CC BY
37
УДК 616.36-006.04-085.277-092.9
С.В. Позднякова, О.Р. Грек, А.С. Фунтиков, Т.В. Данильчева,
Н.А. Жукова, И.В. Сорокина, Т.Г. Толстикова
НЕФРОПРОТЕКТИВНЫЙ ЭФФЕКТ ПРОИЗВОДНЫХ БЕТУЛОНОВОЙ КИСЛОТЫ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ЦИТОСТАТИЧЕСКОМ ПОВРЕЖДЕНИИ ПОЧЕК У КРЫС
ГОУ ВПО Новосибирский государственный медицинский университет;
Клинико-диагностическая лаборатория Муниципальной клинической больницы № 7, Новосибирск; Новосибирский институт органической химии им. Н.Н. Ворожцова СО РАН
Исследованы ренальные эффекты бетулоновой кислоты и двух ее производных в отношении цитостатического повреждения в эксперименте. Установлено, что бетулоновая кислота и два новых тритерпеноида улучшают функциональное и морфологическое состояние почек. Наиболее эффективно 3-оксопроизводное с р-аланином в 28 положении.
Ключевые слова: бетулоновая кислота и ее производные, цитостатическое повреждение, почечно-выделительные пробы, патоморфологические изменения Внедрение в клинику современных цитоста-тических препаратов и применение интенсивных технологий полихимиотерапии позволили существенно повысить эффективность лечения злокачественных опухолей [1]. Вместе с тем, попытки интенсификации лечения могут усиливать токсичность терапии и повышать показатель ранней смертности [2]. Цитотоксическое действие противоопухолевых препаратов на нормальные клетки зачастую является причиной, ограничивающей возможность проведения требуемых протоколами курсов (с учетом использования максимальных доз и межкурсовых интервалов).
Возможности лекарственной профилактики токсического действия остаются крайне ограниченными [3]. В настоящей работе были изучены соединения, полученные в Новосибирском институте органической химии им. Н.Н. Ворожцова СО РАН в результате химической модификации бетулина [4].
Пентациклические тритерпеноиды лупано-вого ряда привлекают внимание исследователей своей высокой и разнообразной биологической активностью, низкой токсичностью и доступностью. Наиболее изученные из них — бетулин, бетулиновая кислота, проявляют противовоспалительную и противовирусную активности, обладают антиоксидантным, иммуностимулирующим, гепатопротекторным, гипохолестеринемическим и селективным цитостатическим действием в отношении ряда опухолей нейроэктодермального происхождения, предотвращают гибель животных при облучении [5, 6]. Фармакологические свойства, найденные у производных бетулина,
делают их привлекательными объектами для синтеза новых лекарственных агентов.
Наиболее доступным производным бетулина является бетулоновая кислота, получаемая из бетулина, отличающаяся от бетулиновой наличием кетогруппы при третьем атоме углерода (С-3) вместо гидроксильной.
Целью исследования явилось изучение влияние бетулоновой кислоты, Зр-оксо-20(29)-лупен-28-овой кислоты (БК) и ее (3-аланин производных — [3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-3 аминопро-
пионовой кислоты (АБК) и метилового эфира [3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-3 аминопропионо-вой кислоты (Э АБК) на выделительную функцию почек у интактных животных и при токсическом повреждении почек у крыс в условиях экспериментальной цитостатической терапии.
Методика исследования
Исследование нефропротекторной активности бетулоновой кислоты и ее производных проводили на 70 крысах линии \Vistar массой 170-200 г (по 10-12 особей в группе). Модель повреждения была создана однократным внутрибрюшинным введением комплекса цитостатиков в дозах равных 1/5 ЛД50, рассчитанных методом графического пробит-анализа: циклофосфан (Олайнский ХФЗ) — 21 мг/кг, доксорубицин-ЛЭНС — 2,1 мг/кг, винкристин-ЛЭНС — 0,04 мг/кг, предни-золон (Гедеон Рихтер) — 2,1 мг/кг массы тела. Исследуемые соединения вводили как интакт-ным животным, так и животным с токсическим повреждением почек ежедневно внутрижелудоч-но с помощью зонда в дозе 50 мг/кг с водной нагрузкой 0,25 мл на 100 г массы тела животного.
БЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН, №5 (127), 2007 г.
117
Крысы группы сравнения получали дигидроквер-цетин (ДКВ) в топ же дозе, контрольные животные — эквивалентное количество дистиллированной воды.
