CC BY
65
© ВОЛКОВА М.В., 2012
НЕДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫЙ АРТРИТ: ВОЗМОЖНОСТИ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ИСХОДОВ НА ОСНОВЕ ОЦЕНКИ СЫВОРОТОЧНОЙ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕАЗНОЙ АКТИВНОСТИ
ВОЛКОВА М.В.
У О «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет»,
кафедра госпитальной терапии
Резюме. Проведено исследование сывороточной ДНК-азной активности у пациентов с недифференцированным артритом. Выполнено проспективное наблюдение за исследуемой группой в течение 12 месяцев с оценкой исходов недифференцированного артрита. На основании исходов пациенты стратифицированы на 3 группы: пациенты, у которых развился ревматоидный артрит; выздоровевшие и пациенты, у которых развился реактивный артрит.
Уровни сывороточной ДНК-азной активности в группе пациентов, у которых развился ревматоидный артрит, статистически значимо (р<0,01) превышали значения ДНК-азной сывороточной активности в группе пациентов, у которых развился реактивный артрит, и выздоровевших лиц.
Выявление у пациентов с недифференцированным артритом повышенной сывороточной ДНК-азной активности является вероятным предиктором развития хронического воспалительного процесса в суставах и трансформации в ревматоидный артрит.
Ключевые слова: недифференцированный артрит, нуклеазная активность, сыворотка крови.
Abstract. The investigation of serum DNase activity in patients with undifferentiated arthritis was performed. We conducted prospective study within 12 months with the assessment of the outcomes of undifferentiated arthritis. On the basis of the outcomes patients from the studied group were divided into 3 subgroups: patients in whom rheumatoid arthritis developed, the recovered persons and patients in whom reactive arthritis developed.
The levels of serum DNase activity in patients with rheumatoid arthritis were significantly (p<0,01) higher than the values of serum DNase activity in patients with reactive arthritis and the recovered persons.
The revealing of elevated serum DNase activity in patients with undifferentiated arthritis is a probable predictor of chronic inflammatory process development in the joints and its transformation into rheumatoid arthritis.
Термин «недифференцированный артрит» (НдА) был введен Лейденовской клиникой раннего артрита в Нидерландах, ког-
Адрес для корреспонденции: 210023, г.Витебск, пр-т Фрунзе, 27, Витебский государственный медицинский университет, кафедра госпитальной терапии, тел. 8 (0212) 22-40-83 - Волкова М.В.
да возникла необходимость описывать случаи воспалительного артрита, который не соответствовал критериям ни одного заболевания.^]. В настоящее время диагноз НдА остается диагнозом исключения, и это, безусловно, влияет на терапевтическую стратегию в каждом отдельном случае, порой затрудняя выполнение современной ревматологической
стратегии «treat to target», то есть достижения ремиссии заболевания с помощью доступных в настоящее время терапевтических средств. Поэтому все случаи НдА должны рассматриваться как потенциальные случаи персисти-рующего воспалительного артрита, включая ревматоидный артрит [16].
Ранняя диагностика ревматоидного артрита (РА) в настоящее время является одной из главных целей современной ревматологии, так как установленный в ранние сроки (первые 3-6 месяцев) диагноз позволяет определить терапевтическую стратегию и повлиять на природу заболевания, что, в свою очередь, предотвратит повреждение суставов и нарушения функциональной деятельности пациента. В многочисленных исследованиях подчеркивается важность ранней агрессивной терапии РА и преимущества данной стратегии [8,13,17]. В девяностых годах 20-го столетия для решения задачи ранней диагностики и назначения лечения артрита во всем мире были сформированы когорты пациентов с ранними артритами. Частота встречаемости НдА в данных когортах варьировала от 23% до 81%. Частота трансформации НдА в РА составляла от 13% до 54%, а 20-60% случаев НА заканчивались выздоровлением [16].
Многочисленные исследования в настоящее время направлены на поиски предикторов РА, так как это позволило предсказать развитие заболевания и вовремя предпринять профилактические меры. На роль предикторов РА в первую очередь претендуют показатели системы иммунитета: аутоантитела, ци-токины, а также биологические молекулы, задействованные в регуляции жизненного цикла клетки, факторы транскрипции и трансляции, факторы роста, внутриклеточные ферменты и т.д. Согласно литературным данным, исследование крови пациентов с НдА на наличие антител к циклическому цитруллини-рованному пептиду (АЦЦП) и ревматоидного фактора (РФ) может быть использовано для прогнозирования трансформации НдА в РА [4]. В то же время некоторые авторы отмечают наличие АЦЦП и РФ у пациентов с НдА и сопутствующей аутоиммунной и инфекционной патологией [11].
