CC BY
339
Новые технологии
Вестник ДВО РАН. 2014. №1
УДК 577.11:615.324
Т.А. РУЦКОВА, А.А. АРТЮКОВ, Е.В. КУПЕРА, Т.Ю. КОЧЕРГИНА, В .В. МАХАНЬКОВ, Э.П. КОЗЛОВСКАЯ
Некоторые аспекты
комплексной переработки иглокожих
Приведены сведения о наиболее важных исследованиях лаборатории биотехнологии Тихоокеанского института биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН.
Ключевые слова: морские гидробионты, иглокожие, спинохромы, эхинохром А, пурпурогаллин, астаксан-тин, биологически активные пептиды.
Some aspects of complex processing of echinoderms. T.A. RUTSKOVA, A.A. ARTYUKOV, E.V. KUPERA, T.Yu. KOCHERGINA, V.V. MAKHANKOV, E.P. KOZLOVSKAYA (G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS, Vladivostok).
A short review of the most important investigations of the G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry biotechnology laboratory is given.
Key words: marine hydrobionts, echinoderms, spinochromes, echinochrome A, purpurogallin, astaxanthin, biologically active peptides.
Рациональное использование биоресурсов Мирового океана представляет собой актуальную научно-практическую задачу. Морские гидробионты являются ценным возобновляемым пищевым ресурсом. В то же время они могут служить уникальным источником для производства различных по химическому строению и биологической активности природных соединений. Добыча океанического сырья, включающего рыбу, моллюсков, крабов, креветок, морских ежей, голотурий, в настоящее время достигает нескольких миллионов тонн.
Добытые биоресурсы в основном идут на продажу в виде разделанного мяса рыб и других гидробионтов, кормовой муки, и только незначительная их часть реализуется в виде «сурими», белковых изолятов и гидролизатов. В отличие от биологического животного сырья наземного происхождения у морских гидробионтов отсутствуют так называемые потребительские риски - «коровье бешенство», «ящур», «птичий грипп» и их
* РУЦКОВА Татьяна Анатольевна - младший научный сотрудник, АРТЮКОВ Александр Алексеевич - доктор биологических наук, заведующий лабораторией, КУПЕРА Елена Владимировна - научный сотрудник, КОЧЕРГИНА Татьяна Юрьевна - кандидат химических наук, научный сотрудник, МАХАНЬКОВ Вячеслав Валентинович - кандидат химических наук, научный сотрудник, КОЗЛОВСКАЯ Эмма Павловна - доктор химических наук, заместитель директора по научной работе (Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, Владивосток). *E-mail: [email protected]
Работа выполнена при финансовой поддержке и в рамках государственных контрактов: ГК № 16.512.11.2271 от 14.09.2011 г. Федеральная целевая программа «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы» «Биологически активные пептиды морских гидробионтов: получение и исследование функциональных свойств»; ГК № 05.518.11.7069 от 18.04.2007 г. «Разработка технологий воспроизводства и безотходной переработки морского ежа Scaphechinus mirabilis с использованием УСУ «Морская экспериментальная станция Тихоокеанского института биоорганичесой химии Дальневосточного отделения Российской академии наук»; ГК № 02.522.11.2013 от 21.06. 2007 г. «Разработка технологий и выпуск опытных партий биологически активных субстанций из морских организмов в качестве основы новых лекарств и пищевых добавок для коррекции оксидативного и иммунного статусов, липидного и углеводного обменов»; НИР ФГУП «Гостехстрой» (шифр «Комплекс-Т») «Разработка методов получения средств коррекции работоспособности на основе веществ природного происхождения или идентичных им соединений».
генетические модификации. Все это способствует повышению спроса на возобновляемые морские биоресурсы и, как следствие, развитию технологий их переработки.
При обработке промысловых видов морских гидробионтов до 60 % от массы улова составляют отходы, которые в настоящее время используют в основном для получения рыбного жира, удобрений, кормов для животных [23]. Однако большинство этих продуктов имеют низкую экономическую значимость. В результате исследований последних десятилетий в отходах идентифицировано большое количество биологически активных компонентов - пептидов, олигосахаридов, жирных кислот, ферментов, природных пигментов и микроэлементов [24, 25]. В дальнейшем эти биологически активные соединения могут быть выделены и очищены с использованием современных технологий.