Исследования проводили через 1 и 2 недели после начала введения изучаемых соединений. Для оценки выделительной функции почек животных помещали в обменные клетки п собирали мочу в условиях спонтанного диуреза в течение 24 часов. В пробах мочи п крови определяли концентрацию креатинина по цветной реакции Яффе с пикриновой кислотой на спектрофотометре СФ-46. По клиренсу эндогенного креатинина рассчитывали клубочковую фильтрацию и канальцевую реабсорбцию. Животных выводили из эксперимента декаиитациен после эфирного наркоза. Ткань почек исследовали морфологически с помощью световой микроскопии.
Полученные данные обрабатывали статистически. Для оценки достоверности межгрупповых различий использовали критерий I Стыодента. Данные в таблице представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего.
Результаты исследования
Двухнедельное введения БК и ее производных значительно увеличило спонтанный суточный диурез у крыс (Рис. 1а). Объем мочи у животных, получавших БК п ЭАБК в течение 14-и суток, был увеличен в 2,09 п 1,82 раза относительно ии-гактпых животных. Увеличение суточного диуреза в обеих группах было обусловлено только торможением канальцевой реабсорбции на 4,08 п
Диурез
4,5.
|
§ 3,5.
1 3 ' 2,5
4------Т--П---------
3,5----Г1--ТЯ--Й----
ЯВИЙ
Интактные БК АБК ЭАБК ДКВ
2,72% соответственно (Рис. 16). Увеличение , уреза у животных, получавших АБК в 1,77 раз поситсльно интактных животных, было связ; как с уменьшением реабсорбции на 3.99%. та увеличением скорости клубочковой фильтра! относительно первой недели введения на 44.4 (Рис. 16 и 1в). В группе сравнения с двухнеде ным введением ДКВ. изменений суточного , уреза не отмечено.
Суточный диурез у животных, которым в дили комплекс цптостатиков, не изменялся протяжении всех сроков исследования. Вмест тем наблюдали снижение скорости клубочкчл фильтрации на 7-е и 14-е сутки на 41,8 и 54,55“ реабсорбцпн на 7-есутки на 1,95% (Рис.26и2в) носительно интактных животных. Одновремс! в сыворотке крови увеличилось содержание кр тинина в 5,56 и 4,33 раза на 7-е и 14-е сутки, со> ветственно. Несмотря на нарушение фильтрат экскреция креатинина в моче была повышенно 4,19 и 3,89 раз на 7-е и 14-е сутки (Таблица 1).
У крыс, получавших исследуемые соединен после введения комплекса цптостатиков, по] затели креатинана были значительно сниже (Таблица 1). Животных, которых после введен комплекса цптостатиков лечили БК. копцент) ция креатинина в сыворотке крови была нн> чем у не леченных животных в 2,38 и 1,22 раз, выше контрольных значений. Концентрация К) атпнпна в моче также снизилась, но превыше контрольные значения. Скорость клубочков фильтрации на 7-е сутки была увеличена в !
Реабсорбция воды
100,
99
98
97
96
95
94
93
92
90
*
-
.
...
[] 0 | 7 сут | | 14 сут
Скорость клубочковой фильтрации
Интактные БК АБК ЭАБК ДКВ
Рис. 1. Влияние бетулоновой кислоты и ее производных на выделительную функцию почек у здоровых крыс.
Примечание. * — Статистически значимые различия (р<0,05) с показателями интактных животных. **
— Статистически значимые ра.иичия (р<0,05) с соответствующими показателями на 7-е сутки. БК группа животных, которым проводилось курсовое введение бетулоновой кислотой, ЛИК - алаиинамидпого производного бетулоновой кислоты, ЭАБК -метилового эфира аланинамидного производного бетулоновой кислоты, ДКВ — дегидрокверцетипа.
раз относительно группы крыс с цитостатической моделью. На 14-е сутки она была выше, чем у животных с ПХТ в 2,2 раза и в 2,03 раза контрольных значений (Рис. 2в).
У животных, получавших ЭАБК, концентрация креатинина была снижена в плазме крови на 7-е сутки в 1,9 раз, а в моче на 14-е сутки в 2,17 раз (Таблица 1).
Введение на протяжении 14-и суток АБК крысам с цитостатическим повреждением почек сопровождалось снижением на 7-е сутки концентрации креатинина в сыворотке крови в 1,7 раза и на 14-е сутки — в 2,6 раза. Концентрация креатинина в моче на 7-е сутки снизилась в 2,1 раза, а на 14-е возросла в 2,46 раза относительно такового
показателя на 7-е сутки, что, вероятно, обусловлено повышением скорости клубочковой фильтрации, которая превышала контрольные значения в 2,2 раза при возросшей реабсорбции воды на данный срок.
