CC BY
46
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016
УДК 616.831-006.484.04-092:612.017.1.014.3]-018.83-078.33
Тыринова Т.В.1, Леплина О.Ю.1, Мишинов С.В.2, Тихонова М.А.1, Калиновский А.В.3, Чернов С.В.3, Долгова Е.В.4, Поттер Е.А.4, Богачев С.С.4, Ступак В.В.2, Останин А.А.1, Черных Е.Р.1
НАРУШЕНИЕ ЦИТОТОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК У БОЛЬНЫХ С ОПУХОЛЯМИ ГОЛОВНОГО МОЗГА: МЕХАНИЗМЫ И ВОЗМОЖНОСТИ КОРРЕКЦИИ
1 ФГБНУ «НИИ фундаментальной и клинической иммунологии», 630099, г Новосибирск, Россия;
2 ФГБУ «НИИ Травматологии и ортопедии им. Я.Л. Цивьяна» Минздрава России, 630091, г. Новосибирск, Россия;
3 ФГБУ «Федеральный центр нейрохирургии» Минздрава России, 630087, г Новосибирск, Россия;
4 ФГНУ «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук», 630090, г. Новосибирск, Россия
Наряду с индукцией противоопухолевого иммунного ответа дендритные клетки (ДК) способны непосредственно лизировать опухолевые клетки. Однако у больных злокачественными глиомами цитотоксическая функция ДК, генерированных в культуре in vitro, против TNFa-чувствительных опухолевых мишеней угнетена. Цель настоящей работы — изучение роли трансмембранной (tmTNFa) и секреторной (sTNFa) форм TNFa в реализации цитотоксической активности ДК, возможных причин дефектности TNFa-опосредованной цитотоксической активности ДК и способов ее регуляции у больных глиомами головного мозга высокой степени злокачественности. Показано, что слабая цитотоксичность ДК больных злокачественными глиомами против TNFa-чувствительных клеток НЕр-2 обусловлена низкой экспрессией tmTNFa на ДК и не связана с уровнем продукции sTNFa. Увеличение экспрессии tmTNFa на ДК больных, индуцированное блокированием TNFa-конвертирующего фермента, повышает цитотоксическую активность ДК больных против клеток HEp-2. Показано, что rIL-2 и dsDNA являются позитивными регуляторами экспрессии tmTNFa на ДК больных и практически не влияют на уровень продукции sTNFa. При этом rIL-2- и dsDNA-индуцированное повышение экспрессии tmTNFa приводит к восстановлению изначально низкой цитотоксичности ДК больных. Характерно, что блокирование TNFa/TNF-RI-сигнального пути с помощью растворимого рецептора rhTNFR снижает усиливающий эффект dsDNA, но не rIL-2, что, по-видимому, обусловлено вовлечением различных сигнальных путей при стимуляции ДК dsDNA и rIL-2. Таким образом, дефект цитотоксической активности ДК против клеток HEp-2 у больных злокачественными глиомами обусловлен нарушением экспрессии tmTNFa и может корригироваться блокированием TNFa-конвертирующего фермента, а также стимуляцией ДК rhIL-2 или dsDNA.
Ключевые слова: дендритные клетки; злокачественные гяиомы; TNFa.
Для цитирования: Тыринова Т.В., Леплина О.Ю., Мишинов С.В., Тихонова М.А., Калиновский А.В., Чернов С.В., Долгова Е.В., Поттер Е.А., Богачев С.С., СтупакВ.В., Останин А.А., ЧерныхЕ.Р. Нарушение цитотоксической активности дендритных клеток у больных с опухолями головного мозга: механизмы и возможности коррекции. Иммунология. 2016; 37(5): 246-252. DOI: 10.18821/0206-4952-2016-37-5-246-252
Tyrinova T. V.1, Leplina O.Yu.1, Mishinov S.V.2, Tikhonova M.A.1, Kalinovskiy A.V.3, Chernov S.V.3, Dolgova E.V.4, Potter E.A.4, Bogachev S.S.4, Stupak V.V.2, Ostanin A.A.1, Chernykh E.R.1
THE IMPAIREMENT OF CYTOTOXIC ACTIVITY OF DENDRITIC CELLS IN GLIOMA PATIENTS: MECHANISMS AND APPROACHES TO CORRECTION
1 Institute of Fundamental and clinical Immunology, 630099, Novosibirsk, Russia;
2 Institute of Traumatology and Orthopedics, 630091, novosibirsk, Russia;
3 Federal neurosurgical center, 630087, novosibirsk, Russia;
4The federal research center institute of cytology and genetics of Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, 630090, novosibirsk, Russia
Besides the induction of anti-tumor immune response, dendritic cells (DCs) are able to lyse tumor cells. However, the cytotoxic function of DCs generated in vitro against TNFa-sensitive tumor cells is impaired in high-grade glioma patients. The aim of the present study was to investigate the involvement of the transmembrane (tmTNFa) and soluble (sTNFa) TNFa forms in the cytotoxic activity of DCs, the mechanisms underlying the failure of TNFa-mediated DC cytotoxic activity and approaches to up-regulation of DC cytotoxicity in high-grade glioma patients. We showed that low cytotoxicity of patient DCs against TNFa-sensitive HEp-2 cells is caused by decreased tmTNFa expression on DCs and not associated with sTNFa level. The inhibition of TNFa-converting enzyme increases tmTNFa expression on patient DCs, which leads to enhancement of DC cytotoxic activity against HEp-2 cells. We demonstrated that rIL-2 and dsDNA up-regulate tmTNFa expression on glioma patient DCs and do not affect sTNFa production by DCs. rIL-2- and dsDNA-induced increase of tmTNFa expression restores low cytotoxicity of patient DCs. Blocking TNFa/ TNF-R1-signaling pathway using soluble receptor rhTNFR reduces up-regulating effect of dsDNA, but not rIL-2, that could be due to the involvement of different signaling pathways when DCs are treated with dsDNA and rIL-2. Thus, the defect of cytotoxic activity of glioma patient DCs against HEp-2 cells is caused by decreased tmTNFa expression and could be corrected by blocking TNFa-converting enzyme as well as treating of DCs with rhIL-2 or dsDNA.
