CC BY
16
DOI: 10.23670/IRJ.2017.55.034 Доманова Е.Т.1, Зобнин В.В.2, Соловьев С.Н.3
1ORCID: 0000-0002-3156-4840, Кандидат медицинских наук, 2Кандидат медицинских наук,
3Кандидат медицинских наук, Читинская государственная медицинская академия НАРУШЕНИЯ ГЕМОСТАЗА ПРИ ХРОНИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ПАРОДОНТА
Аннотация
Изучали фибринолитическую и коагулогическую активность интерлейкинов IL-1fi, TNF-a, IL-8, IL-6 и a-дефензинов у лиц со здоровым пародонтом, хроническим гингивитом, хроническим пародонтитом. Исследования проведены в системе in vitro с использованием цитратной тест-плазмы здоровых доноров и десневой жидкости, содержимого пародонального кармана больных. Выявлены корреляционные связи (Спирмен p<0,05) между концентрацией цитокинов и состоянием прокоагулянтной системы гемостаза при хроническом гингивите, хроническом генерализованном пародонтите. Цитокины способствовали гиперкоагуляции и тормозили фибринолиз. Анализ мазков содержимого десневой жидкости и пародонального кармана показал, что нейтрофилы и эпителиальные клетки здоровых, больных хроническим гингивитом и пародонтитом экспрессируют тканевой фактор, который визуализируется иммуноцитохимическим методом. Присутствие тканевого фактора объясняет гиперкоагуляцию и депрессию фибринолиза при воспалительных заболеваниях пародонта.
Ключевые слова: тканевой фактор, пародонтит, цитокины, гемостаз
Domanova E.T.1, Zobnin V.V.2, Solovjev S.N.3 1ORCID: 0000-0002-3156-4840, MD, 2,3MD, Chita State Medical Academy HEMOSTATIC DISORDERS IN CHRONIC PERIODONTAL DISEASES
Abstract
We studied fibrinolytic and coagulographic activities of interleukins IL-1fi, TNF-a, IL-8, IL-6 and a-defensins of persons with healthy periodontium, chronic gingivitis and chronic periodontitis. Research was conducted in in vitro system using citrate test plasma of healthy donors, crevicular fluids and, content of patients' gingival pockets. We have discovered the correlation (Spearman p<0,05) between the concentration of cytokines and condition ofprocoagulantive hemostasis system in chronic gingivitis and chronic generalized periodontitis. Cytokines contributed to hypercoagulation and slowed down the fibrinolysis. The results of the content analysis of gingival fluid and parodontal pocket smears showed that neutrophils and epithelial cells of healthy people and patients with chronic gingivitis and periodontitis express tissue factor, which is visualized by immunocytochemistry method. The presence of the tissue factor explains hypercoagulation and depression offibrinolysis in inflammatory diseases of paradontium.
Keywords: tissue factor, periodontitis, cytokines, hemostasis.
Важную роль в патофизиологии воспалительных заболеваний пародонта отводят местным факторам иммунитета и микрофлоре полости рта. Эпителиоциты, при контакте с патогенными микроорганизмами, экспрессируют рецепторы для миграции клеток врожденного и адаптивного иммунитета и синтезируют ряд цитокинов, обладающих свойствами хемоаттрактантов. Привлеченные клетки уничтожают внедрившиеся патогенные микроорганизмы, происходит мощный выброс активных веществ, направленных не только на защиту пародонта, но и на повреждение самой ткани. Повышение концентрации провоспалительных цитокинов повреждает эндотелий сосудов, при этом высвобождаются соединения, усиливающие гемостаз и активирующие фибринолиз [3, С. 521].
Целью данного исследования было изучение коагулогических и фибринолитических свойств десневой жидкости здоровых людей, больных хроническим гингивитом и содержимого пародонтального кармана при пародонтите, а также оценка экспрессии тканевого фактора клетками десневой жидкости.