У животных, получавших ДКВ, наблюдали снижение концентрации креатинина в сыворотке крови в 1,72 и 1,86 раз, обусловленное повышенной фильтрацией в 4,06 и 3,0 раза на 7-е и 14-е сутки увеличенной реабсорбцией воды на 1,8% на 7-е сутки.
Морфологические исследования, проведенные через 14 суток после введения комплекса ци-тостатиков, показали, что под воздействием противоопухолевых препаратов в корковом веществе
Сутки
Время после начала лечения, сут
Рис. 2А . Изменение массы мышей с лимфомой 141.8 Рис. 2Б. Динамика роста первичного опухолевого узла
в период лечебных воздействий в период лечебных воздействий
Рис. 2. Влияние бетулоновой кислоты и ее производных на выделительную функцию почек у животных с цитостатической моделью.
Примечание. # — Статистически значимые различия (р<0,05) с показателями крыс после цитостатического воздействия (ПХТ), ## — Статистически значимые различия (р<0,05) с соответствующими показателями на 7-е сутки; * — Статистически значимые различия (р<0,05) с показателями интактных животных.
ПХТ — полихимиотерапия (группы животных, которым однократно вводили комплекс цитостатических средств), ПХТ+БК — группа животных, которым проводилось курсовое лечение бетулоновой кислотой, ПХТ+АБК — аланинамидым производным бетулоновой кислоты, ПХТ+ЭАБК — метиловым эфиром аланинамидного производного бетулоновой кислоты, ПХТ+ДКВ — дегидрокверцетином.
Таблица 1
Концентрация креатинина у интактных и экспериментальных крыс через одну и две недели после введения комплекса цитостатиков
Концентрация креатинина, мМоль/л Интактные ПХТ ПХТ+БК ПХТ+АБК ПХТ+ЭАБК ПХТ+ДКВ
Номера групп 1 2 3 4 5 6
Через одну неделю (7 суток)
В сыворотке крови 0,09±0,006 0,50±0,03' 0,21±0Д426 0,28±0,04и 0,26±0,00712 0,29±0,00412
В моче 4,28±0,09 17,95±0,44‘ 14,69±0,311'2’6 8,16±0,71126 15,08+0,78' 19,05±0,6*2
Через две недели (14 суток)
В сыворотке крови 0,09±0,006 0,39±0,02‘ 0,24±0,0052 0,15±0,0112 0,18±0,09‘ 0,21±0,0312
В моче 4,28±0,09 16,64±0,37‘ 13,51±0,184и 20,09±1,48236 7,95±1,962в 14,69±0,532
Примечание: ПХТ — полихимиотерапия (группы животных, которым однократно вводили комплекс цитостатических средств), ПХТ+БК — группа животных, которым проводилось курсовое лечение бетулоновой кислотой, ПХТ+АБК — аланинамидым производным бетулоновой кислоты, ПХТ+ЭАБК — метиловым эфиром аланинамидного производного бетулоновой кислоты, ПХТ+ДКВ — дегидрокверцетином. 1,2,3 — результаты достоверны по сравнению с соответствующей номеру группой прир<0,05
Таблица 2
Результаты морфометрического исследования клеток эпителия проксимальных канальцев почек через 14 суток после введения комплекса цитостатиков
Показатель Интактные ПХТ ПХТ+БК ПХТ+АБК ПХТ+ЭАБК ПХТ+ДКВ
Номера групп 1 2 3 4 5 6
Дистрофические изменения (\\,%) 0,35±0,10 13,14±0,38‘ 3,63±0,262 4,53±0,2012 4,11±0,181'2 4,88±0,3812
Некротические изменения (Уу,%) 0,18±0,07 0,58±0,06> 0,51+0,07* 0,24+0,05'2 0,23+0,05*2 0,26±0,0412
Диаметр сосудистого клубочка, 2,97±0,04 2,92+0,04 2,61+0,04 2,88+0,03 2,85±0,05 3,04±0,04
Просвет капсулы, 0,32±0,01 0,09±0,011 0,26+0,042 0,26+0,012 0,14±0,01 0,23±0,022
Примечание: ПХТ — полихимиотерапия (группы животных, которым однократно вводили комплекс цитостатических средств), ПХТ+БК — группа животных, которым проводилось курсовое лечение бетулоновой кислотой, ПХТ+АБК — аланинамидым производным бетулоновой кислоты, ПХТ+ЭАБК — метиловым эфиром аланинамидного производного бетулоновой кислоты, ПХТ+ДКВ — дегидрокверцетином. 1,2,3 — результаты достоверны по сравнению с соответствующей номеру группой при р<0,05
почек развивались альтеративные процессы как в паренхиматозном компоненте, так и элементах клубочкового фильтра. На гистологических срезах отмечали полнокровие сосудов, отек интерс-тиция, расширение мезангия, сужение просвета капсулы Шумлянского-Боумена, дистрофические и атрофические изменения эпителиоцитов канальцев. На всем протяжении канальцевой системы, в том числе и в собирательных трубках, расширенный просвет заполнен белково-клеточными массами, встречаются гиалиновые цилиндры. Оценка влияния изучаемых соединений на альтеративные процессы в почках, вызванные комплексом цитостатиков, показала, что изучаемые вещества существенно ослабляли нефроток-сическое действие цитостатических препаратов.
