CC BY
14СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Кальвинш И.Я. Милдронат - механизм действия и перспективы его применения / Рига: Изд. ПАО «Грин-декс», 2001. - 39 с.
2. Люсов В.А. Гемодинамические эффекты милдро-ната в клинике у больных инфарктом миокарда с сердечной недостаточностью и в эксперименте // Экпер. и клин. фармакотер., 1991. - № 19. - С.113-117.
3. Ольбинская Л.М. Применение Милдроната при сердечной недостаточности у больных ишемической болезнью сердца // Клинич. медицина, 1990.-Т.68. -№1. - С.39-42.
4. Сидоренко Б.А. Ишемия миокарда: от понимания механизмов к адекватному лечению // Кардиология, 2000. - №9.-С. 106-119.
5. Linu M., Lechleiter J., Camacho P. Differential modulation of SERCA2 isoforms by calreticulin // J Cell
Biol., 1998. - V. 24. - №142 (4). - P.963-973.
6. Marin-Garcia J. Cellular and molecular events in ischemic preconditioning: potential therapeutic applications in cardioprotection // Future Cardiology, 2005. - Vl. 1. - № 1. - P.111-122.
7. Rupp H., Zarain-Herzberg A., Maisch B. The use of partial fatty acid oxidation inhibitors for metabolic therapy of angina pectoris and heart failure // Herz, 2002. - V. 27. - № 7. - P. 621-636.
8. Sharipova E., Salna E., Dzintare M., Lauberte L., Meirena D., Sjakste N., Gordjushina V., Kalvinsh I. The effect of mildronate and related substances on levels of thyroid hormones and some intermediates of lipid and carbohydrate metabolism in hyperthyroid and hypothyroid rats // Biochemistry (Moscow) Supplemental Series B: Biomedical Chemistry, 2008. - V. 2. - № 2. - P. 169-175.
Ye.А. Kartashova3, I.M. Grushko2, A.V Krishtopa3, M.Yu. Gilyanovsky1, I.V Sarvilina1 Toxiproteomics of propionate 3-(2,2,2-trimethylhydrazinium)
1 Medical Center «Novomeditsina»,2 Regional Clinical Hospital No 1,3 Rostov State Medical University, Rostov-on-Don
A molecular mechanism of the formation of adverse collateral reactions of propionate 3-(2,2,2-trimethylhydrazinium) was established . New diagnostic markers were recommended to prevent collateral adverse reactions of propionate 3-(2,2,2-trimethylhydrazinium) in the clinical practice.
Переработанный экземпляр статьи поступил в редакцию 19.11.09
УДК 615.9:591.88
Научно-методические основы моделирования ртутной токсической энцефалопатии
Статья посвящена проблеме эксперимен- собственных исследований по созданию ртутной
тального моделирования токсической токсической энцефалопатии, вызванной ингаля-
ртутной энцефалопатии. Представлены ционным введением паров металлической ртути.
основные методические подходы к моделирова- Ключевые слова: экспериментальное модели-
нию, критерии и методы оценки патологического рование, токсическая энцефалопатия, металли-
состояния в ЦНС, а также приведены результаты ческая ртуть, ЦНС
Л.М. Соседова
Ангарский филиал Восточно-Сибирского научного центра экологии человека СО РАМН - НИИ медицины труда и экологии человека
Введение. Нейроинтоксикации входят в число наиболее частых причин первичной инвалидиза-ции, в связи с тем, что у значительной части пациентов, перенесших острое воздействие нейроток-сикантов, в последующем отдаленном периоде
сохраняется неврологическая симптоматика, которая в ряде случаев имеет прогредиентный характер с развитием хронически текущего нейро-дегенеративного процесса, существенно снижая качество жизни.
Одним из наиболее распространенных нейро-токсикантов является металлическая ртуть и ее соединения. В условиях возрастания техногенного загрязнения окружающей среды ртутью, низкой производственной и бытовой культуры, случаи профессиональной и экологически обусловленной интоксикации ртутью можно рассматривать как самостоятельное антропогенное явление с высоким риском ущерба здоровью работающих, населения и ликвидаторов очагов загрязнения [9]. Наиболее часто последствием воздействия ртути является токсическая энцефалопатия, характеризующаяся значительной вариабельностью по локализации, степени охвата патологическим процессом тех или иных структур мозга, клинических проявлений и нередким прогрессированием в отдаленном постконтактном периоде [6,7]. Недостаточность информации о патогенезе ртутной токсической энцефалопатии, относительно невысокая эффективность существующих методов реабилитации определяют необходимость изучения механизмов развития патологических процессов в ткани мозга, как на ранних стадиях токсического повреждения, так и в течение относительно длительного периода, что в клинических условиях зачастую неосуществимо.