Keywords: dendritic cells; high-grade glioma; TNFa.
Для корреспонденции: Тыринова Тамара Викторовна, канд. биол. наук, научный сотр. лаборатории клеточной иммунотерапии, ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии», E-mail: tyrinova@bk.ru
ORIGINAL ARTICLE
For citation: Tyrinova T. V., Leplina O.Yu., Mishinov S.V., Tikhonova M.A., Kalinovskiy A.V., Chernov S.V., Dolgova E.V., Potter E.A., Bogachev S.S., Stupak V.V., Ostanin A.A., Chernykh E.R. The impairement of cytotoxic activity of dendritic cells in glioma patients: mechanisms and approaches to correction. Immunologiya.2016; 37(5): 246-252. DOI: 10.18821/02064952-2016-37-5-246-252
For correspondence: Tamara V. Tyrinova, PhD, researcher of the laboratory of cell immunotherapy, Institute of Fundamental and Clinical Immunology, 630099, 14 Yandritsevskaya str., Novosibirsk, Russia; E-mail: tyrinova@bk.ru
conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Funding. The study had no sponsorship.
Received 11.05.16 Accepted 07.06.16
Дендритные клетки (ДК), будучи высокоспециализированными антигенпрезентирующими клетками, индуцируют иммунный ответ против различных антигенов, в том числе и опухолевых [1]. Кроме того, ДК обладают эффекторной функцией, заключающейся в способности лизировать опухолевые клетки [2, 3]. Цитотоксическая активность ДК, направленная на элиминацию опухолевых клеток, может обеспечить более успешное поглощение опухолевых антигенов ДК и, следовательно, способствовать более раннему развитию эффективного противоопухолевого иммунного ответа, индуцированного презентацией опухолевых антигенов Т-клеткам.
Цитотоксическая активность ДК опосредуется с вовлечением различных проапоптогенных лигандов, в том числе и молекулы фактора некроза опухоли альфа (TNFa) [4]. TNFa экспрессируется на клеточной мембране в виде трансмембранной формы (tmTNFa), а также секретируется в виде растворимой формы (sTNFa) [5]. Обе формы могут связываться с рецептором TNF-R1 (p55) и индуцировать апоптоз в клетках-мишенях [6].
Известно, что цитотоксическая активность ДК усиливается под действием интерферонов 1-го типа (IFN I), и генерируемые в присутствие интерферона альфа (IFNa) ДК (ИФН-ДК) способны лизировать различные типы опухолевых клеток [7, 8]. Однако у больных глиомами головного мозга высокой степени злокачественности ИФН-ДК характеризуются низкой цитотоксической активностью против TNFa-чувствительных опухолевых клеток HEp-2, что может свидетельствовать о нарушении TNFa-медиируемого механизма цитотоксичности [8].
Глиальные опухоли относятся к наиболее часто встречающимся новообразованиям головного мозга и при высокой степени злокачественности (Grade III и Grade IV) характеризуются плохим прогнозом [9]. Даже при успешном хирургическом удалении опухоли с последующей радио- и химиотерапией рецидив опухоли возникает в среднем через 6 мес [10]. Клинические испытания показали, что вакцинация пациентов ДК, нагруженными опухолевыми антигенами, индуцирует специфический иммунный ответ, однако клинический эффект наблюдается только у части пациентов [11, 12]. Более высокие показатели выживаемости при сочетании ДК-вакцин с внутриопухолевым введением ненагруженных ДК позволяет предположить наличие прямого противоопухолевого эффекта ДК in vivo [13]. Поэтому характеристика противоопухолевой активности ДК и изучение механизмов ее на-
рушения представляют большой интерес как в научном, так и прикладном аспектах.
Учитывая, что цитотоксический эффект ДК доноров против клеток HEp-2 требует клеточного контакта и не проявляется при замене ДК на их супернатан-ты [14], высказано предположение, что выявленный у больных злокачественными глиомами дефект цито-токсической функции ДК обусловлен снижением экспрессии tmTNFa.
Цель настоящей работы — изучение роли трансмембранной и секреторной форм молекулы TNFa в реализации цитотоксической активности ДК, выяснение возможных механизмов дефектности цитотокси-ческой активности ДК у больных злокачественными глиомами и исследование возможности коррекции цитотоксической функции ДК через регуляцию экспрессии tmTNFa.
