания).
Выявление белков p53, нейроспецифическая енолаза (НСЕ, англ. NSE), глиальный фибриллярный кислый белок (ГФКБ, англ. GFAP) проводили непрямым иммунопероксидазным иммуноги-стохимическим методом. Для иммунофеноти-пирования использовали мышиные монокло-нальные антитела против человека производства фирмы Vision biosystems novocastra (Великобритания), а также пероксидазную детекцион-ную систему Peroxidase Detection System for Novocastra производства «Leica Microsystems» (Германия), включающую вторичные универсальные биотинилированные антитела и стреп-тавидин-пероксидазный комплекс. Визуализация реакции осуществлялась DAB-хромогеном. Постановку иммуногистохимической реакции осуществляли согласно протоколам, прилагаемым к используемым антителам. Высокотемпературная антигенная демаскировка проводилась путем кипячения в цитратном буфере (рН - 6,0) в СВЧ-печи при максимальной мощности 900 Вт тремя циклами по 5 мин. с 1-минутными перерывами. Остывшие препараты промывали в растворе ТРИС-буфера (рН 7,54-7,58), обрабатывали 0,3% раствором перекиси водорода на метаноле (1:1) для предотвращения эндогенной пероксидазной активности. Инкубацию с первичными антителами проводили в течение 60 мин. при комнатной температуре (23 °С), с вторичными - в течение 30 мин. в термостате при температуре 37 °С. Для завершения окра-
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2016 - V. 23, № 3 - P. 130-135
шивания осуществляли фоновое контрастирование срезов гематоксилином Майера. Полученные гистологические и иммуногистохимиче-ские препараты заключали под покровное стекло и изучали с помощью светового микроскопа «Axio Scope A1», Carl Zeiss™ (Германия) с использованием цифровой фотокамеры «Canon Power Shot», программного обеспечения AxioVision LE, Carl Zeiss™ (Германия). Контроль специфичности реакции проводили с использованием неиммунной сыворотки, а также антител к вимен-тину («Dako», Дания). Для общего контроля часть из серийных срезов окрашивали по методу Ниссля и гематоксилином и эозином.
Результаты и их обсуждение. При исследовании особенностей серого вещества головного мозга на срезах, окрашенных гематоксилином-эозином и крезиловым фиолетовым по Нисслю, при увеличении *100 обнаружено снижение общего количества нейронов и гли-альных элементов преимущественно в образцах, взятых из области 1. Отмечено диффузное запустение участков коры во всех областях исследования, причем выраженность изменений в области 1 и 2 была большей, максимально выраженной в прилежащем к очагу некроза регионе - области 1. Во всех образцах были выявлены следующие изменения регионарного кровотока: венозная гиперемия, стаз, агрегация эритроцитов, периваскулярный отек. В очаге некроза и прилежащей к нему области 1 наблюдалась лейкоцитарная инфильтрация. При увеличении х400 и х900 в ипсилатеральном полушарии обнаружены следующие изменения нервных клеток: гомогенизация цитоплазмы, ее инкрустация, деформация и сморщивание ядер, кариоцитолиз с образованием клеток-теней, хроматолиз, перемещение ядра на периферию клетки и его набухание, смещение ядрышка к периферии ядра, перицеллюляр-ный отек, сателлитоз, нейронофагия (рис.1). Выраженность указанных изменений достигала максимума в периинфарктной области, однако и в остальных областях исследования наблюдались те же изменения. При этом в контралате-ральном полушарии преобладала дегенерация нейронов по типу сморщивания. Также в обоих полушариях были выявлены признаки саттели-тоза, который преобладал в контралатеральном полушарии, и нейронофагии с образованием глиозных узелков на месте погибших нервных
клеток - данный феномен преобладал в ипсилатеральном полушарии.
При использовании непрямого иммунопе-роксидазного иммуногистохимического метода выявлены следующие особенности распределения белков p53, НСЕ, ГФКБ в исследуемых образцах.