Учитывая вышесказанное, центральное место в изучении токсической, в том числе и ртутной, энцефалопатии занимают экспериментальные модели на животных. Патогенетические механизмы ртутной нейротоксичности изучались, в основном, после завершения острых или хронических воздействий [7,14]. В то время как экспериментальные исследования, посвященные развитию отдаленных эффектов в постконтактном периоде, сопоставимом у лабораторных животных со временем развития ртутной энцефалопатии в отдаленном периоде у человека (в среднем 8-9 лет), до настоящего времени не проводились. При этом временной фактор имеет существенное значение при анализе результатов экспериментального моделирования, поскольку могут быть весьма существенные различия в направленности и информативности тех или иных тестов в различные сроки с момента создания токсической энцефалопатии.
Целью исследований явилась разработка научно-методических основ экспериментального моделирования ртутной токсической энцефалопатии на белых крысах с оценкой эффектов действия в динамике постконтактного периода.
Материалы и методы исследования. Методологические подходы к моделированию ртутной токсической энцефалопатии. Важной особенностью методологических подходов к экспериментальному моделированию нейроинтоксикаций является адекватность создаваемой модели патологии человека и задачам исследований, допустимость переноса экспериментальных данных с
модели на человека, в совокупности с информативностью и доступностью критериев и методов оценки патологического процесса в центральной нервной системе (ЦНС) лабораторных животных.
В медико-биологических исследованиях критерием, свидетельствующим о правомочности и надежности условий моделирования, служит принцип подобия экспериментальной модели оригиналу [4]. Согласно положению, предложенному Н.Н.Каркищенко (2004), основными критериями являются: пространственное сходство или общность морфо-функциональных характеристик органов и систем у прототипа человека и его биологической модели; единство или сходство метаболических, нейрорегуляторных, двигательных, эндокринных и экзокринных функций; единство или максимальное сходство эффектов критических систем и органов по их реагированию на выбранное исследуемое воздействие; сопоставимость констант или иных параметров качественно оцениваемых и математически описываемых.
При оценке токсических поражений ЦНС использование в качестве тест-объектов грызунов, в частности белых крыс, считается достаточно обоснованным, поскольку молекулярная и клеточная биология их нервных клеток имеет высокую степень гомологии с высшими млекопитающими, в том числе и с человеком, а имбридинг мелких животных гарантирует относительную гомогенность особей [3,13]. Важным преимуществом грызунов являются их относительно низкая себестоимость и возможность проведения экспериментов на достаточно большом количестве животных, что значительно повышает воспроизводимость и статистическую значимость полученных результатов. Учитывая вышесказанное, мы считаем, что перенос экспериментальных данных, полученных при обследовании белых крыс, на человека при моделировании ртутной нейроинтоксикации достаточно обоснован и вполне допустим. При этом соблюдается основное условие моделирования - принцип подобия экспериментальной модели оригиналу, ответную реакцию которого на воздействие металлической ртути и ее соединений, она должна воспроизвести.
Предложенный нами алгоритм экспериментального моделирования ртутной токсической энцефалопатии включает следующие основные положения:
• Определение проблемной ситуации
• Разработка программы экспериментального моделирования
• Проведение экспериментального моделирования
• Динамическая оценка патологических изменений в ЦНС при помощи информативных методов исследования
• Систематизация и обработка полученных результатов исследований
• Проверка воспроизводимости предложенной схемы моделирования
Предшествовать выполнению экспериментального исследования, должна та или иная проблемная ситуация, решению вопросов которой и должно быть посвящено моделирование эффектов нейротоксичности. В целях объективизации роли экспериментального моделирования токсической энцефалопатии следует выделить основные направления, в соответствии с которыми разрабатывается программа токсикологического эксперимента:
• для изучения механизмов формирования патологических процессов в ЦНС при остром, по-достром или хроническом действии соединений ртути
• для изучения патогенетических механизмов прогрессирования поражения ЦНС в отдаленном постконтактном периоде ртутной нейроин-токсикации
• для разработки и апробации патогенетически обоснованных методов коррекции выявленных нарушений при воздействии соединений ртути
Программа должна включать определение объектов исследования, способов и сроков выполнения затравок, периодов обследования и методов оценки нарушений функционирования ЦНС.