Материал и методы
В исследование были включены 45 пациентов с глиомами головного мозга высокой степени злокачественности, в том числе 24 мужчины и 21 женщина в возрасте от 11 до 83 лет (медиана 51 год), проходивших обследование и лечение в отделении нейрохирургии Новосибирского НИИТО и Федеральном нейрохирургическом центре в 2013—2015 гг. Анапла-стическая астроцитома (Grade III) диагностировалась у 11 пациентов, глиобластома (Grade IV) — у 34 пациентов. В качестве контрольной группы обследованы 28 совместимых по полу и возрасту здоровых доноров. Забор крови и все иммунологические исследования проводили после получения письменного информированного согласия пациентов.
Мононуклеарные клетки (МНК) выделяли центрифугированием гепаринизированной венозной крови в градиенте плотности фиколла-верографина. ДК получали путем культивирования прилипающей фракции МНК в 6-луночных планшетах (Nunclon, Дания) в течение 4 сут в среде RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, США), дополненной 0,3 мг/мл L-глютамина, 5мМ HEPES-буфера, 100 мкг/мл гентамицина и 5% сыворотки плодов коровы (FCS, БиолоТ, Санкт-Петербург), в присутствии GM-CSF (40 нг/мл, Sigma-Aldrich) и IFN-a (1000 Ед/мл, Роферон-А, Roche, Швейцария) с последующим дозреванием в течение 24 ч с липополисахаридом (ЛПС; 10 мкг/мл, LPS E. coli 0114:B4, Sigma-Aldrich). В отдельной серии экспериментов в культуры ДК больных совместно с ЛПС добавляли двуцепочечную ДНК человека (dsDNA, 5 мкг/мл), а также рекомбинантный IL-2 человека (rIL-2, 50 U/ml).
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Уровень экспрессии tmTNFa на ДК определяли методом проточной цитофлуриметрии в гейте HLA-DR+ клеток методом двойного окрашивания с использованием АРС-конъюгированных анти-Т№а-анител и FITC- или PerCP-конъюгированных анти-HLA-DR-антител (BD PharMingen, США). Для исключения возможности связывания моноклонального анти-TNFa-антитела с комплексом sTNFa-TNF-R ДК предварительно в течение 15 мин в темноте при комнатной температуре обрабатывали глициновым буфером Gly-HCl (pH = 3). Глициновый буфер способствовал диссоциации комплекса sTNFa-TNF-R и удалению с мембранной поверхности клетки sTNFa. Далее ДК инкубировали с анти-TNFa- и анти-HLA-DR-антителами согласно стандартной методике.
Концентрацию продуцируемого цитокина TNFa в супернатантах ЛПС-стимулированных ИФН-ДК определяли методом иммуноферментного анализа, используя соответствующую тест-систему («Вектор-Бест», Россия). Анализ уровня продукции sTNFa в цельных супернатантах культур ИФН-ДК проводили в пересчете на 105 ДК.
Оценку цитотоксической активности ДК против опухолевых клеток HEp-2 (карцинома гортани человека) проводили с помощью МТТ-теста в течение 24 ч в соотношении эффектор/мишень 1:1. Расчет цито-токсической активности проводился по стандартной формуле: (%) = [1 - (ОПэ + м - ОПэ)ЮПм>100%, где ОПэ + м — значение оптической плотности в опытных сериях; ОПэ — значение оптической плотности в лунках с эффекторами; ОПм — значение оптической плотности в лунках с мишенями. Оптическая плотность измерялась при длине волны 492 нм на мультилуночном спектрофотометре (Thermo Scientific Multiskan FC, Finland). В отдельной серии экспериментов в культуры ДК больных злокачественными глиомами совместно с ЛПС добавляли синтетический ингибитор металлопротеиназ TAPI-0 (25 мкг/мл, Calbiochem, США). Для изучения роли TNFa/TNF-R1-сигнального пути в реализации цито-токсической активности ДК в отдельных эксперимен-
тах ИФН-ДК предварительно инкубировали в течение 60 мин с rhTNFR1/TNFRSF1A Fc chimera (10 мкг/мл; R&D Systems, США).
Статистическую обработку данных проводили при помощи пакета прикладных программ Statistica 6.0 для Windows. Данные представлены в виде медианы (Ме) и интерквартильного диапазона (IQ). Для выявления значимых различий сравниваемых показателей использовали непараметрический ^-критерий Вилкоксона—Манна—Уитни. Для анализа взаимосвязей между исследуемыми параметрами использовали коэффициент корреляции Спирмена. Для оценки эффекта взаимодействия нескольких прогностических факторов применен метод множественной линейной регрессии. Различия считали достоверными при уровне значимости p < 0,05.
Результаты
Сравнительная оценка экспрессии tmTNFa показала, что относительное количество tmTNFa-позитивных клеток в культурах ИФН-ДК пациентов со злокачественными глиомами было почти в два раза меньше (p = 0,00002) по сравнению с аналогичным показателем в культурах ИФН-ДК здоровых доноров (рис. 1, а). Низкое количество tmTNFa+ДК (здесь и далее <5,3%, что соответствует нижней квартили нормативного диапазона) выявлялось у 83% больных. ИФН-ДК пациентов с Grade III и Grade IV характеризовались одинаково низкой экспрессией tmTNFa (Ме 3,4 и 3,3% соответственно).
На рис. 1, б видно, что ИФН-ДК больных с низкой экспрессией tmTNFa проявляли слабую цитотокси-ческую активность против опухолевых клеток HEp-2 (Ме 10,6%), тогда как ИФН-ДК пациентов с сохранной экспрессией tmTNFa (> 5,3%) индуцировали лизис клеток HEp-2 на уровне донорских значений (Ме цитотоксичности 31,2 и 36,3% соответственно). Таким образом, нарушение цитотоксической активности ИФН-ДК больных злокачественными глиомами ассоциировалось с низкой экспрессией tmTNFa.