При реакции p53 распределение маркированных клеток было следующим: наибольшее количество p53-позитивных клеток отмечено в перифокальной зоне, т.е. в области 1. В областях 2 и 3 представленность маркированных клеток была сопоставимой. Апоптоз является важным звеном патогенеза ишемического инсульта. Наши результаты сопоставимы с результатами другой исследовательской группы продемонстрировавшей, что острое нарушение мозгового кровообращения сопровождается изменением межклеточных взаимодействий, ведущим за собой апоптоз, не только в перифокальной области, но также в других отделах ип-си- и контралатерального полушария [5].
Рис. 1. Клетки-тени (Т), сателлитоз (С), нейронофагия (Н), перицеллюлярный отек (стрелочки) в области 2. Окрашивание гематоксилином-эозином, увеличение х400
При реакции ГФКБ отмечена деформация и гипертрофия астроцитов во всех образцах. В области 1 отмечен выраженный интра- и перицеллюлярный отек астроцитов, их набухание, отсутствие отростков, при этом отмечено увеличение среднего количества астроцитов (рис. 2). В зонах деструкции мозговой ткани погибшие астроциты были представлены ГФКБ-позитивными зернистыми массами. В областях 2 и 3 также наблюдались явления интра- и пе-рицеллюлярного отека, наиболее выраженного
10ШХАЕ ОЕ ХЕШ МЕБТСАЕ ТЕСИХОЕОСТЕБ - 2016 - V. 23, № 3 - Р. 130-135
в ипсилатеральном полушарии. В контрлатеральном очагу полушарии, области 3, наиболее отчетливо была представлена картина сближения отдельных нейронов и астроцитов.
Рис. 2. Деформация и гипертрофия астроцитов в пе-рифокальной зоне (астроциты указаны стрелочками, очаг некроза - обозначен буквой Н). Реакция ГФКБ, увеличение *200
Рис. 3. Неравномерная интенсивность реакции НСЕ в области 2 (меньшая интенсивность - обозначение М,
большая - Б, стрелочкой указано смещение ядра нейрона на периферию). Реакция НСЕ, увеличение х400
При реакции НСЕ выявлены следующие реактивные изменения нейронов: гомогенизация цитоплазмы, интра- и перицеллюлярный отек, деформация и сморщивание ядер, карио-цитолиз с образованием клеток-теней, хроматолиз, перемещение ядра на периферию клетки. Наибольшей выраженности изменения достигали в перифокальной зоне. Возможности метода не предполагают количественное определение фермента, однако отдельные нейроны в области исследования 2 и 3 имели выраженно
более яркое окрашивание, из чего можно косвенно заключить о более интенсивной экспрессии данного белка в этих клетках (рис. 3).
Иммуноцитохимическая реакция НСЕ считается индикатором нейрональной активности. НСЕ (2-фосфо-О-глицерат гидролаза) - глико-литический фермент семейства енолаз, участвует в предпоследнем этапе гликолиза - катализирует отщепление воды от 2-фосфоглицериновой кислоты, в результате чего образуется фосфоенолпируват - соединение, содержащее макроэргическую фосфатную связь. Исходя из этого, усиление метаболической активности нейронов должно сопровождаться увеличением количества этого фермента в цитоплазме нейрона [13]. Мы отметили, что отдельные нейроны имели выраженно более яркое окрашивание, из чего можно косвенно заключить о более интенсивной экспрессии данного белка в этих клетках. Данный феномен имел место в области исследования 2 и 3. Эти данные соответствуют результатам работ другой исследовательской группы, где использовалось иммунофлуорисцентное окрашивание и при помощи специального программного обеспечения измерялась площадь флуоресцирующих гранул маркера в поле зрения. Авторы сделали заключение, что при острой ишемии в сохранившихся неповрежденных нейронах компенсаторно увеличивается содержание НСЕ, что свидетельствует об их высокой функциональной активности [3]. Возможно, эти нейроны задействованы в организации новых функциональных сетей и реализации механизмов нейропластичности. Считается, что в основе преобразования интактной мозговой ткани при церебральных повреждениях лежат механизмы реализации нейропластичности, что имеет наглядное клиническое проявление в виде активации латентных связей и образования новых [7]. Нейропластичность - способность нервной ткани изменять структурно-функциональную организацию под влиянием экзогенных и эндогенных факторов, что обеспечивает адаптацию организма и его эффективную деятельность в условиях изменяющейся внешней и внутренней среды [1]. При локальной церебральной ишемии в зоне поражения возникает усиленная пластическая реакция сохранившихся нейронов, наступает перестройка аналогичных по функциям нейронов, ранее не
ВЕСТНИК НОВЫХ МЕДИЦИНСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ - 2016 - Т. 23, № 3 - С. 130-135 JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2016 - V. 23, № 3 - P. 130-135
задействованных и расположенных на отдалении от зоны повреждения, что сопровождается выраженной структурно-функциональной реорганизацией работы мозга. При этом изменения затрагивают не только нейроны, но также глиальные элементы. Процессы пластичности вовлекают корковый и субкортикальный уровни, включая таламус, базальные ганглии и структуры ствола мозга [11]. Следовательно, можно предположить, что экспрессия р53 в отдельных нейронах контрлатерального полушария свидетельствует о том, что данные нейроны после структурно-функциональной перестройки нервной ткани оказались не задействованными во вновь образованных связях и подверглись апоптозу.
