CC BY
210
Неизвестные условно-патогенные бактерии представители микрофлоры человека как возможные возбудители пневмонии
Г.В. Тец, Д.С. Викина, М.Ф. Вечерковская, А.А. Доморад, В.В. Харламова, В.В. Тец
Идентификация микроорганизмов, представляющих нормальную микрофлору ротовой полости, является актуальной проблемой пульмонологии. Некоторые представители микрофлоры ротовой полости человека являются возбудителями заболеваний респираторного тракта, а плохое состояние полости рта, болезни зубов и десен увеличивают риск возникновения пневмонии. Недостаточная изученность нормальной микрофлоры связана с отсутствием методов культивирования, обеспечивающих выделение чистых культур этих микробов. Целью работы было изучение смешанных микробных биопленок в нормальной микрофлоре ротовой полости, выявление и идентификация малоизученных или неизвестных ранее аэробных условно-патогенных бактерий, способных вызывать заболевания бронхолегочной системы, а также оценка их устойчивости к антибиотикам.
Ключевые слова: малоизученные бактерии, условно-патогенные бактерии, микробиота ротовой полости, смешанные биопленки.
Введение
Расширение представлений о роли бактерий в возникновении патологических процессов различной локализации потребовало детального изучения и идентификации состава нормальной микрофлоры человека (микробиота). Выявлено, что среди бактерий, обитающих в организме человека, много условно-патогенных, способных вызывать заболевания различной локализации, возникновение которых связано с внешними воздействиями, например стоматологическими процедурами, или снижением уровня иммунной защиты организма [1]. Известно, что представители микрофлоры ротовой полости могут вызывать пневмо-
Георгий Викторович Тец - канд. мед. наук, зав. лабораторией инновационных программ и методов исследований НПЦ “Стоматология”.
Дарья Сергеевна Викина - врач-ординатор кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Санкт-Петербургского государственного медицинского университета (СПбГМУ) им. акад. И.П. Павлова.
Мария Федоровна Вечерковская - врач-исследователь кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова.
Анна Абрамовна Доморад - канд. биол. наук, ст. науч. сотр кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова.
Виктория Валентиновна Харламова - студентка IV курса СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова.
Виктор Вениаминович Тец - профессор, зав. кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова.
нию [2-4]. Плохое состояние полости рта, болезни зубов и десен увеличивают риск пневмонии. Существует очевидная и опасная корреляция между наличием заболеваний ротовой полости и респираторными инфекциями. Установлено, что заболевания пародонта связаны с развитием различных поражений органов дыхания, таких как внеболь-ничные и внутрибольничные пневмонии, вентилятор-ассо-циированные пневмонии и внебольничные пневмонии в учреждениях закрытого типа (домах престарелых) [2, 3]. Последний тип пневмонии распространен среди пожилых обитателей домов-интернатов для престарелых и по клиническим признакам более близок к внебольничной пневмонии, нежели к нозокомиальной.
Несмотря на значимость для медицины, микроорганизмы, обитающие в ротовой полости человека, остаются недостаточно изученными: считается, что мы знаем от 5 до 30% микроорганизмов нормальной микрофлоры. Трудности в ее изучении связаны прежде всего с отсутствием методов культивирования. Последнее определяется организацией жизни бактерий в биопленках, которая подразумевает гораздо большую взаимозависимость микроорганизмов и создает им условия, пока невоспроизводимые в лаборатории [4, 5]. При изучении генов микробиоты выявлено, что в число неизученных и практически неизвестных входят различные бактерии, археи, грибы и вирусы.
Цель исследования: выявление и идентификация в нормальной микрофлоре ротовой полости человека малоизученных или неизвестных ранее аэробных условно-пато-
N
генных бактерий, которые могут вызывать поражения различных отделов дыхательной системы.
Материал и методы
Материалом для исследования являлась слюна людей в возрасте от 19 до 60 лет. Слюну собирали в стерильные пробирки и в течение 1 ч после забора материала делали высевы.