Предлагаемый способ моделирования хронической ртутной токсической энцефалопатии был применен на 128 белых нелинейных крысах-самцах в течение 2 месяцев в 200-литровых газовых камерах путем динамического ингаляционного поступления паров металлической ртути со средней концентрацией - 0.36±0,02мг/м3. Анализ содержания ртути выполнялся на аналитическом приборе «Юлия». Аналогично производственным, были воспроизведены режим воздействия и способ поступления нейротоксиканта в организм экспериментальных животных, в то время как высокие дозы и длительность воздействия определялись необходимостью выявления и объективной регистрации патологических изменений в ЦНС в относительно позднем постконтактном периоде. Животным контрольной группы в камеры подавался воздух без токсиканта.
Методы оценки патологического процесса в ЦНС. Для объективной визуализации токсического действия ксенобиотиков в нервной ткани необходим выбор адекватных объектов и систем, скрининг наиболее информативных методов оценки состояния ЦНС [3]. Состояние высшей нервной деятельности (ВНД) лабораторных животных изучали по тестам, оценивающим двигательную, ориентировочно-исследовательскую активность, эмоциональное состояние, агрессивность животных, рабочую и долговременную память, неврологический статус, а также их когнитивные способности по результатам выработки условных рефлексов. Наряду с этим в качестве критериев
6 России существует большое число источников выбросов ртути в окружающую среду. Это предприятия хлорной промышленности в Стерлитамаке, Саян-ске, Волгограде, Усолье-Сибирском, Кирово-Чепецке и других городах, производство ртутьсодержащих ламп в Саранске и Смоленске, металлургические производства во Владикавказе, Челябинске, Белове, Норильске, Карабаше, Медногорске, Красноуральске, Ревде, Пышме, Уфале на Уфалейском хребте, в Реже, на Кольском полуострове и т. д. Общий выброс ртути в атмосферный воздух только от промышленных источников достигает, по экспертным оценкам, до 20 т в год. Кроме того, продолжается использование ртутьсодержащих пестицидов (гранозан), а на складских помещениях находится до 1 тыс. т этих веществ.
www.toxinemonitoring.com.
оценки патологического процесса в ЦНС при моделировании ртутной токсической энцефалопатии нами апробированы некоторые нейрофизиологические показатели и оценено морфофунк-циональное состояние нервной ткани.
В итоге, для объективизации нейротоксиче-ского эффекта хронического воздействия металлической ртути, нами разработан и адаптирован комплекс высокочувствительных методов, позволяющий оценить различные звенья патологического процесса в центральном и периферическом отделах нервной системы: тесты - «открытое поле» (количество и длительность поведенческих актов- норка, локомоция, вертикальная стойка, стойка с упором, движение на месте, обнюхивание груминг, движение на месте, вертикальная стойка ), «крестообразный лабиринт» (число переходов из светлого и темного рукавов, длительность пребывания в них, число и время актов свешивания в открытых рукавах и выглядывания из закрытых рукавов), «чужак-резидент» (число взаимных вертикальных стоек и атак на чужака), длительность удержания на вращающемся стержне, выработка условного пищедобывательного рефлекса диффе-ренцировки освещенности, электроэнцефалография с фотостимуляцией и вызванными потенциалами, электронейромиография периферических нервов и мышц, обзорная микроскопия, морфоме-трия и гистохимия нервной ткани, иммуногисто-химия с определением антител к виментину, ней-ронспецифической енолазе, глиофибриллярному кислому протеину, белку S-100, синаптофизину, электронная микроскопия [1,2,3,5,8,13]. Учитывая, что информативность и вектор изменений тех или иных тестов может весьма существенно меняться в различные сроки с момента создания модели ртутной токсической энцефалопатии, обследование лабораторных животных проводили дважды в динамике постконтактного периода: сразу после окончания ингаляционного воздействия нейроток-сикантом (1 срок) и через 2 месяца (2 срок).
Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программы Excel «описательная статистика» с использованием t- критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни.