Иглокожие: разработка комплексной технологии переработки морских ежей, звезд и голотурий
В настоящее время ни у кого не вызывает сомнения тот факт, что отходы промышленной переработки морских организмов, в особенности беспозвоночных (моллюсков, иглокожих, ракообразных) и водорослей, представляют ценное сырье для получения биологически активных веществ (БАВ) различной химической природы. Эти биологически активные вещества могут эффективно использоваться для профилактики и лечения различных заболеваний иммунной, сердечно-сосудистой и костно-мышечной систем, а также для коррекции липидного и углеводного обмена.
В лаборатории биотехнологии ТИБОХ ДВО РАН разрабатываются технологии получения биологически активных веществ из отходов рыбоперерабатывающей промышленности, промысловых и непромысловых гидробионтов и морских растений. В частности, разработаны и реализованы на производстве несколько технологий комплексной переработки различных представителей семейства иглокожих (рис. 1).
Рис. 1. Схема комплексной переработки морских гидробионтов семейства Echinodermata
Как правило, процесс создания новых технологий проходит следующие стадии:
1. Разработка способов и лабораторных регламентов получения БАВ и их композиций;
2. Наработка экспериментальных партий БАВ и их композиций для проведения исследовательских испытаний;
3. Тестирование физико-химических свойств БАВ и их композиций;
4. Обоснование выбора функциональных свойств (ФС), определяемых при характеристике БАВ и их композиций исходя из задач, решаемых с помощью предлагаемого метода получения;
5. Разработка программ и методик исследовательских испытаний по тестированию ФС БАВ и их композиций, в том числе создание моделей и разработка методик и протоколов тестирования ФС БАВ и их композиций;
6. Тестирование ФС БАВ и их композиций;
7. Разработка технологии комплексной переработки морских гидробионтов с целью получения БАВ и их комплексов;
8. Создание на основе БАВ и их композиций биологически активных добавок к пище (БАД);
9. Разработка нормативно-технической документации на БАВ и БАД;
10. Подготовка заявки на получение патента.
Морские ежи: разработка технологии получения спинохромов и создание на их основе лекарственных и профилактических препаратов
В биоценозах дальневосточных морей широко распространены представители иглокожих класса Echinoidea (морские ежи). Особый интерес представляют исследования по использованию этих гидробионтов для получения биологически активных веществ и лекарственных препаратов на их основе. Некоторые виды морских ежей являются промысловыми, в частности Strongylocentrotus nudus и S. intermedius. В качестве пищевого продукта используют в основном гонады этих шаровидных ежей, биомасса которых составляет примерно 10 % от общей. Отходы промышленной переработки (панцири и иглы) и непромысловые виды морских ежей могут служить богатым источником уникальных биологически активных веществ. В первую очередь это относится к полигидроксинафто-хиноновым пигментам панцирей и игл морских ежей - спинохромам, обладающим анти-оксидантной активностью.
Исследованиями выявлена ценная особенность спинохромов - множественность механизмов, по которым они способны осуществлять свое антиокислительное действие. К ним относятся перехват свободных радикалов, хелатирование металлов - катализаторов пероксидации, способность регулировать активность некоторых ферментов, в том числе липоксигеназ, во многом определяющих окислительный статус клеток организмов [26, 28, 32].
Перечисленные особенности механизма действия выделяют пигменты морских ежей из ряда известных биоантиоксидантов и открывают перспективу для создания на их основе лекарственных препаратов и БАД нового поколения с широким спектром действия.
В конце 1990-х годов коллектив, в который вошли исследователи нескольких лабораторий ТИБОХ ДВО РАН и Всесоюзного кардиологического научного центра, приступил к созданию новых кардиологических средств на основе одного из пигментов морских ежей - эхинохрома А (ЭХА). Разработкой технологии получения этого соединения и организацией его опытно-промышленного производства занималась лаборатория биотехнологии института.