Оценка продукции sTNFa в культурах ДК показа-
Рис. 1. Экспрессия мембранной и растворимой форм ЮТа в культурах ИФН-ДК больных злокачественными глиомами головного мозга. а — медианные (Ме) и диапазон 25—75% квартальных значений —UQ) экспрессии tmTNFa (%) в культурах ЛПС-стимулированных ИФН-ДК доноров (п = 18) и больных злокачественными глиомами (п = 35); б — медианные (Ме) и диапазон 25—75% квартальных значений ^0—и0) цитотоксической активности ИФН-ДК доноров, пациентов с низким уровнем экспрессии tmTNFa (ЬпТОТа < 5,3%) и с сохранным уровнем экспрессии tmTNFa ^тТОТа > 5,3%) против опухолевых клеток НЕр-2 в МТТ-тесте; в — медианные (Ме) и диапазон 25—75% квартальных значений ^0— и0) продукции sTNFa/105 (пг/мл) в супернатантах ЛПС-стимулированных ИФН-ДК доноров (п = 8) и пациентов со злокачественными глиомами (п = 12).
Рис. 2. Влияние ТАР1-0 на цитотоксичность ЛПС-стимулированных ИФН-ДК больных злокачественными глиомами.
а — медианные (Ме) и диапазон 25—75% квартальных значений (LQ—UQ) относительного количества клеток, экспрессирующих tmTNFa; б — концентрации sTNFa/105ДК в супернатантах цельных культур и уровня цитотоксической активности (п = 5); в — интактных ЛПС-стимулированных и ТАР1-0-обработаных культурах ИФН-ДК больных злокачественными глиомами против опухолевых клеток НЕр-2 в МТТ-тесте.
ла, что ИФН-ДК больных при низком уровне экспрессии tmTNFa продуцировали более высокий уровень sTNFa по сравнению с ИФН-ДК доноров (p = 0,076). Однако корреляционный анализ не выявил связи между соотношением экспрессии tmTNFa и sTNFa в культурах ДК пациентов со злокачественными глиомами.
Проведенные нами ранее исследования показали, что супернатанты ИФН-ДК доноров не обладают киллерной активностью против клеток HEp-2 [14], что указывает на клеточно-контактный механизм цитотоксичности ИФН-ДК против клеток HEp-2 и ключевую роль tmTNFa в ее реализации. Это предположение подтверждено результатами множественного регрессионного анализа, который показал выраженную зависимость (коэффициент детерминации R2 79%, F-критерий 9,4, p = 0,02) цитотоксической активности ИФН-ДК больных злокачественными глиомами против клеток НЕр-2 от уровня экспрессии tmTNFa на ИФН-ДК (p = 0,009) и отсутствие таковой от продукции sTNFa (p = 0,59).
Добавление синтетического ингибитора TAPI-0, блокирующего активность TNFa-конвертирующего фермента (ТАСЕ), на этапе конечного созревания ДК совместно с ЛПС приводило к увеличению экспрессии tmTNFa на ИФН-ДК больных злокачественными глиомами (p = 0,043; рис. 2, а). При этом продукция sTNFa в культурах ИФН-ДК снижалась (p = 0,08; рис. 2, б). Повышение экспрессии tmTNFa, обусловленное действием TAPI-0, было ассоциировано с почти трехкратным увеличением цитотоксической активности ИФН-ДК против клеток HEp-2 (p = 0,068; рис. 2, в). Таким образом, изменение соотношения sTNFa и tmTNFa в сторону накопления на поверхности ДК tmTNFa за счет блокирования фермента ТАСЕ и, следовательно, снижения шеддинга tmTNFa позволяет усилить цитотоксический потенциал ИФН-ДК больных.
Ранее нами показано, что rIL-2 и dsDNA способны стимулировать цитотоксическую активность ИФН-ДК больных злокачественными глиомами против опу-
холевых клеток НЕр-2 [8]. Для выяснения возможных механизмов, опосредующих стимулирующий эффект г1Ь-2 и dsDNA на цитотоксичность ДК, проведено сравнительное исследование экспрессии 1шТПБа в культурах г1Ь-2- и dsDNA-модифицированных ИФН-ДК пациентов со злокачественными глиомами. Как видно из рис. 3, б, количество 1шТПБа+ ИФН-ДК (на уровне медианных значений) возрастало в присутствии г1Ь-2 до 6,0% (в 1,7 раза) и в присутствии dsDNA до 5,5% (в 1,6 раза), достигая донорских значений (6%).
Стимулирующий эффект г1Ь-2 на экспрессию tmTNFa в культурах ИФН-ДК наблюдался у большинства больных (в 83% случаев). При этом у половины (57%, 20/35) пациентов сниженная экспрессия tmTNFa восстанавливалась до нормативного уровня (>5,3%). Обработка ДК dsDNA усиливала экспрессию tmTNFa на ИФН-ДК у 77% пациентов и восстанавливала данный показатель до уровня нормы у 60% (15/25). Характерно, что между уровнем экспрессии tmTNFa и цитотоксической активностью dsDNA-обработанных ИФН-ДК выявлялась сильная и значимая корреляционная связь (г = 0,746, р = 0,0014), которая превосходила аналогичную зависимость в культурах г1Ь-2-стимулированных ДК (г = 0,475, р = 0,07).