В последнее время активно изучается роль ферментов, участвующих в процессе деградации ДНК - ДНКаз. Представляют интерес исследования ДНКазной активности при системной красной волчанке, так как предполагается участие данных ферментов в этиопа-тогенезе заболевания. [5]. Также обнаружено нарушение деградации ДНК при ревматоидном артрите. [12]. Исследованы генетические предпосылки ДНКазной активности при ревматоидной артрите. [10].
Сывороточная ДНКазная активность в настоящее время изучается как маркер ишемического повреждения миокарда [14].
Ранее нами обнаружено увеличение сывороточной ДНК-азной активности при раннем РА, однако ДНК-азная сывороточная активность при НдА в настоящее время остается неизученной.
Целью нашего исследование явилось исследование уровней сывороточной ДНК-азной активности у пациентов с НдА с целью определения возможного использования ее оценки для прогнозирования исходов НдА.
Методы
В исследовании принял участие 51 пациент с НдА (29 женщин (52,7%) и 26 мужчин (47,3%)), находившийся на стационарном лечении в ревматологическом отделении УЗ «Витебская областная клиническая больница». Средняя длительность болезни пациентов с НдА составила 4,08±2,60 месяца (95%ДИ: 3,135,03). Серопозитивными по РФ были 7 пациентов (13,7%). Средняя величина БАБ28 составила 5,13±1,66 (95%ДИ: 4,52-5,740). На следующий день после госпитализации пациентов проводилось клиническое обследование, выполнялся забор крови из локтевой вены и исследовалась ДНК-азная сывороточная активность. В дальнейшем пациенты наблюдались нами в течение года (через 6 месяцев и через 12 месяцев) с оценкой соответствия имеющихся клинических данных и результатов лабораторного и инструментального обследования классификационным критериям ревматических заболеваний.
Материалом для исследования явилась сыворотка крови пациентов. Метод определения ДНКазной активности сыворотки крови основан на образовании и осаждении сгустка ДНК 2-этокси-6,9-диаминоакридина лактатом (риванолом) [1]. При постановке реакции ДНКазной активности концентрация рабочего раствора ДНК составляла 0,25-0,35 мг ДНК/мл. Для работы использовали рабочее разведение сыворотки 1/5. Постановку реакции проводили в центрифужных пробирках. К 0,1 мл разведенной сыворотки прибавляли 0,2 мл стандартизованного раствора ДНК и 0,1 мл 0,02 М Трис-HCl буфера, содержащего
0,01 М MgCl2 рН 8,3. Пробы ставились в дублях. Для контролей использовался 0,02 М Трис-HCl буфер рН 8,3, не содержащий солей магния, что блокирует ДНКазную активность, а также сыворотка донора, не проявляющая собственной ДНКазной активности в разведении 1/5. Пробы инкубировали при 37°С в течение 2 часов. После инкубации к пробам прибавляли по 20 мкл 0,75% риванола. Проводили визуальный учет реакции в баллах. 0
- отсутствие активности (компактный сгусток); 1- минимальная активность (рыхлый сгусток); 2 - слабая активность (рыхлый сгусток, хлопья, нити); 3 - умеренная активность (хлопья, нити); 4 - высокая активность (распад сгустка, хлопья, нити); 5 - максимальная активность (полный распад сгустка с образованием гомогенной взвеси).
Статистический анализ результатов исследования был выполнен с использованием аналитического пакета Statistica 7.0 и программы MedCalc Statistics 10.2.00. Для проверки нормальности распределения изучаемых признаков применялся тест Колмогорова-Смирнова. Для описания признаков, не имеющих нормального распределения, использовались медиана (Me), размах (Min-Max) и межквар-тильный интервал (25-й и 75-й процентили). Проводилось парное сравнение групп с использованием непараметрического теста для проверки достоверности различий изучаемых признаков в независимых выборках - U-тест Манна-Уитни (Mann-Whitney). Анализ достоверности различий относительных величин выполнялся по критерию х2. Для оценки диаг-
ностической точности разработанных лабораторных тестов выполнялся ROC (Receiver Operator Characteristic) - анализ и проводился расчет операционных характеристик тестов [2].
Результаты и обсуждение
По результатам 12-месячного наблюдения оказалось, что полное выздоровление наступило у 8 пациентов (15,7%), критерии РА развились у 11 пациентов (21,6%), диагноз РеА был установлен у 29 пациентов (56,7%). У одного пациента была диагностирована системная красная волчанка (2%), а у 2 пациентов (4%) в ходе динамического наблюдения диагноз не был верифицирован.