В результате было разработано и запатентовано несколько способов получения 2,3,5,7,8-пентагидрокси-6-этил-1,4-нафтохинона (эхинохрома А) из плоских морских ежей Scaphechinus mirabilis [6, 7], в том числе из консервированного сырья [8]; способ консерви-
рования также предложен нами [4]. При участии сотрудников лаборатории биотехнологии разработан «Опытно-промышленный регламент на производство Эхинохрома».
Сущность способа получения ЭХА из морских ежей S. mirabilis заключается в последовательной экстракции целевого продукта. Промытое сырье обрабатывают органическим растворителем, смешивающимся с водой, для удаления остатков воды и части органических веществ. Затем проводят экстракцию органическим растворителем, не смешивающимся с водой, для удаления веществ липидной природы. Обработанное сырье подвергают кислотной экстракции водным раствором неорганической кислоты в органическом растворителе не менее 2 раз. Полученный экстракт, содержащий ЭХА, очищают от примесей последовательно жидкостной экстракцией хлороформом и кристаллизацией из органического растворителя. Окончательную очистку проводят вакуум-сублимацией кри-сталлосольвата при температуре около 220°С. Технический результат - получают ЭХА чистотой более 98,0 %.
В настоящее время в ТИБОХ ДВО РАН при сотрудничестве с ведущими медицинскими центрами на основе эхинохрома А разработаны лекарственные препараты кардиопро-тективного и офтальмологического действия, которые выпускаются под торговой маркой «Гистохром®» [14, 15].
«Гистохром®» - антиоксидантный препарат, стабилизирующий клеточные мембраны [27]. В медицинской практике нашел применение в качестве корректора избыточной активации перекисных процессов в сердечно-сосудистой хирургии, также используется для проведения лечения, направленного на восстановление коронарного кровотока в неотложной кардиологии [13]. В офтальмологии «Гистохром®» может быть применен при заболеваниях, связанных с нарушением обменных процессов сетчатки, сосудистой оболочки и роговицы [17].
Кроме того, на основе ЭХА разработаны и выпускаются биологически активные добавки к пище «Тимарин», «Марихит» и «Хитохром С» [1, 2]. Указанные добавки прошли клиническую апробацию в Приморском кардиологическом центре и на базе Медобъеди-нения ДВО РАН (г. Владивосток), где подтвердили свою эффективность как препараты метаболической коррекции [16, 21].
С целью расширения спектра биологически активных веществ, а также утилизации отходов переработки промысловых иглокожих в лаборатории биотехнологии ТИБОХ ДВО РАН разработаны способы получения спинохрома Е (2,3,6,7-тетрагидроксинафта-зарина), спинохрома А и белка морских ежей, взаимодействующего с полигидроксинаф-тохиноном, из панцирей и игл морских ежей S. nudus. Способы защищены патентами РФ [10, 11].
Морские ежи: разработка технологии получения комплекса антиоксидантов
Одним из известных и широко применяемых антиоксидантов является пурпуро-галлин - 2,7,8,9-тетрагидроксибензотрополон (ППГ). Известно, что I II II может являться эффективным цитопротектором для клеток печени, почек и сердца [29-31], подвергнутых воздействию гидроксил-радикала. Селективность ППГ как антиоксиданта обусловлена тем, что он является ловушкой для супероксид анионов, пероксида водорода или гидро-ксил-радикалов. Эффективность ППГ и его гликозидов намного выше, чем в случае применения таких широко известных антиоксидантов, как «Тролокс» и аскорбиновая кислота [31]. ППГ не токсичен и устойчив в кровотоке в нативном состоянии в течение нескольких недель. На основе пурпурогаллина могут быть созданы лекарственные препараты для лечения заболеваний, вызванных оксидативным стрессом.
Известно, что синтез ППГ происходит за счет энзиматического окисления пирогаллола в присутствии перекиси водорода [22]. Мы предположили, что ППГ можно получать
Рис. 2. Содержание пурпурогал-лина и эхинохрома А в кислом водно-спиртовом экстракте панциря морского ежа S. mirabilis после инкубации в биореакторе с пирогаллолом в течение 24 ч (анализ методом ВЖХ). ППГ - пурпуро-галлин, ЭХА - эхинохром А
в результате взаимодействия пирогаллола с ферментными системами морских ежей, продуцирующих Н2О2. Действительно, проведенные нами исследования показали, что благодаря своей способности продуцировать Н2О2 морские ежи S. mirabilis при наличии пирогаллола синтезируют ППГ. Как следует из данных высокоэффективной жидкостной хроматографии (рис. 2), в экстракте панциря ежа, инкубированного в морской воде с добавлением пирогаллола, наряду с ЭХА содержится ППГ, который в нормальных естественных условиях не является метаболитом S. mirabilis.