Материалы и методы
В исследовании участвовали 45 человек в возрасте от 25 до 40 лет. 15 практически здоровых людей с интактным пародонтом, 15 пациентов с диагнозом хронический генерализованный гингивит средней степени тяжести, 15 - с хроническим генерализованным пародонтитом средней степени тяжести. Материалом для исследования служили: десневая жидкость (ДЖ) и содержимое пародонтального кармана (СПК), полученные путем аспирации с помощью стерильного шприц-тюбика. Концентрацию IL-1P, TNF-a, IL-8, IL-6, a-дефензина (HNP-a) определяли в ДЖ и СПК методом ИФА (пг/мл) (реактивы фирмы «Вектор-Бест», Новосибирск и реактивы фирмы «Hycult Biotech» USA Michigan). Для оценки гемостаза использовали цитратную тест-плазму от здоровых доноров. Определяли: время рекальцификации (Вр) (Bergerhof, Roka 1954), каолиновое время (КВр) и эуглобулиновый фибринолиз (ЭуФ) (Kowarzyk H. и Buluk L. 1954), хагеманзависимый (каолиновый) фибринолиз (ХгФ) (Веремеенко К.Н. 1978). Иммуноцитохимическое исследование клеток ДЖ и СПК, выполнено биотин-стрептавидиновым иммунопероксидазным методом с мышиными моноклональными антителами к тканевому фактору человека - TF (TF9-10H10) производства Santa Cruz biotechnology (USA).
Результаты
Предварительная инкубация тест-плазмы полученной от здоровых доноров десневой жидкости исследуемых лиц без ВЗП, приводит к сокращению времени рекальцификации (Вр), добавление каолина (КВр) дает максимальную активацию контактной фазы свертывания в сравнении с контролем - «К» (р<0,05) (табл. 1). Стимуляция реакции рекальцификации тест-плазмы доноров ДЖ пациентов с хроническим генерализованным гингивитом (ХГ) и, в особенной степени, у больных хроническим генерализованным пародонтитом (ХП), приводит к выраженному укорочению времени коагуляции, по сравнению с «К» и «Н» - нормой (р<0,05). Данное обстоятельство предполагает наличие активатора коагуляции в ДЖ и СПК у пациентов с ВЗП. Инкубация осажденной эуглобулиновой фракции тест-плазмы с ДЖ и СПК приводит к
значительному торможению времени растворения фибринового сгустка (табл. 1). Полученные данные свидетельствуют, что СДБ и СПК содержат ангифибринолигический фактор, возможно содержащийся в клетках [1, С. 11].
Таблица 1 - Коагулогические и фибринолитические свойства десневой жидкости здоровых, пациентов
хроническим гингивитом и содержимого пародонтального кармана больных хроническим пародонтитом
Ме± SD К - конт- роль Н - норма ХГ - хроничес-кий ХП-хроничес-кий
гингивит пародонтит
Вр (сек) 153,4±5,8 132,7±4,7 110,0±6,6 93,6±5,6
* *. ** *; **;***
КВр (сек) 121,0±6,4 107,3±5,8 95,3±7,4 82,5±6,3
* *. ** *; **;***
ЭуФ (мин) 220,0±25,1 150,0±18,8 280,0±20,4 340,0±20,4
* *. ** *; **;***
ХгФ (мин) 12,3±1,5 6,0±1,2 19,3±1,9 27,6±3,0
* *. ** *; **;***
Примечание: (П-тест Манна-Уитни) статистически значимых отличий (р<0,05): * - по сравнению с контролем при; **- уровень отличий между нормой, хроническим гингивитом и хроническим пародонтитом; ***- между хроническим гингивитом и хроническим пародонтитом
Хронический гингивит и пародонтит знаменуется высоким содержанием цитокинов в десневой жидкости и пародонтальном кармане (табл. 2), что вполне оправдано, так как с развитием воспаления увеличивается миграция иммунных клеток. Активированные нейтрофилы, эпителиоциты, фибробласты, клетки Лангерганса, макрофаги и другие клетки синтезируют и секретируют ГЬ-1р, Т№-а, ГЬ-8, ГЬ-6. Для определения патогенетических взаимосвязей цитокинов и показателей гемостаза проведен корреляционный анализ. У здоровых пациентов активность фибринолиза и коагуляции плазмы зависит от ГЬ-8 в ДЖ, что подтверждается (г=0,53) положительными корреляционными связями. Повышение концентрации ГЬ-1р у больных с ХГ оказывает влияние на гиперкоагуляцию (г=0,59) и снижение фибринолитической активности (г=0,61). Увеличение продукции ТМР-а при ХП способствует развитию тромбозов, что подтверждается умеренной корреляционной связью (г=0,53) с показателями гемостаза. Корреляционный анализ подтверждает опосредованное влияние ГЬ-6 на активацию свертывания крови (г=0,58) и ингибирование фибринолиза (г=0,59) при хроническом гингивите и пародонтите. Действие на систему гемостаза направлено на усиление свертываемости, которое необходимо для прямого блокирования патогена.