На 14-е сутки постцитостатического периода у животных со спонтанной регенерацией объемная плотность нефроцитов, находящихся в состоянии дистрофии, превышала контрольные значения в 37,5 раза, в состоянии некроза — в 3,2 . Просвет капсулы сужен и составлял лишь 27,13% от контрольных значений (Таблица 2).
Введение крысам изучаемых соединений приводило к снижению объемной плотности нефроцитов в состоянии вакуольной дистрофии по отношению к таковому показателю группы животных со спонтанной регенерацией. На фоне БК объемная плотность нефроцитов проксимальных канальцев в состоянии дистрофии уменьшилась на 72,37%, на фоне АБК — на 65,53%, ЭАБК
— на 68,72%, препарат сравнения ДКВ — на 62,86. Объемные плотности зон некрозов снижались у животных, получавших АБК — в 2,4 раза, ЭАБК
— в 2,5 раза, ДКВ — в 2,23 раза, тогда как использование самой Б К не приводило к существенному снижению данного показателя. Изучаемые препараты, кроме ЭАБК, способствовали восстановлению просвета капсулы (Таблица 2).
Таким образом, отмеченные динамические улучшения показателей функции почек крыс, получавших исследуемые соединения, имеют морфологическое подтверждение. Введение бетулоновой кислоты и, особенно, ее аланинамидных производных, в течение двух недель уменьшает признаки токсического нефроза и значительно улучшает показатели функции почек, оказывая позитивное влияние на выделительную функцию нефрона. Патоморфологические изменения в клубочках и нефроцитах у крыс с экспериментальным цитотоксическим нефрозом, получавших бетулоновую кислоту и ее производные, выражены значительно меньше, что служит основанием для дальнейшего изучение нефропротекторных свойств производных бетулоновой кислоты.
Работа выполнена в рамках Интеграционной СО РАН (№146) «Разработка лекарственных и профилактических препаратов для медицины. Фундаментальные основы их реализации».
THE NEPHROPROTECTOR AFFECTS OF BETULONIC ACID DERIVATIVES WITH EXPERIMENTAL CYTOSTATIC RENAL DISORDER IN RATS
Pozdnyakova S.V., Grek O.R., Funtikov A. S., Danilcheva T.V., Zhukova N.A., Sorokina I.V., Tolstikova T.G.
The renal affect of betulonic acid and its two derivatives were investigated with experimental cytostatic disorder. It was found that the betulonic acid and two new triterpinoides improve the functional and morphological state of kidney. The results show good prospects for the use 3-[3-oxo-20(29)-lupen-28-oulamino]-propionic acid.
Литература
1. Введение в фармакотерапию злокачественных опухолей / М.Л. Гершанович, В.А. Филов, М.А. Акимов и др. — С-Пб, 1999. — 152 с.
2. Токсикология противоопухолевых препаратов / М.Л. Гершанович, А.Н. Стуков, М.А. Акимов и др. // Токсикол. вестник. — 1995. — № 5. — С. 6-14.
3. Птушкин В.В. Современные методы поддерживающего лечения при проведении химиотерапии / В.В. Птушкин — М., 1998. — С. 19-20.
4. Синтез производных бетулоновой кислоты, со-
держащих аминокислотные фрагменты / Н.И. Петренко, Н.В. Еланцева, В.З Петухова и др. // Химия природных соединений. — 2002. — № 4. — С. 276-283.
5. Differentiation and apoptosis activity of pentacy-clic triterpenes on mouse melanoma cell line / K. Hata, , K. Hori, S. Takahashi //J. Nat. Prod. - 2002. - Vol. 65.
- P. 645-648.
6. Discovery of betulinic acid as a selective inhibitor of human melanoma that function by induction of apoptosis / E. Pisha, H. Chai, I.-S. Lee et al. // Nature Medicine.
- 1995. - Vol. 1. - № 10. - P. 1046-1051.