Схематически процесс биосинтеза ППГ в предлагаемых нами условиях может быть представлен в следующем виде (рис. 3).
Способность морских ежей S. mirabilis синтезировать ППГ легла в основу разработанного нами способа одновременного получения двух уникальных антиоксидантов (ППГ и ЭХА), которые могут быть использованы в медицинской и пищевой промышленности в качестве новых лекарственных препаратов и биологически активных пищевых добавок [9]. Обнаруженное нами свойство морских ежей утилизировать полифенольные соединения, накопление которых в морской воде обусловлено рядом техногенных причин, можно рассматривать и как естественный экологический феномен, направленный на сохранение окружающей среды.
Таким образом, морские ежи как промысловых (S. nudus, S. intermedius), так и непромысловых (S. mirabilis) видов могут являться продуцентами и источниками новых эффективных антиоксидантов (ЭХА, спинохромы А и Е, ППГ) [1, 2, 4, 7-11], [1, 2, 6-11], которые могут представлять интерес для практической медицины не только в индивидуальном состоянии, но и в смеси.
Рис. 3. Схема энзиматического окисления пирогаллола в пурпурогаллин в результате взаимодействия с ферментными системами S. mirabilis
Морские звезды: разработка технологии получения комплекса каротиноидов
На сублиторали дальневосточных морей широко распространены морские звезды Раййа рвсйт/вга. В связи с развитием марикультуры эти хищные иглокожие в массовом количестве скапливаются на морских огородах. Необходимость сбора и уничтожения этих хищников позволяет одновременно обеспечить достаточную сырьевую базу для производства каротиноидных препаратов. Основными каротиноидами этих иглокожих являются катаксантины и стереоизомеры астаксантина. Самым эффективным антиокси-дантом среди каротиноидов, улавливающим свободные радикалы и гасящим синглетный кислород, является астаксантин. Он обладает солнцезащитными (УФ-протекторными) и противовоспалительными свойствами, проявляет иммуномодулирующую активность.
В лаборатории биотехнологии разработана универсальная технология комплексной переработки морской звезды Р. рвсШ1/вга (рис. 1) [5]. Сущность метода заключается в последовательном проведении операций обезвоживания, экстракции, хроматографиче-ской очистки на полихроме-1. После хроматографической очистки концентрата экстракта получают комплекс каротиноидов, содержащий преимущественно астаксантин, лютеин, зеаксантин (рис. 4).
Выход целевого продукта составляет 0,8-1,0 % от массы исходного сырья, а содержание в нем астаксантина - до 50 %. Полученный нами комплекс каротиноидов может быть использован для создания профилактических и вспомогательных терапевтических средств
[3, 18].
Рис. 4. Высокоэффективная жидкостная хроматография образцов астаксантина (по оси Х - время удерживания вещества; по оси Y - интенсивность поглощения при 475 нм). А - комплекс каротиноидов P. pectinifera, В -астаксантин (Sigma)
Иглокожие: биологически активные пептиды и создание на их основе профилактических препаратов
Среди морских природных соединений несомненный интерес представляют группы биополимеров, составляющих структурную основу живых организмов и участвующих практически во всех процессах их жизнедеятельности. К таковым относятся
коллагены и белки соединительных тканей. В лаборатории биотехнологии разработан способ получения биологически активных пептидов коллагена из морской звезды P. pectinifera. Морские звезды после экстракции каротиноидов деминерализуют кислотой или растворами разрешенных комплексонов и депротеинизируют раствором едкого натра. Депротеинизированное сырье отмывают дистиллированной водой. Полученные коллаге-новые остовы морской звезды гомогенизируют и гидролизуют комплексом протеолити-ческих ферментов. Затем фермент инактивируют при 80-90 °С. Далее гидролизат фильтруют для удаления негидролизованного коллагена и подвергают ультрафильтрации через мембранный фильтр 30 кДа для удаления деактивированного фермента. Целевой продукт концентрируют и лиофилизируют.