Результаты и обсуждение. Как было показано нами ранее, хроническое ингаляционное воздействие паров металлической ртути приводило к развитию у белых крыс нейроинтоксикации, сопровождающейся нарушениями ориентировочно-исследовательского и зоосоциального поведения, неврологического статуса, нейрофизиологических показателей и морфофункциональными изменениями нервной ткани, совокупность признаков которой позволяет утверждать о формировании у животных токсической ртутной энцефалопатии [10,11,12]. Информативность и направленность полученных показателей имела весьма существенные отличия в различные временные сроки с момента создания токсической энцефалопатии.
При обследовании сразу после окончания ингаляционного воздействия парами металлической ртути установлено повышение общей двигательной активности, ориентировочно-исследовательского поведения, мышечного гипертонуса, увеличение тревожности, негативной эмоциональности и слабовыраженная агрессивность. Так, анализ двигательной активности в открытом поле позволил выявить возрастание общего числа двигательных актов, достоверно значимое снижение времени, занятого на выполнение акта «сидит», различие в исследовательском поведении, заключавшееся в увеличении числа обследований отверстий открытого поля. Наблюдалось достоверно значимое повышение числа актов «обнюхивание», уменьшение числа актов «вертикальная стойка», «груминг» и количества животных с регистрируемыми актами «стойка с упором» и взаимными вертикальными стойками [10,11,12].
Развитие токсической энцефалопатии, формирующейся в отдаленный период после ингаляционного воздействия металлической ртути, сопровождалось снижением ориентировочно-исследовательского поведения, эмоционально-негативным состоянием, возрастанием зоосоци-альной агрессивности и длительной сохранностью нарушений неврологического статуса в виде мышечного гипертонуса. Так, у животных с ртутной экспозицией достоверно значимо уменьшились количество и длительность акта «норка», реже отмечался акт «стойки с упором», время, затрачиваемое в среднем одной белой крысой опытной группы на «груминг», свидетельствующее о негативной эмоциональности, возросло в 4,5 раза, возросло количество особей с развернутыми атаками на «чужака».
В оба срока обследования время удержания на вращающемся с заданной скоростью стержне,
характеризующее неврологический статус, было достоверно выше у белых крыс, получивших ингаляционную экспозицию парами ртути. О наличии когнитивного дефицита и снижении памяти животных свидетельствовали результаты выработки условного пищедобывательного рефлекса дифференцировки освещенности.
В показателях биоэлектрической активности головного мозга в динамике обследования преобладала патологическая медленноволновая активность, выявлялись нарушения корково-подкорковых взаимосвязей, проявляющиеся в изменении коркового зрительного ответа в виде отставания по времени реакции коры, увеличении латентности Р200 и длительности всего ответа, нарастающие с течением времени. По данным электронейромиогра-фии выявлены достоверные изменения состояния нервного ствола, соответствующие аксональному типу поражения. Патоморфологическая верификация поражения нервной ткани при воздействии паров металлической ртути свидетельствовала о наличии длительно сохраняющихся периваскуляр-ного и перицеллюлярного отеков, нарастающей в отдаленном постконтактном периоде дистрофии нейронов коры головного мозга и клеток Пурки-нье, процессов демиелинизации аксонов, увеличении площади митохондрий нейронов, нарушении структуры слоев коры и гиппокампа, а также метаболической активности нервных клеток,. Имму-ногистохимическое исследование нервной ткани выявило снижение содержания кислого глиально-го белка, 8-100 и повышение активности нейрон-специфической енолазы.
Предложенная нами схема моделирования, позволяет оценить проявления ртутной токсической энцефалопатии, развивающейся как после окончания воздействия, так и в отдаленном постконтактном периоде. Вместе с тем полученные нами результаты подтверждают клинические наблюдения о прогредиентном, в ряде случаев, характере формирования патологии ЦНС и после окончания токсического действия ртути. На основании определения наиболее информативных показателей, характеризующих развитие ртутной нейроинтоксикации, нами предложены критерии диагностики отдаленной токсической энцефалопатии в эксперименте:
• нарушение ориентировочно-исследовательского поведения, выражавшееся в повышении в 1 срок обследования с последующим снижением во 2 срок обследования (уменьшение количества актов «норка» на 20% и более, длительности актов «норка» на 45% и более, уменьшение количества животных, выполняющих акт стойка с упором, на 40% и более)
• эмоционально-негативное состояние (возрастание длительности актов груминг в 4,5 раза и более)
• возрастание агрессивности зоосоциального поведения (возрастание количества животных,
атакующих чужака, в 1,9 раза и более) • нарушение неврологического статуса (увеличение времени удержания на вращающемся стержне в 2,5 раза и более)
Заключение. Таким образом, научно-обоснованная экспериментальная модель ртутной токсической энцефалопатии позволяет исследовать и обобщить представления о механизмах и закономерностях формирования патологии центральной и периферической нервной системы при воздействии металлической ртути и ее соединений, максимально приблизив ее к клиническим проявлениям, наблюдаемым у чело-
века. Модель отличается длительной сохранностью признаков, характерных для токсической энцефалопатии в отдаленном постконтактном периоде.