Мы также отметили, что часть нейронов в обоих полушариях головного мозга сближена с большим количеством астроцитов и расстояния между ними меньше, чем у других. Известно, что компенсаторная активация метаболизма части сохранившихся нейронов сопровождается активацией пула астроцитов. Также существуют данные о том, что обучение и реализация механизмов запоминания сопровождается повышением числа астроцитов в определенных участках мозга [6]. Существует мнение, что астроциты для снабжения нейронов энергией используют продукт расщепления гликогена лактат, который проходит через мембрану нейронов с помощью специальных транспортных белков [10]. Исходя из этого можно предположить, что астроциты принимают участие в энергетическом обеспечении реализации механизмов нейропластично-сти после церебральной ишемии. При этом активированные астроциты и микроглия - это также основные источники цитокинов в цен-
Литература
тральной нервной системе [8]. Мы отметили, что наиболее выраженная лейкоцитарная инфильтрация перифокальной области соответствует увеличению в ней количества астроцитов. Воспаление - один из механизмов повреждения нервной ткани при развитии церебральной ишемии. Нейрогенное воспаление реализуется при активации астроцитов и микроглии, аттракции лейкоцитов, увеличении концентрации провоспалительных цитокинов, моноцитарных хемокинов и прочее [9]. Степень воспалительной реакции коррелируют с тяжестью повреждения мозга и долгосрочным прогнозом исхода ише-мического инсульта [12]. Также в этой области отмечается максимальное количество р53 позитивных клеток, что может быть следствием взаимодействия мембранных рецепторов смерти нейронов и глии с соответствующими лиган-дами на мембране лейкоцитов и реализации в клетках нервной ткани внешних механизмов апоптоза [4].
Выводы. При остром нарушении мозгового кровообращения возникает усиленная пластическая реакция нейронов не только в зоне поражения, но также в отдаленных регионах ипси- и контрлатерального полушария.
Острое нарушение мозгового кровообращения сопровождается повышением числа реактивно измененных нейронов и астроцитов в пе-рифокальной области, а также в отдельных участках ипси- и контрлатерального полушария.
Апоптоз клеток нервной ткани при остром нарушении мозгового кровообращения наиболее выражен в перифокальной области, при этом он также имеет место в определенных участках отдаленных областей ипси- и контрлатерального полушария.
References
1. Гусев Е.И., Камчатнов П.Р. Пластичность нервной Gusev EI, Kamchatnov PR. Plastichnost' nervnoy sis-системы // Журнал неврологии и психиатрии. 2004. temy [The plasticity of the nervous system] Zhurnal Т. 104. С. 3. nevrologii i psikhiatrii. 2004;104:3. Russian.
2. Гусев Е.И., Скворцова В.И., Стаховская Л.В. Пробле- Gusev EI, Skvortsova VI, Stakhovskaya LV. Problema ма инсульта в Российской Федерации: время актив- insul'ta v Rossiyskoy Federatsii: vremya aktivnykh ных совместных действий // Журнал неврологии и sovmestnykh deystviy [The problem of stroke in the психиатрии им. СС Корсакова. 2007. Т. 107, № 8. Russian Federation: the time of active joint actions]. С. 4-10. Zhurnal nevrologii i psikhiatrii im. SS Korsakova.