В группе пациентов с установленным диагнозом РА уровень сывороточной ДНКазной активности (5,0 (Min-Max 2,0-5,0) (межквар-тильный интервал 3,5-5,0)) оказался статистически значимо выше (p=0,0029), чем у пациентов с РеА (3,0 (Min-Max 1,0-5,0) (межквартиль-ный интервал 2,0-3,0)), а также выше (p=0,0091), чем у выздоровевших пациентов (2,0 (Min-Max 1,0-5,0) (межквартильный интервал 1,5-2,0)), Не было установлено статистически значимых различий между уровнями ДНКазной активности сыворотки крови у пациентов с РеА и у выздоровевших пациентов (p=0,06). У пациента с системной красной волчанкой была определена наивысшая ДНКазная активность сыворотки крови (5 баллов), а у 2 пациентов без верификации диагноза отмечалась ДНКазная сывороточная активность, равная 2 и 3 балла соответственно. Наблюдения за данными пациентами продолжается.
В ходе выполнения ROC-анализа результатов определения сывороточной ДНК-азной активности оказалось, что пациенты с диагнозом РА, установленным в ходе динамического наблюдения, имели активность равную 4 и более баллов (си^оГГ). При этом чувствительность метода оказалась равной 81,82% (95%ДИ: 48,2-97,2), специфичность - 80,6% (95%ДИ: 64,0-91,8), отношение правдоподобия положительного результата теста (ОП+) -4,21 (95%ДИ: 3,1-5,8), отношение правдоподобия отрицательного результата теста (ОП-)
- 0,23 (95%ДИ: 0,05-0,9).
Согласно рекомендациям Американской коллегии ревматологов [15], наиболее полезными для диагностики ревматических заболеваний являются лабораторные тесты с ОП+>5 и 0П-<0,2; полезными - с ОП+>2 и <5, 0П->0,2 и <0,5; не имеющими пользы - с ОП+<2 и 0П->0,5. Таким образом, операционные характеристики теста диагностики РА из группы НдА на основе определения сывороточной ДНК-азной активности позволяют классифицировать данный тест как полезный для диагностики ревматических заболеваний.
При оценке частот встречаемости высоких уровней ДНКазной активности сыворотки крови (4 балла и более) установлено, что данный уровень активности был характерен для 8 из 11 пациентов с РА, 4 из 29 пациентов с РеА и для 1 из 8 выздоровевших пациентов. При сравнении относительных величин по методу х2 было установлено статистически значимое превышение частот встречаемости высоких уровней ДНК-азной активности сыворотки крови у пациентов с РА по сравнению с пациентами с РеА ((р=0,0003) и выздоровевшими пациентами (р=0,0094), однако анализируемые показатели у пациентов с РеА и выздоровевшими пациентами не различались (р=0,92).
В настоящее активно исследуется влияние ДНК-азной активности сыворотки крови на патогенез таких аутоиммунных заболеваний, как сахарный диабет, заболевания щитовидной железы, системная красная волчанка, а также на патогенез злокачественных процессов [3]. Данные этих исследований неоднозначны, так как авторы используют различные методики для определения ДНКазной активности, при генетическом анализе рассматриваются отдельные последовательности генома, что не позволяет сопоставить полученные результаты. В то же время феномен сывороточной ДНК-азной активности является сложным явлением, в котором участвуют как сывороточные ферменты, так и другие белки сыворотки крови, молекулы межклеточного взаимодействия, компоненты комплемента, клетки крови. ДНК-азная активность сыворотки при различных патологических состояниях остается в настоящее время недостаточ-
но изученной и требует дальнейших исследований в этой области.
При недифференцированных артритах сывороточная ДНК-азная активность прежде не изучалась. Обнаруженные в нашем исследовании взаимосвязи позволяют рассматривать повышение сывороточной ДНК-азной активности как вероятный предиктор развития хронического воспалительного время процесса в суставах, в частности ревматоидного артрита. Данная взаимосвязь может рассматриваться как критерий для назначения базисной терапией метотрексатом при обнаружении ДНК-азной сывороточной активности более 4 баллов согласно нашей методике. Для более тщательного изучения данного факта необходимо увеличить количество исследуемых пациентов, а также провести сравнительный анализ полученных показателей с доступ-ныими рефферентными методами.
Заключение
1. Проведено исследование ДНК-азной активности сыворотки крови у пациентов с недифференцированным артритом, в исследуемой группе выявлена гетерогенность по уровням ДНКазной активности.
2. Установлено статистически значимое превышение частот встречаемости высоких уровней ДНК-азной активности сыворотки крови у пациентов с РА по сравнению с пациентами с РеА ((р<0,01) и выздоровевшими пациентами (р<0,01), однако анализируемые показатели у пациентов с РеА и выздоровевшими пациентами не различались (р>0,05).