Полученный комплекс пептидов коллагена, содержащий до 86 % пептидов, с высокомолекулярным компонентом (22-23 кДа), обладает противоопухолевой, антикоагулянт-ной, ранозаживляющей, противовоспалительной, антиоксидантной активностью, способностью ингибировать коллагеназу и ангиотензин превращающий фермент (АПФ). По заявке на изобретение «Биологически активные пептиды коллагена морской звезды и способ их получения» в 2013 г. получено положительное решение Роспатента.
С точки зрения новых источников коллагена интересен представитель семейства иглокожих - голотурия Apostichopus japonicus. В лаборатории биотехнологии разработан способ получения средства с антикоагулянтным действием, представляющего собой фрагмент коллагена с молекулярной массой около 12000 Да [20].
Способ заключается в двукратной последовательной обработке гомогенизированного экстракта тела голотурии A. japonicus ферментным препаратом при соответствующих условиях с последующими высаждением кислотой, диализом или ультрафильтрацией на мембране, пропускающей вещества с молекулярной массой 15 кДа, фильтрацией через стерилизующую мембрану и высушиванием.
В качестве протеолитического фермента для гидролиза в описанных выше технологиях может быть использован комплекс «Коллагеназа краба пищевой», содержащий колла-генолитические протеиназы из гепатопанкреаса промысловых видов крабов, получаемый по способу, разработанному в лаборатории [12]. Этот комплекс относится к полиферментным препаратам и может применяться в биотехнологии, медицине, косметологии, ветеринарии, сельском хозяйстве, в научных исследованиях и производстве биохимических реактивов.
Физико-химические свойства и аминокислотный состав
пептидов коллагена из иглокожих
В рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы» разработаны способы получения биологически активных пептидов коллагена морских иглокожих методом биокаталитической конверсии с использованием ферментативного препарата «Коллагеназа КК», созданы опытные партии образцов пептидов коллагена из морской звезды P pectinifera (ПКЗЛ из кукумарии Cucumariajaponica (ПКК) из A. japonicus, из морских ежей S. mirabilis и S. nudus. Результаты изучения их физико-химических и функциональных свойств показали, что полученные препараты являются пептидами различного размера и состава, сохраняющими пространственную структуру нативного коллагена. В композициях ПК всех исследованных видов иглокожих присутствуют низкомолекулярные пептиды (мол. масса > 2000 Да) и аминокислоты. Данные масс-спектрометрического анализа ПКЗ подтверждают наличие пептидов средней молекулярной массы - 5961,2, 7124,8 и 8326,5 Да. Композиция ПКК по данным масс-спектро-метрии содержала более широкий набор пептидов по молекулярной массе. Обнаружено наличие полипептидов с молекулярными массами 24534,9, 13961,5, 11537,7 и 8586,6 Да.
Такой набор пептидов с высокой молекулярной массой, получаемый при гидролизе «Кол-лагеназой КК», характерен для коллагенов голотурий, что подтверждается выделением ранее из голотурии A. japónica полипептида апостатина с мол. массой 12212 Да [20].
Данные масс-спектрометричего анализа также демонстрируют, что ПК иглокожих содержат уникальные аминокислотные последовательности, которые не расщепляются трипсинподобными протеиназами и истинными коллагеназами. Сравнительный анализ аминокислотного состава пептидов, выделенных из различных видов морских гидро-бионтов, свидетельствует о том, что исследованные пептиды морских иглокожих являются фрагментами коллагена, различающимися по аминокислотному составу и значительно отличающимися по этому показателю от композиции пептидов моллюсков и рыб.