Моделирование ртутной энцефалопатии направлено, прежде всего, на поиск эффективных средств лечения и профилактики прогрессиро-вания заболевания, а также на реабилитацию пациентов с токсической энцефалопатией, как в остром периоде нарушений, так и при формировании отдаленных последствий интоксикации с возможным развитием прогредиентной нейроде-генерации.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Авалиани Т.В., Серякова О.Р., Чабек-Гарбач Р., Шабаев В.В. Унилатеральное повреждение сенсомо-торной коры доминантного и субдоминантного полушарий мозга крыс-матерей и поведение потомства в «открытом поле» // Журнал высшей нервной деятельности. - 2002. - Т.52, № 2. - С. 628-635.
2. Бадалян Л.О. Клиническая электронейромиогра-фия: Руководство для врачей. - М.: Медицина, 1986.-343с.
3. Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Д.П. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. - М.: Высшая школа, 1991. -390с.
4. Каркищенко Н.Н. Основы биомоделирования.-М.: Изд-во ВПК, 2004.-608 с.
5. Коржевский Д.Э. Краткое изложение основ гистологической техники для врачей и лаборантов-гистологов.- СПб.: Кроф, 2005.-48с.
6. Колесов В.Г., Мещерягин В.А., Лахман О.Л., Шевченко О.И. Психопатологические проявления отдаленного периода профессиональных нейроинтоксикаций // Журнал неврологии и психиатрии. - 2005. - № 1. -С. 25-29.
7. Курляндский Б.А. Филов В.А.Общая токсикология. - М.: Медицина, 2002. - 607 с.
8. Ракитский В.Н., Николаева Н.И. Морфофункци-ональные критерии действия на организм факторов окружающей среды,- М.: Медицина, 2001.-298с.
9. Рукавишников В.С. Ефимова Н.В., Голубин-ский С.П. и др. Современные проблемы медико-биологической и экологической безопасности Иркутской области// Бюллетень ВСНЦ СО РАМН.- 2007.- №6.
- С.6-12.
10. Соседова Л.М., Якимова Н.Л., Хомуев Г.Д., Но-сатова В.А. Оценка поведенческой активности белых крыс при ингаляционном воздействии металлической ртути // Мед. труда и пром. экология. - 2007. - № 6.
- С. 36-40.
11. Соседова Л.М., Якимова Н.Л. Содержание ртути во внутренних органах и зоосоциальное поведение белых крыс при ингаляционном воздействии металлической ртути // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2007.
- №1. - С. 113-116.
12. Соседова Л.М., Голубев С.С., Титов Е.А. Сравнительная морфологическая оценка нейротоксичности сулемы и гипоксии // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. -2007. - №1. - С. 100-102.
13. Мониторинг неврологического дефицита и нарушений высшей нервной деятельности у крыс с фокальной ишемией головного мозга / В.П. Чехонин [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2003. - Т. 135. - № 6. - С. 629 - 633.
14. Трахтенберг И.М. Хроническое воздействие ртути на организм. -Киев.: Здоров'я, 1969.-392 с.
L.M. Sosedova
Scientific and methodological principles of modeling of mercury toxic encephalopathy
Angarsk Branch of East-Siberian Scientific Center of Human Ecology, Siberian Department of the Russian Academy of Medical Sciences- Research Institute of Occupational Health and Human Ecology
The article is dedicated to the issue of experimental modeling of toxic mercury encephalopathy. Are described methodological approaches, criteria and assessment methods for the pathological status of the central nervous system as well as the outcome of independent investigations on the creation of mercury toxic encephalopathy caused by inhalation exposure to metallic mercury vapors.
Материал поступил в редакцию 01.04.09