В то же время добавление г1Ь-2 или dsDNA к ИФН-ДК не оказывало какого-либо значимого эффекта на уровень продукции ими sTNFa (рис. 3, в).
Чтобы оценить вклад TNFa в реализацию стимулирующего эффекта г1Ь-2 и dsDNA на цитотоксиче-скую активность ИФН-ДК больных против клеток НЕр-2, проведена серия экспериментов с использованием растворимого рецептора rhTNFR1, блокирующего TNFa/TNF-R1-сигнальный путь (рис. 4). Предварительная обработка dsDNA-модифицированных ДК молекулой rhTNFR1 снижала цитотоксическую активность ДК во всех случаях (5/5) в среднем на 34% (р = 0,04). В то же время добавление rhTNFR1 в культуры г1Ь2-модифицированных ДК пациентов со злокачественными глиомами не только не снижа-
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
%
60 -1 50 -40 30 -20 -100
а
р = 0,002
р = 0,004
ЛПС
ЛПС+ rlL-2
ЛПС+ dsDNA
10 -i 8 -
а с j
Li. о
z
H
E 4
Ч-"
2 -I 0
б
p = 0,0001
p = 0,00002
ЛПС ЛПС+ ЛПС+ rlL-2 dsDNA
пг/мл 3000 -i
4 2000
to
0
1 LL.
£ iooo 4
¡1 ¡1
1
ЛПС
ЛПС+ rlL-2
ЛПС+ dsDNA
Рис. 3. Влияние г1Ь-2 и dsDNA на экспрессию мембранной и растворимой форм TNFa в культурах ИФН-ДК больных злокачественными глиомами.
а — в виде медианных (Ме) и диапазона 25—75% квартальных значений (LQ—UQ) представлены данные цитотоксической активности ДК против клеток НЕр-2; б — экспрессии tmTNFa и в — продукции sTNFa/105ДК в культурах интактных ЛПС-стимулированных ИФН-ДК (ЛПС), гЫЬ-2-(ЛПС+rIL-2) и dsDNA-модифицированных (ЛПС+dsDNA) ИФН-ДК больных злокачественными глиомами.
ло цитотоксическую активность ДК, но оказывало стимулирующий эффект. Полученные данные свидетельствуют о том, что усиление цитотоксичности ДК больных глиомами под действием dsDNA действительно связано с повышением экспрессии tmTNFa, тогда как г1Ь-2, по-видимому, активирует иные сигнальные пути реализации противоопухолевой цито-токсической активности ДК.
Обсуждение
Дефект ДК как индукторов иммунного ответа при опухолевом росте — известный феномен, одна-
£2 о
ё
50 i
40 -
30 -
20 -
10 -
р = 0,04
ЛПС rlL-2 dsDNA rhTNFRI
+ +
+ +
+ +
+ +
Рис. 4. Влияние rhTNFR1 на цитотоксическую активность ИФН-ДК больных злокачественными глиомами против опухолевых клеток НЕр-2.
Представлены медианные (Ме) и диапазон 25—75% квартальных значений (LQ—UQ) цитотоксической активности (%) ЛПС-стимулированных интактных, г^-2- и dsDNA-модифицированных ИФН-ДК больных злокачественными глиомами против клеток линии НЕр-2 в 24-часовом МТТ-тесте в соотношении эффекторы/мишени 1:1. ДК предварительно инкубировали в течение 1 ч с rhTNFR1:Fc (10 мкг/мл).
ко эффекторные функции ДК в противоопухолевой резистентности остаются практически неисследованными. Ранее нами показано, что пациенты с вну-тримозговыми глиомами высокой степени злокачественности характеризуются слабой цитотоксической активностью ИФН-ДК против опухолевых клеток HEp-2 [8]. Поскольку лизис этих клеток осуществляется через TNFa/TNFa-Rl-сигнальный путь и требует клеточного контакта [8, 14], можно предположить, что цитотоксическая активность ИФН-ДК опосредуется tmTNFa и дефект цитотоксичности ИФН-ДК связан с низкой экспрессией tmTNFa.
Настоящее исследование продемонстрировало, что ИФН-ДК больных злокачественными глиомами действительно отличаются сниженной экспрессией tmTNFa. Низкий уровень tmTNFa на ИФН-ДК сочетается с выраженным усилением продукции sTNFa. При этом данные регрессионного анализа свидетельствуют о зависимости цитотоксической активности ИФН-ДК от экспрессии именно tmTNFa, а не sTNFa. В литературе имеются единичные сообщения о дефекте цитотоксической активности циркулирующих ДК при хроническом миелолейкозе, обусловленном низкой экспрессией молекул TRAIL и TNFa [15, 16]. Полученные нами результаты стали еще одним подтверждением нарушения TNFa-опосредованной кил-лерной активности ДК у пациентов со злокачественными опухолями.