Можно предположить, что особенности состава и последовательность аминокислотных остатков в ПК морских иглокожих определяют спектр и эффективность их биологической активности. Полученные пептиды коллагена обладают широким спектром фармакологического действия: антигипертоническим, антитромботическим, антидиабетическим, гепатопротекторным, антиоксидантным, противовоспалительным, ранозаживляющим, противоопухолевым. Их эффект сравним, а в некоторых случаях превосходит действие известных лекарственных средств, широко используемых в практической медицине (кар-сил, каптоприл, гепарин, глибенкламид, индометацин, метилурацил). ПК не токсичны, безопасны при длительном применении и обладают положительными органолептически-ми свойствами [19]. После проведения доклинических испытаний они могут быть рекомендованы для использования в качестве основы при создании лекарственных препаратов (противоопухолевые, антигипертензивные, противовоспалительные, гепатозащитные, ан-тиоксидантные, ранозаживляющие) для лечения заболеваний сердечно-сосудистой, гепа-тобилиарной и костно-мышечной системы и онкологических, а также при производстве косметических средств и функциональных продуктов питания.
Таким образом, исследования показали перспективность комплексного использования океанических ресурсов, а именно представителей семейства Echinodermata, для получения БАВ с целью разработки на их основе лекарственных препаратов, биологически активных добавок, косметических и парафармацевтических средств, функциональных продуктов питания. Препараты, созданные на основе БАВ морского происхождения, обладают уникальным спектром фармакологического действия и могут найти широкое применение на рынке пищевой и фармакологической продукции.
По результатам проведенных исследований получено 11 патентов РФ. В рамках разработки комплексной технологии переработки иглокожих сотрудники лаборатории биотехнологии разработали и оформили следующие нормативно-технические документы:
1. Технические условия (ТУ) «Ежи морские плоские мороженые» ТУ 9253-03802698170-2010; 2. Технологический регламент (ТР) и ТУ «Биологически активная добавка к пище «Марихит» ТУ 9363-007-46862698-2009; Программа и методики (ПиМ) предварительных испытаний лабораторного технологического процесса изготовления опытной партии биологически активной добавки «Марихит» из морских ежей Strongylocentrotus nudus, 9363-075-02698170-2008 ПМ 1; 3. ТУ «Биологически активная добавка к пище «МАРИЛАЙФ» ТУ 9363-079-02698170-2010; 4. ТУ на биологически активные добавки к пище «КСТ-1» ТУ 9363-069-02698170-2009, «КСТ-2» ТУ 9363-075-02698170-2009, «КСТ-3» ТУ 9363-085-02698170-2010; 5. Технологические инструкции и ТУ на биологически активные добавки к пище «Тимарин» - экстракт морского ежа» ТУ 9350-08002698170-2010, «Тимарин К» - экстракт морского ежа» ТУ 9350-081-02698170-2010, «Тимарин С» - экстракт морского ежа» ТУ 9350-082-02698170-2010; 6. Лабораторные регламенты «На производство биологически активных пептидов коллагена морских иглокожих методом биокаталитической конверсии», «На производство композиции пептидов из белков морских гидробионтов методом биокаталитической конверсии», 2012 г.; 7. ПиМ испытаний лабораторных технологических процессов изготовления опытных партий
биологически активных пептидов коллагена морских иглокожих и композиции пептидов из белков морских гидробионтов методом биокаталитической конверсии, 2012 г.; 8. Проект технического задания на выполнение опытно-технологических работ (ОТР) по теме: «Разработка технологии биокаталитической конверсии получения пептидов и их композиций из морских гидробионтов и рекомендаций по их использованию в фармацевтической и косметической промышленности», 2012 г.
ЛИТЕРАТУРА
1. Артюков. А. А., Глазунов В.П., Козловская Э.П., Козловский А.С., Купера Е.В., Руцкова Т. А., Курика А.В., Попов А.М. Биологически активная добавка к пище и способ ее получения: пат. РФ № 2340216; опубл. 10.12.2008, Бюл. № 34.
2. Артюков А.А., Попов А.М., Глазунов В.П., Козловская Э.П., Козловский А.С. Купера Е.В., Руцкова Т. А., Курика А.В., Балаганский А.П. Композиция для коррекции патологических нарушений углеводного и липидного обмена, иммунного и антиоксидантного статуса организма: пат. РФ № 2360683; опубл. 10.07.2009, Бюл. № 19.
3. Артюков А.А., Попов А.М., Кривошапко О.Н., Руцкова Т.А., Купера Е.В., Козловская Э.П. Создание профилактических и вспомогательных терапевтических средств на основе наномолекулярных комплексов биофлавоноидов и ксантофилов // Перспективные направления развития нанотехнологий в ДВО РАН / РАН. Дальневост. отд-ние; Владивосток: ИАПУ ДВО РАН, 2013. Т. 6. С. 191-197.