Таблица 2 - Уровень интерлейкинов и а-дефензина в десневой жидкости здоровых, больных хроническим _гингивитом и содержимом пародонтального кармана при хроническом пародонтите._
Ме± SD Здоровый пародонт Хронический гингивит Хронический пародонтит
ТОТ-а 1,46±1,2 53,64±35,1 134,7±235,5
пг/мл * *. **
ГЬ -6 2,85±1,8 52,35±43,5 89,28±125,2
пг/мл * *
ГЬ -8 21,61±27,32 440,70±84,15 42,39±47,62
пг/мл * *. **
ГЬ-1Р 23,0 ± 4,9 56,9± 19,8 97,6±166,5
пг/мл * *. **
а-дефензина Н№-а 946,3±16,7 900,6± 69,6 709,1±224,8
пг/мл * *. **
Примечание: (П-тест Манна-Уитни) статистически значимых отличий (р<0,05): * - по сравнению с нормой;
**-уровень отличий между хроническим гингивитом и хроническим пародонтитом
Следует полагать, что усиление коагуляции тест-плазмы под влиянием содержимого зубодесневой бороздки обусловлено действием тканевого фактора (ТБ), источником которого служат моноциты и нейтрофилы [4, С. 2768], [5, С. 1854] десневой жидкости. Нами были изучены иммунногистохимические препараты зубодесневой жидкости здоровых, пациентов с хроническим гингивитом и хроническим пародонтитом. Оказалось, что ТБ экспрессируется в цитоплазме нейтрофилов здоровых лиц, что обусловлено базовой секрецией этого соединения клетками трансудирующими в десневую жидкость (Рис. 1). В мазках пациентов с ХГ и ХП отчетливо видно, что ТБ экспрессируется нейтрофилами и эпителиальными клетками (Рис. 2, 3). Механизм усиленной его выработки, является действием локально накопленых провоспалительных цитокинов на ТБ-содержащие клетки. Нами исследовался уровень а-дефензина (ИКР-а) при ХГ и ХП в десневой жидкости (табл. 2). Высокая концентрация ИКР-а в десневой жидкости, приводит к дополнительной миграции клеток, через индуцирование секреции ГЬ-8, и повреждение клеток, вследствие механизма электропробоя мембраны [2, С. 317] . Это сопровождается рекрутированием дополнительного числа провоспалительных клеток, содержащих ТБ, что в свою очередь повышает местный коагуляционный потенциал.
Рис. 1 - Цитологический мазок содержимого десневой борозды лица с клинически здоровым пародонтом. Увеличение окуляр 10/20, объектив Х 100/1,25. Окраска диаминобензидин, докраска водным раствором гематоксилина Гаррисона. Желтая окраска указывает наличие тканевого фактора в нейтрофилах
Рис. 2 - Препарат содержимого десневой борозды пациентов с диагнозом: Хронический генерализованный гингивит средней степени тяжести ремиссия. Увеличение окуляр 10/20, объектив Х 100/1,25. Окраска диаминобензидин, докраска водным раствором гематоксилина Гаррисона. Желтая окраска указывает наличие
тканевого фактора в нейтрофилах
Рис. 3 - Цитологический мазок содержимого пародонтального кармана пациентов с диагнозом: Хронический генерализованный пародонтит средней степени тяжести ремиссия. Увеличение окуляр 10/20, объектив Х 100/1,25. Окраска диаминобензидин, докраска водным раствором гематоксилина Гаррисона. Желтая окраска указывает наличие
тканевого фактора в нейтрофилах и эпителиальных клетках)
Вывод
Полученные нами результаты свидетельствуют о опосредованном участии цитокинов в коагулогических реакциях в патогенезе воспалительных заболеваниях пародонта. Усиление гемостатических свойств десневой жидкости здоровых, больных хроническим гингивитом и хроническим пародонтитом, обусловлено накоплением тканевого фактора, секретируемого нейтрофилами и эпителиальными клетками десневой бороздки. Хронические воспалительные заболевания гингивит и пародонтит характеризуются слабой фибринолитической активностью и склонностью к гиперкоагуляции.