Снижение количества tmTNFa+ДК у пациентов может быть обусловлено как нарушением экспрессии гена TNFa, так и регуляции TNFa на посттрансляционном уровне, в частности вследствие повышения активности фермента ТАСЕ, который обеспечивает превращение tmTNFa в sTNFa [17]. Известно, что ТАСЕ участвует в образовании лигандов, активирующих рецептор эпидермального ростового фактора (TNFa, TGFa, IL-6, L-селектин) и поддерживающих опухолевый рост и метастазирование [18—21]. Высокий уровень экспрессии ТАСЕ выявлен в различных опухолях и ассоциирован со стадией злокачественно-
сти [21—23]. Повышенная экспрессия данного фермента обнаружена также в опухолевых клетках при злокачественных глиомах и сопряжена с опухолевой прогрессией и плохим прогнозом [24].
Полученные нами данные позволяют предполагать, что изменения активности ТАСЕ при злокачественных глиомах происходят не только в опухолевых клетках, но и в клетках иммунной системы. Причем высокая активность ТАСЕ в ДК может также способствовать опухолевому росту, ингибируя цитотоксическую активность ДК через снижение экспрессии tmTNFa. Действительно, блокирование ТАСЕ в наших исследованиях с помощью ингибитора TAPI-0 приводило к увеличению экспрессии tmTNFa на ИФН-ДК больных и снижению продукции sTNFa. Важно отметить, что эти изменения сопровождались практически трехкратным увеличением цитотоксической активности ИФН-ДК против клеток HEp-2, что еще раз подтверждает роль tmTNFa в реализации цитотоксической функции ИФН-ДК против опухолевых клеток HEp-2.
В литературе имеются данные о том, что по сравнению с растворимой формой tmTNFa обладает более выраженной способностью индуцировать апоптоз опухолевых клеток [25, 26]. В отношении ДК показано, что созревание IL-4-индуцированных ДК сопровождается снижением экспрессии tmTNFa и повышением продукции sTNFa, что ассоциируется с более низкой ци-тотоксической активностью зрелых ДК по сравнению с незрелыми ДК [4]. С этой точки зрения наши результаты служат еще одним аргументом в пользу ведущей роли tmTNFa в реализации цитотоксического эффекта ДК против опухолевых клеток HEp-2.
Одним из важных разделов настоящего исследования стало изучение влияния rIL-2 и dsDNA на экспрессию tmTNFa на ИФН-ДК. Ранее нами показано, что rIL-2 и dsDNA усиливают цитотоксическую активность ИФН-ДК против клеток HEp-2 у больных злокачественными глиомами [8]. В настоящей работе мы продемонстрировали, что усиление цитотоксич-ности ДК в присутствии rIL-2 и dsDNA ассоциировалось с возрастанием экспрессии tmTNFa на ИФН-ДК больных и не было связано с изменением продукции sTNFa. Эти данные обосновывают возможность применения rIL-2 и dsDNA для коррекции нарушений ДК у пациентов со злокачественными глиомами. Стимулирующий эффект IL-2 на экспрессию mRNA TNFa, tmTNFa и продукцию sTNFa описан в отношении NK-клеток [27]. Миелоидные ДК экспрессируют высокоаффинную субъединицу рецептора IL-2, CD25 и также могут быть чувствительны к действию IL-2 [28]. В этом аспекте наши результаты не противоречат данным литературы и, более того, свидетельствуют о регулирующем влиянии IL-2 на TNFa-опосредованную цитотоксичность ДК. Рецепторы и сигнальные пути, опосредующие взаимодействия клеток с dsDNA, остаются во многом не исследованными. Тем не менее продемонстрировано, что dsDNA может индуцировать развитие мощного адаптивного противоопухолевого иммунного ответа через TLR-независимые сигнальные пути [29], приводящие к активации генов
ORIGINAL ARTICLE
провоспалительных цитокинов, в том числе и TNFa, и последующей их продукции [29, 30].
Тот факт, что взаимосвязь между экспрессией tmTNFa и цитотоксической активностью ДК была выраженной и достоверной в культурах dsDNA-обра-ботанных ДК, тогда как в культурах rIL-2-обработанных ДК проявлялась в виде тренда, может указывать на различную роль tmTNFa в реализации стимулирующего эффекта dsDNA и rIL-2 на цитотоксическую активность ДК. Действительно, блокирование tmTNFa растворимым рецептором rhTNFR1 подавляло ци-тотоксичность dsDNA-модифицированных ДК, но стимулировало цитотоксичность rIL-2-обработанных ДК. Полученные данные позволяют полагать, что стимулирующий эффект dsDNA на цитотоксическую активность ДК больных злокачественными глиомами действительно реализуется через усиление экспрессии tmTNFa с вовлечением TNFa/TNF-R1-пути, тогда как стимулирующий эффект rIL-2 может реализоваться через иные сигнальные пути, опосредующие цитотоксическую активность ДК. Причина усиления цитотоксической активности rIL-2-обработанных ДК в присутствии rhTNFR1, по-видимому, связана с тем, что tmTNFa может выступать в роли рецептора, проводящего сигнал внутрь tmTNFa-экспрессирующей клетки [31]. Подобный механизм описан для NK-клеток, престимуляция которых TNF-R1 в комбинации с IL-2 индуцирует экспрессию цитотоксических молекул (TRAIL, FasL, а также перфорина и гранзима В) и усиливает цитотоксическую активности NK-клеток против опухолевых клеток К562 [32]. Поскольку клетки НЕр-2 резистентны к цитотоксическим лигандам TRAIL и FasL [33, 34], увеличение их лизиса при обработке rIL-2-активированных ДК молекулой rhTNFR1 может быть связано с активацией перфорин/гранзим-ного механизма, однако эта гипотеза нуждается в дальнейшей проверке.