Для выделения бактерий использовали жидкие и ага-ризованные питательные среды: бруцелла-агар, эндоагар, кровяной агар, агаризованную среду LB (bioMerieux, Франция). Колонии анализировали по характеру роста, морфологии и изменениям свойств среды.
Для изучения бактерий использовали методы окраски по Граму и световой микроскопии (микроскоп Olympus BX51 TF (Olympus Corp., Япония), Digital Microscope Camera ProgRes CF), программу для компьютера Jenoptik (Германия), Camera adapter (Projection lens) U-TV0.63X-C, Sensor CCD, Color 2/3''. Чистые культуры идентифицировали по биохимической активности с помощью автоматической системы Vitec-2 (BioMerieux). Чувствительность к антибиотикам определяли с использованием панели Vitec-2.
Результаты и обсуждение
Использованный метод культивирования позволил получить смешанные биопленки, похожие по морфологии на обычные колонии, образованные бактериями одного вида (рис. 1), включающие от 2 до 8 различных бактерий (рис. 2). Чистые бактериальные культуры в данных условиях культивирования в первом высеве практически не были обнаружены.
По организации выявленные биопленки были идентичны смешанным микробным сообществам, полученным нами ранее экспериментально [6, 7].
В результате рассевов на разные среды некоторые смешанные биопленки удалось разделить и получить из них чистые культуры бактерий, пригодные для идентификации. Вместе с тем большинство из смешанных биопленок разделить в имеющихся условиях не удалось. Они оказались устойчивыми сообществами, которые выдерживали многократные (более 10) пересевы на аналогичные среды. Образование на питательных средах большого числа разнообразных смешанных биопленок свидетельствует о существовании в микробиоте тесного взаимодействия между различными неродственными бактериями. Устойчивое воспроизведение смешанных бактериальных биопленок и невозможность получения чистых культур указывают на выраженный мутуализм бактерий нормальной микрофлоры. При таком взаимодействии каждый вид бактерий получает от другого вида дополнительные факторы, которые не может выработать самостоятельно. Очевидно, что эти факторы отсутствуют и в использованных нами питательных средах.
Часть бактерий, изолированных из смешанных биопленок в виде чистых культур и идентифицированных по био-
Рис. 1. Морфология смешанных биопленок. Все представленные на снимке “колонии” являются смешанными бактериальными биопленками.
Рис. 2. Микроскопия смешанной биопленки. Биопленка включает грамположитель-ные и грамотрицательные бактерии. Окраска по Граму.
химическим тестам с достоверностью 98-99%, принадлежат к известным родам и видам, представители которых являются возбудителями заболеваний человека различной локализации. Вместе с тем они не описаны или малоизвестны как представители нормальной микрофлоры ротовой полости человека.
Среди грамположительных бактерий обнаружен Aerococcus viridans, микроорганизм, относящийся к возбудителям оппортунистических инфекций. Известны заболевания, которые может вызывать A. viridans: менингиты, инфекции мочевыделительной системы и эндокардиты у детей и взрослых, септические артриты и бактериемии. Этот микроорганизм способен распространяться в стационарах и считается возбудителем внутрибольничных (нозокомиальных) инфекций [8]. Другими грам-положительными бактериями оказались различные стафилококки, недавно обнаруженные в ротовой полости: Staphylococcus hominis, Staphylococcus lugdunensis и Staphylococcus warneri, а также Staphylococcus pasteuri и
S. hominis subsp. novobiosepticus, которые ранее в слюне практически не выявлялись [9]. Все эти кокки относятся к возбудителям оппортунистических и нозокомиальных инфекций [10, 11]. Среди стафилококков, выделенных в смешанных биопленках из ротовой полости, S. hominis subsp. novobiosepticus характеризуется выраженной устойчивостью к новобиоцину, налидиксовой кислоте, пенициллину, оксациллину, канамицину и стрептомицину. Известно, что у этого вида также часто встречаются штаммы, устойчивые к эритромицину, клиндамицину, хлорамфениколу сульфаниламидам и ципрофлоксацину [12]. Устойчивость к азалидам (азитромицину), макролидам (эритромицину) и клиндамицину продемонстрировал S. hominis. Другой стафилококк, ранее не описанный в микрофлоре ротовой полости, - Staphylococcus pasteuri был устойчив к эритромицину.