Список литературы / References
1. Беликов П.П. Нарушение гемокоагуляции и фибринолиза и их коррекция при заболеваниях пародонта : автореф. дис. ... д-ра мед. наук : 14.00.21 : защищена 06.11.1990 : утв. 1991 / Беликов Петр Павлович. - М., 1990. - 36 с
2. Будихина А.С. а-Дефезины - антимикробные пептиды нейтрофилов: свойства и функции / А.С. Будихина, Б.В. Пинегин // Иммунология. - 2008. - № 5. - С. 317-320
3. Кузник, Б.И. Клеточные и молекулярные механизмы регуляции системы гемостаза в норме и патологии: монография / Б.И. Кузник. - Чита : Экспресс-издательство, 2010. - 832с. - ISBN 978-5-9566-0253-9
4. Martinod K., Wagner D.D. Thrombosis: tangled up in NETs. [Electronic resource] / K. Martinod, D.D. Wagner // Journal Blood. - 2014. -Vol. 123. - Р. 2768-2776. doi: https://doi.org/10.1182/blood-2013-10-463646 (дата обращения: 23.12.2016)
5. Tissue factor expression in neutrophil extracellulartrapsand neutrophil derived microparticles in antineutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis may promote thromboinflammation and the thrombophilic state associated with the disease. / K. Kambas, A. Chrysanthopoulou, D. Vassilopoulos, [and others] // Journal Ann Rheum Dis. - 2014. - Vol. 73. - Р. 1854-1863 doi: 10.3389/fimmu.2016.00236
Список литературы на английском языке / References in English
1. Belikov P.P. Narushenie gemokoaguljacii i fibrinoliza i ih korrekcija pri zabolevanijah parodonta [Hemocoagulation and Fibrinolysis Impairment and Its Correction in Case of Periodontitis] : thesis Report for the Degree of MD : 14.00.21 : defense of the thesis 06.11.1990 : approved 1991 : / Belikov Petr Pavlovich. - M., 1990 - 36p. [in Russian]
2. Budikhina A.S. а-Defeziny - antimikrobnye peptidy nejtrofilov: svojstva i funkcii [а - Defensins Are Antimicrobic Peptides of Neutrophils: Features and Functions] / A.S. Budikhina, B.V. Pinegin // Immunologija [Immunology]. - 2008. -№ 5. - P. 317-320. [in Russian]
3. Kuznik, B.I. Kletochnye i molekuljarnye mehanizmy reguljacii sistemy gemostaza v norme i patologii: monografija [Cellular and Molecular Mechanisms of Regulation of the Hemostasis System in the Healthy Body and in the Disease: Monograph] / B. I. Kuznik. - Chita: Express - Edition, 2010. - 832 р. - ISBN 978-5-9566-0253-9 [in Russian]
4. Martinod K., Wagner D.D. Thrombosis: tangled up in NETs. [Electronic resource] /K. Martinod, D.D.Wagner // Journal Blood. - 2014. -Vol. 123. - Р. 2768-2776. doi: https://doi.org/10.1182/blood-2013-10-463646 (accessed: 23/12/2016)
5. Tissue factor expression in neutrophil extracellulartrapsand neutrophil derived microparticles in antineutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis may promote thromboinflammation and the thrombophilic state associated with the disease. / K. Kambas, A. Chrysanthopoulou, D. Vassilopoulos, [and others] // Journal Ann Rheum Dis. - 2014. - Vol. 73. - Р. 1854-1863 doi: 10.3389/fimmu.2016.00236