Последующие исследования в этом направлении позволят раскрыть причины нарушения противоопухолевой цитотоксической активности ДК при онкопа-тологии, а также охарактеризовать молекулярные мишени для направленной регуляции цитотоксической функции ДК. Большой интерес в этом плане представляет вопрос о чувствительности первичных глиаль-ных опухолевых клеток к цитотоксическому действию tmTNFa и значимости дефекта TNFa-опосредованной цитотоксичности в патогенезе внутримозговых глиом высокой степени злокачественности.
Проведенное исследование поддержано грантом РФФИ № 14-04-00446-а.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
литература (references)
1. Banchereau J., Steinman R.M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 1998; 392: 245—52. doi:10.1038/32588.
2. Janjic B.M., Lu G., Pimenov A., Whiteside T.L., Storkus W.J., Vujanovic N.L. Innate direct anticancer effector function of human immature dendritic cells. I. Involvement of an apoptosis-in-ducing pathway. J. Immunol. 2002; 168: 1823—30. doi:10.4049/ jimmunol.168.4.1823.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
3. Vanderheyde N., Vandenabeele P., Goldman M., Willems F. Distinct mechanisms are involved in tumoristatic and tumoricidal activities of monocyte-derived dendritic cells. Immunol. Lett. 2004; 91(2-3): 99—101. doi:10.1016/j.imlet.2003.11.011.
4. Lu G., Janjic B.M., Janjic J., Whiteside T.L., Storkus W.J., Vujanovic N.L. Innate direct anticancer effector function of human immature dendritic cells. II. Role of TNF, Lymphotoxin-a^2, Fas Ligand, and TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand. J. Immunol. 2002; 168: 1831—9. doi:10.4049/jimmunol.168.4.1831.
5. Kriegler M., Perez C., DeFay K., Albert I., Lu S.D. A novel form of TNF/cachectin is a cell surface cytotoxic transmembrane protein: Ramifications for the complex physiology of TNF. Cell. 1988; 53: 45—53. doi:10.1016/0092-8674(88)90486-2.
6. Vandenabeele P., Declercq W., Beyaert R., Fiers W. Two tumour necrosis factor receptors: structure and function. Trends Cell Biol. 1995; 5: 392—9. doi:10.1016/S0962-8924(00)89088-1.
7. Korthals M., Safaian N., Kronenwett R., Maihöfer D., Schott M., Papewalis C. et al. Monocyte derived dendritic cells generated by IFN-alpha acquire mature dendritic and natural killer cell properties as shown by gene expression analysis. J. Transl. Med. 2007; 5: 46. doi:10.1186/1479-5876-5-46.
8. Tyrinova T.V., Leplina O.Y., Mishinov S.V., Tikhonova M.A., Shevela E.Y., Stupak V.V. et al. Cytotoxic activity of ex-vivo generated IFNa-induced monocyte-derived dendritic cells in brain glioma patients. Cell. Immunol. 2013; 284: 146—53. doi:10.1016/j. cellimm.2013.07.013.
9. Ostrom Q.T., Gittleman H., Liao P., Rouse C., Chen Y., Dowling J. et al. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007—2011. Neuro Oncol. 2014; Suppl. 4: iv1—63. doi:10.1093/neuonc/nou223.
10. Stupp R., Hegi M.E., Mason W.P., van den Bent M.J., Taphoorn M.J., Janzer R.C. et al. Effects of radiotherapy with concomitant and adjuvant temozolomide versus radiotherapy alone on survival in glioblastoma in a randomised phase III study: 5-year analysis of the EORTC-NCIC trial. Lancet Oncol. 2009; 10: 459—66. doi:10.1016/ S1470-2045(09)70025-7.
11. Finocchiaro G., Pellegatta S. Immunotherapy with dendritic cells loaded with glioblastoma stem cells: from preclinical to clinical studies. Cancer Immunol. Immunother. 2016; 65: 101—9. doi:10.1007/ s00262-015-1754-9.
12. Lasky J.L., Panosyan E.H., Plant A., Davidson T., Yong W.H., Prins R.M. et al. Autologous tumor lysate-pulsed dendritic cell immu-notherapy for pediatric patients with newly diagnosed or recurrent high-grade gliomas. Anticancer Res. 2013; 33: 2047—56. PMID: 23645755.
13. Sampson J.H., Mitchell D.A. Vaccination strategies for neuro-oncology. Neuro Oncol. 2015; Suppl 7: vii15—25. doi:10.1093/neuonc/nov159.
14. Leplina O., Tyrinova T., Tikhonova M., Shevela E., Stupak V., Mishinov S. et al. Direct antitumor activity of interferon-induced dendritic cells of healthy donors and patients with primary brain tumors. In: Dr. Ghosh A. (Ed.). Glioma — Explor. Its Biol. Pract. Relev. InTech; 2011. doi:10.5772/23784.
15. Hira S.K., Mondal I., Bhattacharya D., Manna P.P. Downregula-tion of endogenous STAT3 augments tumoricidal activity of inter-leukin 15 activated dendritic cell against lymphoma and leukemia via TRAIL. Exp. Cell Res. 2014; 327: 192—208. doi:10.1016/j. yexcr.2014.08.012.