Из слюны были также изолированы чистые культуры грамотрицательных аэробных бактерий. Так, была идентифицирована Pseudomonas putida, известная как представитель микрофлоры воды, почвы и некоторых животных [13]. Описаны случаи заболеваний людей, вызванные P. putida, однако в составе нормальной микрофлоры человека эта бактерия ранее не описана. Другая выявленная псевдомонада - Pseudomonas oryzihabitans обитает в сточных водах и недавно была обнаружена на поверхности языка человека [14, 15]. Грамотрицательная бактерия Klebsiella oxytoca, известная как условно-патогенный микроорганизм, не является типичным представителем нормальной микрофлоры ротовой полости человека и описана как возбудитель оппортунистических инфекций [10]. Выявленные псевдомонады продемонстрировали устойчивость к нитрофуранам (нитрофурантоину) и цефалоспоринам (цефазолину), пенициллинам (ампициллину и амоксицил-лину/клавуланату), фосфомицину, триметоприму/сульфа-метоксазолу, хлорамфениколу и клиндамицину.
Из ротовой полости были также выделены микробы, которые по морфологии похожи на известные бактерии, но по биохимической активности не могли быть достоверно отнесены к представителям идентифицированных родов и видов (сходство не превышало 85%). Бактерии, имеющие сходство с Micrococcus luteus, отличались от известного вида характером роста, размером и формой клеток, пиг-
ментом и другими признаками. Часть бактерий по биохимической активности не могли быть идентифицированы автоматической системой Vitec-2 с последней версией базы данных и отнесены к категории “неидентифицирован-ный организм”.
Носительство условно-патогенных бактерий в ротовой полости считается важным фактором в появлении различных соматических заболеваний [1]. Практически все выделенные и идентифицированные бактерии способны вызывать гнойно-воспалительные процессы и являются потенциальными возбудителями различных заболеваний органов дыхания, и в частности пневмонии. С наличием таких бактерий, не растущих на стандартных лабораторных средах, может быть связана часть случаев неэффективной лабораторной диагностики заболеваний респираторного тракта. Обращает на себя внимание устойчивость выделенных штаммов к различным антибиотикам, что повышает потенциальную опасность этих микроорганизмов.
Таким образом, в ходе исследования выделены смешанные микробные биопленки, из которых изолированы бактерии, неизвестные ранее как представители микробиоты ротовой полости, способные вызывать заболевания бронхолегочной системы человека.
Список литературы
1. Тец В.В. // Стоматология. 2008. № 87(3). С. 76.
2. El-Solh A.A. et al. // Chest. 2004. V. 126. P. 1575.
3. Koeman M. et al. // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2006. V. 173. P. 1348.
4. Lewis K., Epstein S.S. // Microbiology Monographs / Ed. by A. Steinbuchel. Berlin; Heidelberg, 2009. P. 181-194.
5. Epstein S.S. // Microbiology Monographs / Ed. by A. Steinbuchel. Berlin; Heidelberg, 2009. P. 131-150.
6. Tetz V.V. // Microbios. 1994. V. 80. P. 63.
7. Tetz V.V. // Acta Pathol. Microbiol. Immunol. Scand. 1999. V. 107. P. 645.
8. Kerbaugh M.A., Evans J.B. // Appl. Microbiol. 1968. V. 16. P. 519.
9. Ohara-Nemoto Y et al. // J. Med. Microbiol. 2008. V. 57. P. 95.
10. Menard A. et al. // J. Clin. Microbiol. 2010. V. 48. P. 3021.
11. Brennan M.T. et al. // Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod. 2004. V. 98. P. 665.
12. Palazzo I.C.V. et al. // J. Antimicrob. Chemother. 2008. V. 62. P. 1222.
13. Anaissie E. et al. // Am. J. Med. 1987. V. 82. P. 1191.
14. Conti S. et al. // Appl. Oral Sci. 2009. V. 17. P. 375.
15. Kodama K. et al. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 1985. V. 35. P. 467.
N