3. Тест, разработанный на основе определения ДНК-азной активности сыворотки крови, является полезным для прогнозирования исхода недифференцированного артрита в ревматоидный артрит с чувствительностью метода, равной 81,82% (95%ДИ: 48,297,2), специфичностью - 80,6% (95%ДИ: 64,0-91,8).
Литература
1. Способ определения ДНК-азной активности: пат. 243А Респ. Беларусь, МПК С12 01/34, С 12 N 9/22 / К.С. Азаренок, И.И. Генералов, А.Г. Голубева, Н.В.
Железняк // Открытия Изобрет.- 1996. - № 3. - С. 174.
2. Насонов, Е.Л. Современные стандарты лабораторной диагностики ревматических заболеваний /
E.Л. Насонов, Е.Н. Александрова. - М., 2006. - 70 с.
3. A novel mutation in the DNASE 1 gene is related with protein instability and decreased enzyme activity in thyroid autoimmunity / M. Dittmar [et al.] // J. Autoimmun. - 2009. - Vol. 32, №1. - P. 7-13.
4. Autoantibodies to cyclic citrullinated peptides predict progression to rheumatoid arthritis in patients with undifferentiated arthritis: a prospective cohort study /
F. A. van Gaalen [et al.] // Arthritis Rheum. - 2004. -Vol. 50, № 3. - P. 709-715.
5. Caspase-activated DNase is required to maintain tolerance to lupus nuclear autoantigens / N.R. Jog [et al.] // Arthritis Rheum. - 2011. - Nov 29.doi: 10.1002. -Art. 33448.
6. Comparison of long term outcome of patients with rheumatoid arthritis presenting with undifferentiated arthritis or with rheumatoid arthritis: an observational cohort study / J. van Aken [et al.] // Ann. Rheum. Dis.
- 2006. - Vol. 65, № 1. - P. 20-25.
7. Evaluation of third generation anti-CCP antibodies in the diagnosis of rheumatoid arthritis from undifferentiated polyarthritis after 4 years of follow-up / J.L. Caro-Oleas [et al.] // Clin. Exp. Rheumatol. -2008. - Vol. 26, № 3. - P. 461-463.
8. Firth, J. Rheumatoid arthritis: treating to target with disease-modifying drugs / J. Firth // Br.J. Nurs. - 2011.
- Vol 20, № 19. - P. 1240-1245.
9. Guidelines for immunologic laboratory testing in the rheumatic diseases: an introduction. American college of rheumatology ad hoc committee on immunologic
testing guidelines / A.F. Kavanaugh [et al.] // Arthritis Rheum. - 2002. - Vol. 47. - P. 429-433.
10. Homozygosity for DNASE2 single nucleotide polymorphisms in the 5'-regulatory region is associated with rheumatoid arthritis / M. Rossol [et al.] // Ann. Rheum. Dis. - 2009. - Vol.68, № 9. - P. 1498-503.
11. IgG RF and anti-CCP2 antibody can be positive in undifferentiated arthritis due to streptococcal infection, hepatitis B virus, tuberculosis, trauma and hypothyroidism: a preliminary study / U. Singh // Rheumatol. Int. - 2011. - Jul 26. [Epub ahead of print].
12. Nagata, S. Rheumatoid polyarthritis caused by a defect
in DNA degradation / S. Nagata // Cytokine & Growth Factor Reviews. - Vol. 19, № 3. - P. 295-302.
13. Resman-Targoff, B. H. Aggressive treatment of early rheumatoid arthritis: recognizing the window of opportunity and treating to target goals / B.H. Resman-Targoff, M.P. Cicero // Am. J. Manag. Care. - 2010. -Vol. 16. - Suppl. 9. - P. S249-58.
14. Serum deoxyribonuclease I activity can be a useful diagnostic marker for the early diagnosis of unstable angina pectoris or non-ST-segment elevation myocardial infarction / K. Fujibayashi // J.Cardiol. -2012. - Feb 24. [Epub ahead of print].
15. Shojania, K. What laboratory tests are needed? / K. Shojania // CMAJ. - 2000. - Vol. 162. - P 743-746.
16. Undifferentiated arthritis-disease course assessed in several inception cohorts / K.N. Verpoort [et al] // Clin. Exp. Rheumatol. - 2004. - Vol. 22, №5. - Suppl. 35. - P. S12-7.
17. Wollenhaupt, J. Early and advanced rheumatoid arthritis. Diagnosis and state of the art therapy strategy / J. Wollenhaupt, K. Krbger. // Z Rheumatol. - 2012. -Vol. 71, № 1. - P. 53-61.
Поступила 06.12.2011 г. Принята в печать 02.03.2012 г.