16. Hira S.K., Mondal I., Bhattacharya D., Gupta K.K., Manna P.P. Downregulation of STAT3 phosphorylation enhances tumoricidal effect of IL-15-activated dendritic cell against doxorubicin-resistant lymphoma and leukemia via TNF-a. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 2015; 67: 1—13. doi:10.1016/j.biocel.2015.08.002.
17. Black R.A., Rauch C.T., Kozlosky C.J., Peschon J.J., Slack J.L., Wolfson M.F. et al. A metalloproteinase disintegrin that releases tumour-necrosis factor-a from cells. Nature. 1997; 385: 729—33. doi:10.1038/385729a0.
18. Katakowski M., Jiang F., Zheng X., Gutierrez J.A., Szalad A., Chopp M. Tumorigenicity of cortical astrocyte cell line induced by the protease ADAM17. Cancer Sci. 2009; 100: 1597—604. doi:10.1111/ j.1349-7006.2009.01221.x.
19. Scheller J., Chalaris A., Garbers C., Rose-John S. ADAM17: a molecular switch to control inflammation and tissue regeneration. Trends Immunol. 2011; 32: 380—7. doi:10.1016/j.it.2011.05.005.
20. Zheng X., Jiang F., Katakowski M., Lu Y., Chopp M. ADAM17 promotes glioma cell malignant phenotype. Mol. Carcinog. 2012; 51: 150—64. doi:10.1002/mc.20772.
21. Borrell-Pages M., Rojo F., Albanell J., Baselga J., Arribas J. TACE is required for the activation of the EGFR by TGF-alpha in tumors. EMBO J. 2003; 22: 1114—24. doi:10.1093/emboj/cdg111.
22. McGowan P.M., Ryan B.M., Hill A.D.K., McDermott E., O'Higgins N., Duffy M.J. ADAM-17 expression in breast cancer correlates with Vvariables of tumor progression. Clin. Cancer Res. 2007; 13: 2335—43. doi:10.1158/1078-0432.CCR-06-2092.
23. Kornfeld J.-W., Meder S., Wohlberg M., Friedrich R.E., Rau T., Riethdorf L. et al. Overexpression of TACE and TIMP3 mRNA in head and neck cancer: association with tumour development and progression. Br. J. Cancer. 2011; 104: 138—45. doi:10.1038/sj.bjc.6606017.
24. Wu B., Sha L., Wang Y., Xu W., Yu Y., Feng F. et al. Diagnostic and prognostic value of a disintegrin and metalloproteinase-17 in patients with gliomas. Oncol. Lett. 2014; 8: 2616—20. doi:10.3892/ ol.2014.2582.
25. Gruss H.-J. Molecular, structural, and biological characteristics of the tumor necrosis factor ligand superfamily. Int. J. Clin. Lab. Res. 1996; 26: 143—59. doi:10.1007/BF02592977.
26. Luettig B., Decker T., Lohmann-Matthes M.L. Evidence for the existence of two forms of membrane tumor necrosis factor: an integral protein and a molecule attached to its receptor. J. Immunol. 1989; 143: 4034—8.
27. Caron G., Delneste Y., Aubry J.-P., Magistrelli G., Herbault N., Blaecke A. et al. Human NK cells constitutively express membrane TNF-a (mTNFa) and present mTNFa-dependent cytotoxic activity. Eur. J. Immunol. 1999; 29: 3588—95. doi:10.1002/(SICI)1521-4141(199911)29:11<3588::AID-IMMU3588>3.0.CO;2-O.
28. Sanarico N., Ciaramella A., Sacchi A., Bernasconi D., Boss@й P., Mariani F. et al. Human monocyte-derived dendritic cells differentiated in the presence of IL-2 produce proinflammatory cytokines and prime Th1 immune response. J. Leukoc. Biol. 2006; 80: 555—62. doi:10.1189/jlb.1105690.
29. Coban C., Koyama S., Takeshita F., Akira S., Ishii K.J. Molecular and cellular mechanisms of DNA vaccines. Hum. Vaccin. 2008; 4: 453—7. doi:10.4161/hv.4.6.6200.
30. Ishii K.J., Akira S. Innate immune recognition of, and regulation by, DNA. Trends Immunol. 2006; 27: 525—32. doi:10.1016/j. it.2006.09.002.
31. Eissner G., Kolch W., Scheurich P.. Ligands working as receptors: reverse signaling by members of the TNF superfamily enhance the plasticity of the immune system. Cytokine Growth Factor Rev. 2004; 15: 353—66. doi:10.1016/j.cytogfr.2004.03.011.
32. Yu M., Shi W., Zhang J., Niu L., Chen Q., Yan D. et al. Influence of reverse signaling via membrane TNF-a on cytotoxicity of NK92 cells. Eur. J. Cell Biol. 2009; 88: 181—91. doi:10.1016/j. ejcb.2008.09.001.
33. Jiang M., Liu Z., Xiang Y., Ma H., Liu S., Liu Y. et al. Synergistic antitumor effect of AAV-mediated TRAIL expression combined with cisplatin on head and neck squamous cell carcinoma. BMC Cancer. 2011; 11: 54. doi:10.1186/1471-2407-11-54.
34. Morton E.R., Blaho J.A. Herpes simplex virus blocks Fas-mediated apoptosis independent of viral activation of NF-kB in human epithelial HEp-2 cells. J. Interferon Cytokine Res. 2007; 27: 365—76. doi:10.1089/jir.2006.0143.
Поступила 11.05.16 Принята в печать 07.06.16