4. Артюков А. А., Купера Е.В., Руцкова Т. А., Глазунов В.П., Долгих С.Н., Козловская Э.П. Способ консервации плоского морского ежа: пат. РФ 2335127; опубл. 10.10.2008, Бюл. № 28.
5. Артюков А.А., Руцкова Т.А., Купера Е.В., Маханьков В.В., Глазунов В.П., Козловская Э.П. Способ получения каротиноидного комплекса из морских звезд: пат. РФ № 2469732; опубл. 20.12.2012, Бюл. № 35.
6. Артюков А.А., Кочергина Т.Ю., Купера Е.В., Кольцова Е.А., Петухов П.В. Способ получения 2,3,5,7,8-пентагидрокси-6-этил-1,4-нафтохинона: пат. РФ 1508535; опубл. 27.08.1996, Бюл. № 24.
7. Артюков А.А., Купера Е.В., Кольцова Е.А., Кочергина Т.Ю. Руцкова Т.А. Способ получения 2,3,5,7,8-пентагидрокси-6-этил-1,4-нафтохинона: пат. РФ 2283298; опубл. 10.09.2006, Бюл. № 25.
8. Артюков А.А., Козловская Э.П., Купера Е.В., Руцкова Т.А., Балаганский А.П., Глазунов В.П., Маханьков В.В. Способ получения 2,3,5,7,8-пентагидрокси-6-этил-1,4-нафтохинона: пат. РФ 2352554; опубл. 20.04.2009, Бюл. № 11.
9. Артюков А.А., Маханьков В.В., Купера Е.В., Руцкова Т.А., Козловская Э.П. Способ получения пурпурогаллина: пат. РФ № 2396244; опубл. 10.08.2010, Бюл. № 22.
10. Артюков А.А., Купера Е.В., Руцкова Т.А., Глазунов В.П., Курика А.В., Кофанова Н.Н., Козловская Э.П. Способ получения спинохрома А и белка морских ежей, взаимодействующего с полигидроксинафтохиноном: пат. РФ № 2362573; опубл. 27.07.09, Бюл. № 21.
11. Артюков А.А., Купера Е.В., Руцкова Т.А., Маханьков В.В., Глазунов В.П., Козловская Э.П., Кольцова Е.А. Способ получения 2,3,6,7-тетрагидроксинафтазарина: пат. РФ № 2411939; опубл. 20.02.11, Бюл. № 5.
12. Артюков А.А., Мензорова Н.И., Козловская Э.П., Кофанова Н.Н., Козловский А.С., Рассказов В.А. Ферментный препарат из гепатопанкреаса промысловых видов крабов и способ его получения: пат. РФ. 2280076; опубл. 20.07.06, Бюл. № 20.
13. Афанасьев С.А., Вечерский Ю.Ю., Максимов И.В., Марков В.А., Реброва Т.Ю. Кардиопротекторный эффект антиоксиданта гистохрома в кардиологической и кардиохирургической клинике. Томск: STT, 2012. 150 с.
14. Еляков Г.Б., Максимов О.Б., Федореев С. А., Кольцова Е.А., Мищенко Н.П., Глебко Л.И., Красовская Н.П., Артюков А.А. Лекарственный препарат Гистохром для лечения острого инфаркта миокарда и ишемической болезни сердца: пат. РФ 2137472; опубл. 20.09.1999, Бюл. № 26.
15. Еляков Г. Б., Максимов О. Б., Федореев С. А., Кольцова Е.А., Мищенко Н.П., Глебко Л.И., Красовская Н.П., Артюков А. А. Препарат Гистохром для лечения воспалительных заболеваний сетчатки и роговицы глаз: пат. РФ № 2134107; опубл. 10.08.1999, Бюл. № 22.
16. Козловская Э.П., Потапов В.Н., Лупач Н.М., Веселкина Е.Ю., Хлудеева Е.А., Артюков А. А., Курика А.В., Рассказов В.А., Долгих С.Н. Способ коррекции нарушения липидного обмена: пат. РФ № 2337696; опубл. 10.11.2008, Бюл. № 31.