2007;107(8):4-10. Russian.
3. Мыцик А.В., Акулинин В.А., Степанов С.С., Ларио- Mytsik AV, Akulinin VA, Stepanov SS, Larionov PM. нов П.М. Влияние ишемии на нейроглиальные Vliyanie ishemii na neyroglial'nye vzaimootnosheniya взаимоотношения лобной коры большого мозга lobnoy kory bol'shogo mozga cheloveka [Effect of человека // Омский научный вестник. 2013. Т.118, ischemia on the relationship neuroglial large human
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2016 - V. 23, № 3 - P. 130-135
№ 1. C. 74-77.
4. Broughton B.R.S., Reutens D.C., Sobey C.G. Apoptotic mechanisms after cerebral ischemia // Stroke. 2009. T. 40, № 5. C. e331-e339.
5. Iadecola C., Anrather J. The immunology of stroke: from mechanisms to translation // Nature medicine. 2011. V. 17, № 7. P. 796-808.
6. The effect of spatial learning on the number of astrocytes in the CA3 subfield of the rat hippocampus / Ja-hanshahi M. [et al.] // Singapore medical journal. 2008. T. 49, № 5. C. 388.
7. Johansson B.B. Neurorehabilitation and brain plasticity // J Rehabil Med. 2003. №35. P. 1-7.
8. Microglia and central nervous system immunity / Kaur G. [et al.] // Neurosurgery Clinics of North America. 2010. T. 21, № 1. C. 43-51.
9. Experimental stroke induces massive, rapid activation of the peripheral immune system / Offner H. [et al.] // Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 2006. T. 26, № 5. C. 654-665.
10. Astrocyte-neuron lactate transport is required for long-term memory formation / Suzuki A. [et al.] // Cell. 2011. T. 144, № 5. C. 810-823.
11. Ward N.S., Cohen L.G. Mechanisms underlying recovery of motor function after stroke // Archives of neurology. 2004. T. 61, № 12. C. 1844-1848.
12. The temporal profile of inflammatory markers and mediators in blood after acute ischemic stroke differs depending on stroke outcome / Worthmann H. [et al.] // Cerebrovascular Diseases. 2010. T. 30, № 1. C. 85-92.
13. Immunocytochemistry of neuron specific enolase (NSE) in the rat brain after single and repeated epileptic seizures / Yardimoglu M. [et al.] // International Journal of Neuroscience. 2009.
brain frontal cortex]. Omskiy nauchnyy vestnik. 2013;118(1):74-17. Russian.
Broughton BRS, Reutens DC, Sobey CG. Apoptotic mechanisms after cerebral ischemia. Stroke. 2009;40(5):e331-9.
Iadecola C, Anrather J. The immunology of stroke: from mechanisms to translation. Nature medicine. 2011;17(7):796-808.
Jahanshahi M, et al. The effect of spatial learning on the number of astrocytes in the CA3 subfield of the rat hippocampus. Singapore medical journal. 2008;49(5):388.
Johansson BB. Neurorehabilitation and brain plasticity. J Rehabil Med. 2003;35:1-7.
Kaur G, et al. Microglia and central nervous system immunity. Neurosurgery Clinics of North America. 2010;21(1):43-51.
Offner H, et al. Experimental stroke induces massive, rapid activation of the peripheral immune system. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 2006;26(5):654-65.
Suzuki A, et al. Astrocyte-neuron lactate transport is required for long-term memory formation. Cell. 2011;144(5):810-23.
Ward NS, Cohen LG. Mechanisms underlying recovery of motor function after stroke. Archives of neurology. 2004;61(12):1844-8.
Worthmann H, et al. The temporal profile of inflammatory markers and mediators in blood after acute ischemic stroke differs depending on stroke outcome. Cerebrovascular Diseases. 2010;30(1):85-92. Yardimoglu M, et al. Immunocytochemistry of neuron specific enolase (NSE) in the rat brain after single and repeated epileptic seizures. International Journal of Neuroscience. 2009.