17. Мищенко Н.П., Федореев С.А., Догадова Л.П. Препарат гистохром для офтальмологии // Вестн. ДВО РАН. 2004. № 3. С. 111-119.
18. Попов А.М., Кривошапко О.Н., Артюков А.А. Перспективы клинического применения астаксантина и других оксигенированных каротиноидов // Биофармацевт. журн. 2013. Т. 5, № 5. С. 13-30.
19. Попов А.М., Артюков А.А., Кривошапко О.Н., Штода Ю.П., Руцкова Т.А., Глазунов В.П., Козловская Э.П. Полифункциональные фармакологические свойства пептидов коллагена из морских иглокожих // Биофармацефт. журн. 2012. Т. 4, № 5. С. 5-16.
20. Попов А.М., Артюков А.А, Ли И. А., Глазунов В. П., Кофанова Н.Н., Козловская Э.П. Средство, обладающее антикоагулянтным действием, и способ его получения: пат. РФ № 2302250, опубл. 10.07.07, Бюл. № 19.
21. Потапов В.Н., Лупач Н.М., Веселкина Е.Ю., Хлудеева Е.А., Артюков А.А., Курика А.В., Козловская Э.П., Рассказов В.А., Лукьянов П.А. Способ коррекции эндотелиальной дисфункции: пат. РФ № 2359686; опубл. 27.06.2009, Бюл. № 18.
22. Роговин В.В., Пирузян Л. А., Муравьев Р. А. Пероксидазосомы. М.: Наука, 1977. 270 с.
23. Choudhury G.S., Bublitz C.G. Computer-based controls in fish processing industry // Computerized control systems in the food industry / ed. G.S. Mittal. N.Y.: Marcel Dekker Inc., 1996. P. 513-538.
24. Je J.Y., Park P. J., Kim S.K. Antioxidant activity of peptide isolated from Alaska pollack (Theragra chalcogramma) frame protein hydrolysate // Food Res. Int. 2005. Vol. 38. P. 45-50.
25. Kim S.-K., Mendis E. Bioactive compounds from marine processing byproducts - A review // Food Research International. 2006. Vol. 39. P. 383-393.
26. Kuwahara R., Hatate H., Yuki T., Murata H., Tanaka R., Hama Y. Antioxidant property of polyhydroxylated naphthoquinone pigments from shells of purple sea urchin Anthocidaris crassispina // Food Sci. Technol. 2009. Vol. 42. P. 1296-1300.
27. Lebedev A.V., Ivanova M.V., Levitsky D.O. Echinochrome, a naturally occurring iron chelator and free radical scavenger in artificial and natural membrane systems // Life Sci. 2005. Vol. 76. P. 863-875.
28. Pozharitskaya O.N., Ivanova S.A., Shikov A.N., Makarov V.G. Evaluation of free radical-scavenging activity of sea urchin pigments using HPTLC with post-chromatographic derivatization // Chromatographia. 2013. doi: 10.1007/ s10337-013-2427-5.
29. Wu T.W., Zeng L.H., Wu J., Fung K.P., Weisel R.D., Hempel A., Camerman N. Molecular structure and antioxidant specificity of purpurogallin in three types of human cardiovascular cells // Biochem. Pharmacol. 1996. Vol. 52, N 7. P. 1073-1080.
30. Wu T.W., Zeng L.H., Wu J., Carey D. Purpurogallin - a natural and effective hepatoprotector in vitro and in vivo // Biochem. Cell. Biol. 1991. Vol. 69, N 10/11. P. 747-759.
31. Zeng L.H., Wu T.W. Purpurogallin is a more powerful protector of kidney cells than Trolox and allopuranol // Biochem. Cell Biol. 1992. Vol. 70, N 8. P. 684-690.
32. Zhou D.Y., Qin L., Zhu B.W., Wang X.D., Tan H., Yang J.F, Li D.M., Dong X.P., Wu H.T, Sun L.M., Li X.L., Murata Y. Stability of polyhydroxylated 1,4-naphthoquinone pigment recovered from spines of sea urchin Strongylocen-trotus nudus // Food Chem. 2011. Vol. 129. P. 1591-1597.
